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1 现代遗传学丛书 林木遗传图谱构建和 Q T L 定位统计分析 施季森童春发著 北京

2 内容简介本书包括绪论 上篇和下篇, 首次较系统 详细 全面地整理和介绍了近交群体 ( 如回交群体 F2 代群体等 ) 的遗传图谱的构建和 QTL 定位的统计分析模型以及相关的数学方法 同时, 针对目前林木高密度分子遗传图谱的构建和 QTL 精确定位的需要, 着重研究了全同胞群体遗传图谱的构建和 QTL 定位的统计模型 本书紧扣遗传图谱构建和 QTL 定位的前沿研究展开, 结构严密, 理论性强, 在内容安排上考虑到了读者使用的实用性和方便性 本书适合从事动植物育种的科技工作者 相关专业的本科高年级学生和研究生阅读参考 图书在版编目 (CIP) 数据林木遗传图谱构建和 QTL 定位统计分析 / 施季森, 童春发著. 北京 : 科学出版社,2006 ( 现代遗传学丛书 ) ISBN 7 唱 03 唱 唱 4 Ⅰ 畅林 Ⅱ 畅 1 施 2 童 Ⅲ 畅树木学 : 遗传学 Ⅳ 畅 ST18 畅 46 中国版本图书馆 CIP 数据核字 (2005) 第 号责任编辑 : 莫结胜卜新 / 责任校对 : 陈丽珠责任印制 : 钱玉芬 / 封面设计 : 王浩 北京东黄城根北街 16 号邮政编码 : http :// w w w.sciencep.co m 出版 印刷 科学出版社发行各地新华书店经销 倡 2006 年 1 月第一版 开本 : / 年 1 月第一次印刷 印张 : 10 1/2 印数 : 字数 : 定价 :32 畅 00 元 ( 如有印装质量问题, 我社负责调换枙科印枛 )

3 前 言 随着分子生物技术的迅速发展, 人们能够获得多种多样的 DNA 分子标记, 利用这些分子标记, 已经构建了多种生物的分子遗传图谱 遗传图谱是系统进行基因组研究的基础, 是在分子基础上进行动植物育种和人类遗传疾病诊断的依据 十多年来, 林木遗传图谱的构建和数量性状基因座定位的研究进展非常迅速 但是, 目前林木遗传图谱构建和数量性状基因座定位的统计理论方法都是套用为近交群体而建立的作图理论, 这使得林木遗传图谱构建和数量性状基因座定位存在着诸如遗传图谱比较稀疏 数量性状基因座定位不太精确等许多问题 林木具有很多自身特有的复杂生物学特性, 如生长周期漫长 异花授粉 具有很高的遗传杂合度等, 因此必须研究和发展适合林木的遗传图谱构建和数量性状基因座定位的统计分析理论, 本书正是基于这一点而产生的 本书取材于作者所在课题组的最新研究成果和国内外期刊上最近发表的文献 全书分上 下两篇, 共 8 章, 首次较系统 详细 全面地整理和介绍了近交群体 ( 如回交群体 F 2 代群体等 ) 的遗传图谱的构建和数量性状基因座定位的统计分析模型以及相关的数学方法 同时, 针对目前林木高密度分子遗传图谱的构建和数量性状基因座精确定位的需要, 着重研究了全同胞群体遗传图谱的构建和数量性状基因座定位的统计模型 上篇主要介绍和研究遗传连锁图谱构建的统计分析方法, 包括不同作图群体的两点连锁分析 连锁群的划分 标记位点的排序和多位点的连锁分析等内容, 提出了基因位点排序的启发式搜索法和全同胞群体的多位点连锁分析的隐马尔可夫链方法, 为利用林木的 F1 代构建高密度遗传图谱奠定了理论基础 最后, 修订了杉木的遗传连锁图谱, 结果比用拟测交法增加了 54 个标记 下篇主要介绍了近交群体数量性状基因座定位的单标记分析 区间作图 复合区间作图等方法, 同时还研究了异交群体的数量性状基因座定位方法 针对目前林木上所用的 F1 代作图群体, 考虑 1 1 分离位点的连锁相信息, 提出了林木 F1 代群体数量性状基因座区间作图和复合区间作图法, 并利用新构建的杉木 AFLP 分子标记遗传连锁图谱对杉木的 16 个数量性状进行了数量性状基因座定位 本书虽然以林木的 F1 代群体为背景论述遗传图谱的构建和数量性状基因座定位的统计方法, 但是也包含了用近交系所产生的作图群体进行图谱的构建和数量性状基因座定位的统计方法 同时, 本书的统计分析方法也适用于其他异交植物的全同胞群体的遗传图谱的构建和数量性状基因座定位 我们编写了全同胞遗传连锁图谱构建的应用软件 FsLinkageMap 1 畅 0, 附录 A 中给出了此软件的使用说明 本书成稿过程中, 得到王明庥院士 黄敏仁教授等许多师长的支持和帮助 ; 盖钧镒院士 莫惠栋教授 章元明教授审阅了初稿全文, 提出了许多重要建议 ; 科学出版社莫结胜 卜新等编辑对本书的出版审校付出了大量辛勤的劳动 ; 本书使用国家 973 林木育种分子基础研究第四课题 江苏省 六大人才高峰 资助课题 江苏省自然基金 杉木 杨树功能基 i

4 因组 课题 江苏省基础研究计划项目 (BK ) 的部分资金 在此, 一并表示诚挚的谢意 该领域尚处于起步和发展阶段, 新发现 新思想和新问题并存, 加之著者学术水平有限, 敬请读者批评指正 著者二 五年十一月于南京 ii

5 目 录 前言 绪论 1 0 畅 1 林木遗传图谱构建研究的现状 1 0 畅 2 QTL 定位统计方法的研究进展 数量遗传学的发展历史 近交群体的 Q T L 作图方法 6 0 畅 2.3 异交群体的 Q T L 作图方法 7 0 畅 2.4 林木 Q T L 作图 9 上篇遗传图谱构建的统计方法 第 1 章背景知识和基本概念 遗传背景 减数分裂 重组 干扰和遗传距离 作图函数 实验交配群体 回交群体 F 2 群体 极大似然法与似然比检验 EM 算法 皮尔逊卡方统计量 显著性检验 分子标记数据和表型数据 22 第 2 章两点连锁分析 位点的分离检验 单位点的分离检验 两个位点的连锁检验 近交系两点连锁分析 回交群体 F 2 群体 全同胞家系两位点连锁分析 全同胞家系标记分离特征 连锁相推断及重组率估计 37 第 3 章多位点连锁分析 57 iii

6 3.1 隐马尔可夫模型 观测数据的概率 重建隐状态 参数估计 回交群体数据 F2 群体数据 全同胞数据 65 第 4 章连锁群划分和基因位点排序 连锁群的划分 三位点排序 多位点排序 多位点排序的目标函数 多位点排序的计算方法 模拟构建全同胞群体的遗传连锁图谱 杉木遗传图谱的构建 82 下篇 QTL 定位的统计方法 第 5 章 Q T L 单标记分析 回交群体的单标记分析 t 检验 方差分析 线性回归模型 极大似然法 F2 群体的单标记分析 t 检验 方差分析 回归分析 极大似然法 102 第 6 章 Q T L 区间作图法 QTL 基因型的条件概率 极大似然法 回交群体 F 2 代群体 线性回归法 回交群体 F 2 代群体 118 第 7 章复合区间作图 理论基础 回交群体作图 125 iv

7 7.3 F2 群体作图 128 第 8 章异交群体的 Q T L 作图 半同胞群体 QTL 作图 AN O V A 方法 极大似然法 全同胞群体 QTL 作图 MCMC 作图 Gibbs 抽样 M etropolis 唱 Hastings 方法 M C M C 方法作图 林木 F1 代群体的 QTL 作图 区间作图和复合区间作图 杉木 F 1 代群体的 Q T L 作图 讨论 151 主要参考文献 152 附录 A 全同胞遗传连锁图谱构建软件 FsLinkageMap 1.0 使用说明 159 A1 数据格式 159 A2 数据分析 159 A3 遗传连锁图谱的绘制 162 v

8 绪 论 遗传连锁分析是指将染色体上的基因位点进行排序并估计它们之间的遗传距离, 而遗传距离则是依据统计规律确定的 (Ott,1999) 20 世纪初,Bateson 和 Punnet 在豌豆试验中发现了基因的连锁现象 后来,Morgan(1911) 在果蝇试验中也发现了这一现象, Sturtevant 于 1913 年发表了第一篇有关基因图谱的论文 自从 1980 年以来, 分子遗传学和相关的技术已经变得越来越重要 1990 年 10 月美国启动了令人瞩目的人类基因组计划 (HGP), 随后对生物基因图谱 基因组测序的研究成为了当代遗传学研究的热点之一 2000 年 6 月 26 日, 美 英 日 法 德 中同时宣布人类基因组工作框架图构建完成, 随后于 2001 年 2 月 12 日首次公布了人类基因组图谱及初步分析结果 2003 年初,HGP 宣布已完成了人类结构基因组的研究 除了人类基因组测序已完成之外, 国际上还先后完成了大肠杆菌 (Blattner et al.,1997) 酵母 (Cherry et al.,1998) 果蝇 (Adams et al.,2000) 秀丽线虫 (Hodgkin et al., 1998) 小鼠 (Copeland, 1993) 和拟南芥 (Wambutt,2000) 等生物的测序工作 2002 年 4 月, 中国科学家宣告水稻全基因组测序工作已经完成, 标志着我国水稻基因组研究已处于世界前列 (Yu et al., 2002) 重组 DNA 技术的出现使得几乎所有的生物学学科都被带入了分子生物学的大门, 在遗传学领域最重大的进展之一就是利用 DNA 分子水平上的变异作为遗传标记进行遗传作图 1980 年,Botstein 首先提出了利用 RFLP 标记构建遗传图谱的设想 1987 年, Donis 唱 Keller 等发表了第一张人类的 RFLP 连锁图, 其饱和度远远超过了经典的图谱, 之后许多生物的 RFLP 图谱相继问世 随着新的 DNA 标记技术的发展, 很多生物都已构建了遗传图谱, 图谱上标记的密度也越来越高 在植物中, 已建立的遗传图谱有大麦 (Ramsay et al., 2000) 小麦 ( Marion et al., 1998 ) 燕麦 ( Yu et al., 2000 ) 水稻 (Harushimay et al.,1998) 玉米 (Wilson et al., 1999) 大豆 (Matthews et al., 2001) 番茄和马铃薯 (Tanksley et al., 1992) 等 在动物中, 已建立的遗传图谱有小鼠 (Blake et al.,2000) 和家鼠 (Steen et al.,1999), 还有猪 马 牛 羊 鸡等家畜和家禽, 甚至还有家蚕 (Tan et al.,2001) 最新的人类高密度遗传图谱是 Kong 等 (2002) 建立的 值得一提的是, 过去被公认为难以开展遗传作图的木本植物, 如松类 杨树 杉木 苹果 桃 茶树 桑树等, 如今也涌现出了许多密度可观的分子标记连锁图 利用遗传图谱和分子标记可以寻找控制有关性状的基因, 这在人类疾病研究中已获得了显著的成就 寻找控制数量性状基因座 (quantitative trait locus, Q T L) 虽然比较困难, 但是 20 多年来也进行了大量研究 0 畅 1 林木遗传图谱构建研究的现状 林木遗传连锁图谱构建研究最早从火炬松开始, 使用的是同工酶标记, 但只对部分基因组进行了作图 直到出现了以 DNA 为基础的分子标记, 如 RFLP 和, 构建全部 1

9 基因组的遗传图谱成为可能 林木由于受自身生物学特性的限制, 在利用分子标记构建遗传图谱方面滞后于农作物 10 多年, 但林木遗传图谱研究进展却非常迅速, 仅在几年时间内, 就已在 30 多个树种中进行了图谱的构建工作 ( 表 0 畅 1) 其中, 以利用 标记技术构图的居多, 占 90 % 左右 主要针叶树种有湿地松 土耳其松 糖松 长叶松 海岸松 欧洲赤松 北美乔松 长叶松 欧洲云杉 白云杉 短叶红豆杉 花旗松等, 阔叶树种主要有巨桉 尾叶桉等, 而有一些树种如火炬松 辐射松 光亮桉 毛果杨 美洲黑杨 欧洲山杨等是利用多种标记联合构建图谱的 在现有林木遗传图谱中, 具有标记数量最多的图谱是毛果杨 美洲黑杨, 标记达 343 个 ; 最少的是短叶红豆杉, 仅有 41 个 图谱总图距最长的是欧洲云杉, 达 3584cM ; 最短的仍是短叶红豆杉, 达 305 畅 8cM 随着林木遗传图谱构建研究的不断深入, 现已开始利用图谱对控制重要质量性状和数量性状的基因进行定位和分离研究, 进行分子标记辅助选择育种, 这些将使林木遗传育种研究进入一个崭新阶段 ( 尹佟明等,2000) 表 0.1 林木遗传图谱构建现状一览表 Table 0.1 List of current genetic maps in forestry trees 树名作图群体遗传标记作图状况文献 白云杉 ( Picea glauca) 单倍体胚乳 共产生 61 个标记, 其中 47 个被分配到 12 个连锁群中, 覆盖基因组 873 畅 8 cm Lomas et al., 1992 板栗 ( Castanea olisima) 回交二代体 形态标记 同工酶 RFLP 共得到 249 个多态性标记, 有 197 个分配到 12 个连锁群上, 其余标记未见连锁, 覆盖基因组 660 畅 9 cm Kubisiak et al., 1996 巨尾桉 ( Eucalyptus grandis E. urophylla) 拟测交群体 巨桉有 240 个标记分配到 14 个连锁群中 (1552 cm) ; 尾叶桉 : 有 251 个标记分配到 11 个连锁群中 (1101 cm) Grattapaglia al.,1994 et 火炬松 ( Pinus taeda) 4 株亲本 2 株 F 1 代及 95 株 F 2 子代 同工酶 RFLP 共产生 90 个 R FL P 标记位点, 有 73 个 RFL P 标记和 2 个同工酶标记分配到 20 个 连锁群中, 覆盖基因组 632 cm Devey et al., 1994 响叶杨 ( Populus adenopoda M.) 银白杨 ( Populus alba L.) 80 株 F 1 代 响叶杨图谱上有 82 个标记, 分配在 19 个连锁群中, 总遗传跨度为 553 cm ; 银白杨图谱上有 197 个标记, 遗传跨度为 2300 cm, 覆盖基因组 87 % Yin et al., 2001 ; 尹佟明 等,1999 美洲黑杨 ( Pop ulus 产生 20 个连锁群, 总图距为 1899 畅 4 cm, 覆 deltoids) 青杨 F 2 群体 盖基因组总长度 70 畅 35 %, 平均间距为 苏晓华等,1998 ( Populus cathyana) 17 畅 27 cm 毛果杨 ( Populus trichoccar pa) F 2 群体 美洲黑杨 ( Populus deltoids) RFLP S T S 产生 19 个连锁群, 覆盖长度为 1527 畅 3 cm, 约占基因组总长度的一半, 平均作图距离为 6 畅 7 cm Bradshaw et al.,

10 树名作图群体遗传标记作图状况文献 续表 橡胶 ( Hevae brasiliensis) F 2 子代 同工酶 RFLP 共产生 111 个标记位点 (4 个同工酶 92 个 RFL P 和 15 个 ), 分配到 23 个连锁群 中, 有 20 个标记未见连锁 Seguin et al., 1995 银杏 ( Ginkgo biloba) 单倍体胚乳 共得到 91 个标记, 其中 62 个被分配到 20 个连锁群中, 共覆盖基因组 829 畅 1cM 谭晓凤等,1998 柑橘 ( Citrus sinensis) 回交一代群体 同工酶 RFLP 群体 1 :52 个标记被分配到 11 个连锁群中, 作图距离 553cM 群体 2 :32 个标记被分配 到 8 个连锁群中, 作图距离 314cM Durham et al., 1992 苹果 ( M alus pu mila) 拟测交群体 同工酶 RFLP 产生两个连锁图 : 一个有 233 个标记,24 个 连锁群 ; 一个产生 350 个标记, 分配到 21 个 连锁群中 Weeden et al., 1995 葡萄 ( V itis v ini fera) 2 个种间杂交 群体的 4 个亲 本 同工酶 RFLP 4 张图谱的标记数为 182 ~ 225, 有 3 个亲本 检测到 19 个连锁群, 第 4 个亲本检测到 20 个连锁群, 作图距离从 1059 ~ 1477 cm Reisch et al., 1996 长叶松 ( Pinus palustris) 88 颗胚乳和 86 株 F 1 代 单倍体胚乳产生 137 个标记, 有 75 个标记 在 F 1 中能检测到, 其中 49 个标记被分离 Kubisiak et al., 1995 湿地松 ( Pinus elliottii) 一单株上 68 颗胚乳 共产生 73 个 标记, 分配到 13 个连锁 群和 9 个连锁对中, 覆盖基因组 782 cm Nelson et al., 1993 南欧海松 ( Pinus pinaster) F 1 单株 共产生 463 个标记, 分配到 12 个较大连锁 群和 9 个较小连锁群中, 覆盖基因组 1860 cm, 平均图距为 8 畅 3 cm Plomion et al., 1995 欧洲赤松 ( Pinus sylvestric) 单倍体胚乳 共产生 261 个 标记, 分配到 14 个连锁群中, 覆盖基因组 2638 畅 6 cm Yazdani et al., 1995 薄皮果松 ( Pinus edulis) 一单株上的 40 颗胚乳 AFL P 338 个标记分配到 25 个连锁群中, 覆盖基因组 2012cM, 平均图距为 8 畅 0 cm T ravis et al., 1998 欧洲云杉 ( Picea abies) 一单株上的 72 颗胚乳 共产生 96 个标记, 解释 185 个 D N A 多态性, 被分配到 17 个连锁群中, 覆盖基因组 3584 cm, 平均图距为 22 cm Binelli et al., 号树产生 56 个标记,35 个分配到 9 个连 土耳其红松 ( Pinus brutia) 4 株单株上各采集 30 颗胚乳, 分别对单株作图 锁群中, 覆盖 661 畅 8 cm ;2 号树产生 44 个标记,27 个分配到 10 个连锁群中, 覆盖 465 畅 4 cm ;3 号树产生 52 个标记,32 个分配到 13 个连锁群中, 覆盖 555 畅 2 cm ;4 号树产生 27 个标记,13 个分配到 6 个连锁群中, 覆盖 Kaya et al., 畅 9 cm 3

11 树名作图群体遗传标记作图状况文献 续表 日本柳杉 ( C ryp tomeria japonica) 2 株亲本 F 1 代, 73 株 F 2 子代 同工酶 RFLP 共产生 164 个标记, 145 个分配到 20 个连 锁群中, 覆盖基因组 887 畅 3 cm M ukai et al., 1995 日本柳杉 ( C ryp tomeria japonica) F 1 AFL P CAPS 母本和父本两品种的连锁图上分别有 91 和 132 个标记, 相应分配在 19 和 23 个连锁群上, 跨度为 1266 畅 1 cm 和 1992 畅 3 cm, 占基因组的 50 % 和 80 % Nikaido et al., 2000 花旗松 ( Pseudotsuga men z iesti) 48 株 F 2 子代 RFLP 共产生 266 个 RFLP 标记, 其中 208 个分配 到 17 个连锁群中, 覆盖基因组 1075 cm Krutovskii al.,1995 et 乌饭树 38 株测交子 ( V acciniu m dar ro w i) 代 共产生 89 个 标记, 其中 72 个分配到 12 个连锁群中, 覆盖基因组 950 cm, 平均图 距为 16 cm Ro wland et al., 1994 红豆杉 ( Taxus brevifolia) 一单株的 39 个胚乳 共产生 102 个 标记, 其中 41 个分配 到 17 个连锁群中, 覆盖基因组 305 畅 8cM Gocmen et al., 1996 油棕 ( Elaeis guineensis) F 1 群体 用 50 个经过筛选的引物共产生 75 个标记, 其中 61 个分配到 14 个连锁群中 M oretzsohn al., 1997 et 桃树 ( Prunus parsica) 71 株 F 2 子代 形态标记 RFLP 共产生 65 个标记 ( 46 个 R FL P,12 个,7 个形态标记 ), 有 47 个连锁到 8 个 连锁群中, 覆盖基因组 332 cm Abbott et al., 1995 蓝桉 ( Eucalyptus globules) 细叶桉 ( Eucalyp tus tereticornis) 拟测交群体 AFL P 蓝桉 :200 个标记分配到 16 个连锁群, 总图 距为 967 cm 细叶桉 :268 个标记分配到 14 个连锁群, 总图距为 919 cm M arques et al., 1997 ; M arques et al., 1998 可可 ( Theobroma cocao) 100 株 F 1 代 同工酶 RFLP 产生 193 个标记, 其中 190 个分配到 10 个 连锁群中, 作图距离为 759 cm Clamau et al., 1995 得到一张整合的连锁图谱,219 个 RFL P 和 马占相思 ( Acacia mangiu m) F 1 RFLP 微卫星 33 个微卫星标记, 分配在 13 个连锁群上, 覆 盖基因组的 966 cm 最大的连锁群为 103 Butcher et al., 2000 cm, 最小的为 23 cm 蓝桉 ( Eucalyptus globules) F 1 同工酶 微卫星 RFLP ES T 通过 98 个共线性的位点整合为一张图谱 包括 249 个标记, 总长度为 1375 cm, 平均长 度约为 5 畅 5 cm T hamarus al.,2001 et 4

12 树名作图群体遗传标记作图状况文献 续表 欧洲栗 ( Castanea sativa M ill.) F 1 同工酶 ISSR 共有 381 个标记被分配到连锁图上, 其中母 本和父本分别有 187 和 148 个, 分别覆盖基 因组长度 720 cm 和 721 cm Casasoli et al., 2001 有 157 个 AFL P 和 50 个 标记, 覆盖 日本黑松 71 个大配子 AFL P 基因组长度 2085 畅 5 cm, 约占总长度的 Hayashi et al., ( Pinus thunbergii) 体的群体 77 畅 1 % ~ 78 畅 4 %, 标记间平均长度为 10 畅 cm 尾叶桉连锁图包括 16 个连锁群, 包含 129 尾叶桉 ( E ucalyptus 个框架标记和 65 个侧连标记, 总图距为 u rophylla) 细叶桉 ( Eucalyp tus F 1 代的 82 个 个体 1741 畅 3 cm, 对基因组的覆盖率为 91 畅 0 % ; 细叶桉连锁图也包括 16 个连锁群, 包含 96 甘四明等,1999 tereticornis) 个框架标记和 43 个侧连标记, 总图距为 992 畅 1 cm, 对基因组的覆盖率为 81 畅 8 % 杉木 ( Cunningha mia lanceolata) F 1 代的 88 个 个体 母本连锁图谱包括 11 个连锁群, 总图距为 1132 畅 2 cm ; 父本连锁图也包括 11 个连锁 群, 遗传跨度为 1057 畅 8 cm 郎亚琴等,2000 马尾松 ( Pinus massoniana Lamb.) 66 个胚乳 包括 13 个连锁群,48 个标记位点, 覆盖基因 组 692 畅 5 cm 尹佟明等, 畅 2 QTL 定位统计方法的研究进展 0 畅 2 畅 1 数量遗传学的发展历史 20 世纪初数量遗传学作为一门独立的学科而产生, 研究实验群体或自然群体的数量性状的遗传变异 它主要研究两个基本问题 :1 总的表型变异中有多少比例属于遗传的影响 ;2 有多少遗传因子参与这种遗传变异 (Wu et al.,1999) 1909 年 Johannsen 提出的遗传力概念可以反映遗传因子对表型变异的贡献 利用亲属间的相关性, 如父母间 全同胞间或半同胞间的相关性 (Fisher,1918 ;Cockerham,1954), 研究者能够估计出遗传力的大小 现在已有大量的有关数量性状遗传力估计的报道, 所涉及的生物体从微生物到植物 动物甚至到人类自身 (Lynch and Walsh, 1998) 这些估计在决定适当的育种计划以及在说明生物性状的表型进化中都起着极其重要的作用 虽然已经为估计影响一个数量性状的基因数目的研究付出了巨大的努力, 但是它们不能完美地解释数量变异的本质 Wright(1921) 首次提出了估计基因数目的方法, 这种方法是基于双亲和它们的 F2 代或回交子代之间的差异 由于 Wright 的方法只涉及一些简单的假设, 如所有位点均具有加性效应 显性效应 非连锁和等效性, 因此它从一开始就受到批评, 随后得到改进 (Comstock and Enfield,1981 ;Lande,1981 ;Cockerham,1986 ; Zeng,1992 ;Wu,1996) 5

13 Wright 的方法没有能够得到很好的应用, 究其原因是多方面的 其中一个最重要的原因, 就是没有能够将基因间复杂的关系考虑进去 几乎与 Wright 方法同时出现的, 是 1923 年 Sax 运用孟德尔的遗传定律把数量的变异分解成单因子的方法 Sax 的方法是当今 Q T L 作图方法的原始模型, 但是这一方法在 Sax 时代没有能够得到很好的发展, 这是因为当时没有足够多的所谓标记来分离数量性状 ( Thoday,1961) 随着当今分子生物学的发展, 基于 PCR 的生物技术几乎能提供无限多数目的 DNA 多态性标记, 这些标记可用于构建遗传图谱, 进而可研究和确定生物上 医学上和农业上重要数量性状的位点 在过去的十多年中, 人们已提出了很多的使用分子标记进行 Q T L 定位的统计方法 在植物中,Q T L 作图的方法一般基于起始于两个近交系杂交后的 F 2 代和回交子代等群体 在动物中, 尤其是家畜中, 现已发展了许多 Q T L 作图方法, 由于动物作图群体一般为异交群体, 其 Q T L 作图的统计方法比较复杂 林木有其自身特有的复杂的生物学特性, 如生长周期长 遗传负荷高 一些树种有自交不亲和或近交衰退的现象, 因此到目前为止, 还没有建立比较好的针对林木的 Q T L 作图方法, 现在林木的 Q T L 作图方法一般都借鉴近交群体的 Q T L 作图方法 ( Groover et al.,1994 ;Bradshaw and Stettler,1995 ; Grattapaglia et al.,1995,1996 ;Wu,1998) 0 畅 2 畅 2 近交群体的 QTL 作图方法 利用两个极端的纯系作为亲本进行杂交产生 F1 代, 然后进行自交或回交产生 F2 代或 BC 等群体, 应用这些群体和遗传连锁图谱可进行 Q T L 定位分析 现已发展了不少比较成熟的统计分析方法, 常见的有单标记分析法 区间作图法和复合区间作图法等 0 畅 2 畅 2 畅 1 单标记分析法单标记分析法检测一个标记的位点是否与某个 Q T L 间存在着连锁关系 一般通过方差分析 回归分析或似然比检验比较不同标记基因型数量均值的差异 如果差异显著, 那么说明 Q T L 与该标记有连锁 由于单标记分析法不需要完整的连锁图谱, 因而早期的定位研究多采用这种方法 (Soller et al.,1976 ;Weller,1986 ;Edwards et al.,1987 ;Stuber et al.,1987 ;Tanksley et al.,1982 ;Luo and Kearsey,1989) 单标记分析法存在许多缺点 (Lander and Botstein,1989) :1 不能确定标记与多少个 Q T L 连锁 ;2 无法确切估计 Q T L 的位置 ;3 由于遗传效应与重组率混合在一起, 导致低估了 Q T L 的遗传效应 ;4 容易出现假阳性 ;5 检测效率不高, 需要较多的个体 0 畅 2 畅 2 畅 2 区间作图法 Lander 和 Botstein(1989) 首次提出了基于两个相邻标记的区间作图法, 使得能够在整个基因组上搜索 Q T L Lander 和 Botstein 建立了正态混合分布的似然函数, 用以计算任一相邻标记之间的任一位置上所对应的似然函数比的对数 (LOD), 当区间中最大的 LOD 超过某一给定的临界值时, 就认为该区间中存在着 Q T L, 而且 Q T L 的位置也被确定下来 1992 年 Haley 和 Knott 以及 Martinez 和 Curnow 相继提出了区间作图的回归分析方法 研究表明回归作图方法同 Lander 和 Botstein 的极大似然法作图相比, 两者的效果差别不大 从理论上来说, 由于 Q T L 的分离使得对标记基因型的正态性假设不成立, 从而使回归方法不成功 不过大多数信息包含在标记基因型的均值差别上, 只有很少一部分 6

14 信息来自标记基因型的分布 (Haley and Knott,1992) 在计算速度上, 回归方法比极大似然法要优越得多, 而且回归方法能应用常用的统计软件包进行数值计算 与单标记分析方法相比, 区间作图法有许多优点 (Lander and Botstein,1989) :1 能推断 Q T L 在区间中的位置 ;2 如果染色体只有一个 Q T L, 则 Q T L 的位置和效应的估计渐近无偏 ;3 能使 Q T L 检测所需的个体数减少 0 畅 2 畅 2 畅 3 复合区间作图法 Rodolphe 和 Lefort(1993) 提出了用多个标记同时检测多个 Q T L 的线性模型, 该方法能够检测同一连锁群中的一组 Q T L, 但是它不能提供有关这些 Q T L 的数目 位置和效应的精确信息 Zeng(1993) 证明了表型对标记的偏回归系数只取决于两个相邻标记所包括的区间所存在的 Q T L, 而且与其他区间的 Q T L 无关 应用这一特性,Zeng(1994) 提出了将多元线性回归与区间作图结合起来的复合区间作图方法 复合区间作图的主要优点是 :1 仍采用 Q T L 似然图来显示 Q T L 的可能位置及显著程度, 从而保留了区间作图法的优点 ; 2 一次检验一个区间, 把对多个 Q T L 的多维搜索降低为一维搜索 ;3 假如不存在上位性和 Q T L 与环境互作,Q T L 的位置和效应的估计是渐近无偏的 ;4 充分利用了整个基因组的标记信息 ;5 以所选择的多个标记为条件, 在较大程度上控制了背景效应, 提高了作图的精度和效率 (Zeng,1994) 正是由于这些优点,Zeng 的复合区间作图法目前已被广泛应用 0 畅 2 畅 3 异交群体的 QTL 作图方法 家畜类 ( 尤其是牛和猪 ) 的中密度遗传标记图谱以及大群体的获得使得科学家们能够在基因组上的任何地方搜索 Q T L 表型性状一般受到数目较多的基因和环境的影响 依据实验群体的研究, 如果蝇 (Shrimpton and Robertson,1988) 家畜中的主基因分析 (Hanset,1982) 以及目前发表的数目有限的有关家畜 Q T L 作图研究, 可以假定只有少数几个基因的效应较大, 有一小部分的基因具有中等效应, 而大部分基因的效应却很小 较大效应和中等效应的基因是统计基因作图方法的目标, 现在有好几种方案可识别这些基因 (Andersson et al.,1994 ; Georges et al.,1995) 现已发展了许多统计基因作图方法, 可分为五类 第一类是使用单个标记或多种连锁标记的线性回归方法 ; 第二类是使用单个标记或多个连锁标记对假定的两个等位基因的 Q T L 进行极大似然分析 ; 第三类是亲子对表型差的平方对某个位点的共祖系数的期望值的回归分析 ; 第四类是基于混合线性模型的残差 ( 或限制 ) 极大似然分析法, 此法假定 Q T L 等位基因的效应服从正态分布, 并应用于已观察到的标记数据条件下的协方差矩阵 ; 第五种是利用单个标记或多个连锁标记拟合两个等位基因或无穷个等位基因的 Q T L 的精确贝叶斯连锁分析方法 这些方法在计算量上有所差别, 第一种和第三种计算量最小, 第四种稍大, 第二种和第五种计算量最大 有些方法是拟合固定的 Q T L 效应 ( 第一种 ), 有的是拟合 Q T L 的方差 ( 第三 五种 ), 而另一些则是拟合两个等位基因的纯合子的差和基因频率 ( 第二 五种 ) 计算量少的方法 ( 第一种和第三种 ) 允许数据置换 (Churchill and Doerge,1994), 可用来计算整个基因组上统计量的阈值, 而且容易扩展到多个 Q T L 和多个性状的情形 7

15 然而这些方法只能用特定的群体 ( 如半同胞或全同胞 ), 并且第一种方法不能提供除了 Q T L 位置以外其他参数的估计 参数的标准误差和置信区间可通过蒙特卡罗和投影寻踪的抽样技术而获得 0 畅 2 畅 3 畅 1 线性回归方法很多研究使用简单的线性回归方法来进行 Q T L 作图, 这里只讨论使用多个标记的回归方法 Zeng (1993) 给出了用多个连锁标记进行回归分析的理论基础 Knott 等 (1994) Spelman 等 (1996) 和 Uimari 等 (1996) 提出了用于半同胞群体 Q T L 作图的最小二乘法 (LS) 其假设条件是 :1 父本互不相关, 母本互不相关, 随机交配, 每个母本只有一个子代 ;2 标记图谱 ( 位置和等位基因频率 ) 是已知的 这种 LS 方法已经编写了 Fortran 程序 (Knott 和 Spelman 之间的私人通信 ), 在一个连锁群里使用所有的标记的情况下, 一般可计算出一个亲本中的标记基因型的可能连锁相 0 畅 2 畅 3 畅 2 极大似然法在异交群体中, 极大似然法已用于半同胞群体的 Q T L 作图 (Weller,1986 ;MacKinnon and Weller,1995) 在给定 Q T L 基因型的条件下, 有关假定和模型同 LS 分析一样 MacKinnon 和 Weller(1995) 给出了半同胞群体关于单个标记的似然函数, 而 Georges 等 (1995) 则给出了对于多个连锁标记的似然函数 最小二乘法 (LS) 和极大似然法 (M L) 有几点不同 极大似然法一般假定 Q T L 只有两个等位基因, 最小二乘法不直接给出 Q T L 参数的估计 在极大似然法里, 表型的分布是一个正态的混合分布, 不同的 Q T L 基因型其均值不同, 而在最小二乘法里假设表型是单一的正态分布, 其均值为 Q T L 基因型均值的加权平均, 而权则是在标记信息已知条件下的 Q T L 基因型 ( 或等位基因 ) 的概率 对于单个标记, 用最小二乘法,Q T L 的位置和效应不能独自估计出来, 而用极大似然法, 它们却能被估计出来 用极大似然法, 表型的非正态性的假设可能会错误地得出 Q T L 存在的结论 如果 Q T L 就在标记位点的话, 那么最小二乘法和极大似然法则是等价的 0 畅 2 畅 3 畅 3 差方回归法这种方法是基于分析亲子对表型差的平方, 最初是由 Haseman 和 Elston(1972) 为分析全同胞对而提出的 该方法对于性状在不同的分布条件下是稳健的 (Amos and Elston, 1989), 并可用于不同类型的子代对 (Amos and Elston,1989 ;Gotz and Hamann,1995) Gotz 和 Ollivier(1994) 发现对于家猪群体, 这种方法至少同最小二乘法一样有效 该方法的假设前提是随机交配和连锁平衡, 并且只用到特定类型的亲子对 在该方法中,Q T L 可有任意的等位基因数目 (Fulker and Cardon,1994) Haseman 和 Elston(1972) 的方法的缺点是不能区分 Q T L 的方差和 Q T L 与标记之间的距离 0 畅 2 畅 3 畅 4 基于混合模型的残差极大似然法 Grignola 等 (1996a,b ;1997) 发展了一种用于半同胞设计的 QTL 作图方法, 称为残差极大似然法 (REML), 此法使用多个连锁标记并允许应用家系间的关系 Van Arendonk 等 (1994) 指出当在半同胞群体中使用单个标记时,QTL 的方差和位置不能独立地得到估计 REM L 方法能使我们使用全谱系信息, 它不局限于特定的遗传设计, 适合于分析一般的或比较复杂的谱系 因此, 它最有可能成为人类谱系 Q T L 作图的有用方法 8

16 (Blangero and Almasy,1996), 同时也可能是异交植物群体 Q T L 作图的有用方法 0 畅 2 畅 3 畅 5 贝叶斯分析方法在贝叶斯分析里, 统计推断不是使似然函数极大化, 而是基于在给定观测值的条件下所有未知变量的联合后验分布 在动物 Q T L 作图中, 贝叶斯连锁分析首先由 Hoeschele 和 Van Raden(1993a,b) 提出, 然后由 Thaller 和 Hoeschele(1996a,b) 对单个标记通过马尔科夫链蒙特卡罗 (MCMC) 方法实现 Uimari 等 (1996) 考虑了用多个连锁标记进行 Q T L 作图,Uimari 和 Hoeschele(1997) 考虑了多个 Q T L 连锁的问题 贝叶斯分析方法还用于植物 ( Satagopan et al.,1996) 和人类 (Thomas and Cortessis,1992) 等群体的作图 早期贝叶斯分析 Q T L 作图一般假定在特定的染色体上只出现一个 Q T L, 并认为有以下几种可能 :1 标记位点的顺序以及它们之间的遗传距离是已知的 ;2 标记位点的顺序是已知的, 但遗传距离是未知的 ;3 标记位点的顺序和遗传距离均未知 目前连锁分析一般采用假设 1, 即使使用 MCMC(Satagopan et al.,1996) 也是这样 Uimari 等 (1996) 的分析是基于假设 2 的, 同时假设 3 的情况也可以包括在内 0 畅 2 畅 4 林木 QTL 作图 林木具有许多自身特有复杂的生物学特性 首先, 林木是多年生植物, 生长周期漫长, 短则十年, 长则数百年 其次, 林木是异花授粉植物, 具有很高的遗传杂合度 最后, 长期的异交使林木具有大量的遗传负荷, 自交或近交会导致林木生殖力的降低, 形成所谓的近交衰退 目前林木 Q T L 定位的遗传群体主要有以下三种 ( 易能君等,1998) (1) 拟近交谱系 种间高度杂合的亲本 (P 1 P 2) 杂交产生第一子代群体 (F 1 ), 两个 F 1 全同胞交配或 F 1 代回交于亲本 P 1 或 P 2 产生第二子代群体 ( 拟 F 2 或拟 BC 群体 ) 这类设计适合于遗传负荷较低的树种, 如毛果杨 美洲黑杨 (Bradshaw and Stettler,1995) (2) 种间 F1 设计 种间两高度杂合的亲本 (P1 P2 ) 杂交产生全同胞 F1 家系, 继而进行无性繁殖,Q T L 定位使用这些 F1 无性系的表型数据 这类设计适合于全同胞交配困难 无性繁殖容易而且杂种优势明显的树种, 如巨桉 尾叶桉 (Grattapaglia et al.,1995) (3) 三代全同胞谱系 在这种设计中, 作图群体的两亲本 (P1 P2) 及 P1 的亲本 GP11 GP12,P2 的亲本 GP21 GP22 均存在, 其中四个祖亲无亲缘关系, 因而 P1 与 P2 也无亲缘关系 每对亲本的表型应有极端的分化, 即其一有较高的表型值, 而另一个则有较低的表型值 表型的分化可增加其子代标记位点杂合的概率, 而祖亲的遗传型数据可提供连锁相的信息, 因此可提高标记间及标记与 Q T L 间连锁检测的效率 除了以上三种常见的遗传群体, 还可利用其他遗传材料进行 Q T L 定位, 如半同胞家系 (Grattapaglia et al.,1996) 和针叶树的大配子体 (Wu et al.,1997) 等 林木 QTL 作图的统计分析方法主要是利用为近交群体而发展的 QTL 作图理论 Grattapaglia 和 Sederoff(1995) 提出的 拟测交 方法, 使人们可直接使用 F 1 代来定位 QTL 考虑到林木的高度杂合性,Knott 等 (1997) 提出一种定位具有复等位基因的 QTL 方法 但是这些基于单个或几个家系的定位策略受到不少批评 (Muranty,1996), 因为它们没有利用目前林木育种研究所常用的交配设计 到目前为止, 没有一种方法考虑到林木的复杂生物学特性 它们的群体进化史以及多年育种所积累的育种群体 ( 邬荣领等,2000) 9

17 上篇遗传图谱构建的统计方法 遗传连锁图谱是用遗传距离来反映多态性的遗传标记在染色体上相对位置的基因组图 遗传标记可分为形态学标记 细胞学标记 生化标记和分子标记等四种 随着分子生物学技术的迅速发展, 人们能够获得多种多样的 DNA 分子标记, 如 RFLP SSR AFLP ISSR EST 等 利用这些分子标记, 现在已经构建了多种生物的分子遗传图谱 遗传图谱是系统地进行基因组研究的基础, 是在分子基础上进行动植物育种和人类遗传疾病诊断的依据 十多年来, 林木遗传图谱构建的进展非常迅速, 先后有 30 多个树种构建了分子标记遗传连锁图谱 在获得标记数据之后, 构建遗传连锁图谱会涉及复杂的统计分析过程 应作图的精确性和作图对象的需要, 这些统计方法还要得到不断地发展和完善 本篇主要研究遗传连锁图谱构建的统计分析方法, 包括不同作图群体的两点连锁分析 连锁群的划分 标记位点的排序和多位点的连锁分析等内容, 提出了基因位点排序的启发式搜索法和全同胞群体的多位点连锁分析的隐马尔可夫链法, 为利用林木的 F1 代构建高密度遗传图谱奠定了理论基础 最后, 修订了杉木的遗传连锁图谱, 结果比用拟测交法增加了 54 个标记, 使图谱的 AFLP 分子标记数达到了 195 个, 图谱几乎覆盖了整个杉木基因组

18 第 1 章背景知识和基本概念 连锁分析是现代遗传分析中的一个重要领域 有两类问题需要进行连锁分析 : 一是要构建遗传图谱, 即在给定一组遗传标记的情况下, 要确定标记在染色体上的相对位置, 并估计两两标记之间的遗传距离 ; 二是 Q T L 的定位, 即 Q T L 作图 Q T L 作图就是研究 Q T L 与遗传标记之间的连锁关系, 除了要估计遗传距离外,Q T L 作图还涉及 Q T L 的遗传方式以及有关遗传参数的估计 1990 年 10 月美国启动的人类基因组计划的贡献之一, 就是建立了人类的遗传图谱, 由此也推动了动植物遗传图谱的建立 在植物中, 已建立的遗传图谱有大麦 (Ramsay et al.,2000) 小麦 (Marion et al.,1998) 燕麦 (Yu et al., 2000) 水稻 (Harushimay et al., 1998) 玉米 (Wilson et al.,1999) 大豆 (Matthews et al.,2001) 番茄和马铃薯 ( Tanksley et al.,1992) 等 在动物中, 已建立的遗传图谱有小鼠 (Blake et al., 2000) 和家鼠 (Steen et al.,1999), 还有猪 马 牛 羊 鸡等家畜和家禽, 甚至还有家蚕 (Tan et al., 2001) 最新的人类高密度遗传图谱是 Kong 等 (2002) 建立的 利用遗传图谱和标记可以寻找控制有关性状的基因, 这在人类疾病研究中已获得了显著的成就 寻找控制 Q T L 虽然比较困难, 但是 20 多年来也有大量的研究 本章将简单介绍有关连锁分析的遗传背景知识和统计概念 1 畅 1 遗传背景 大多数生物的遗传物质是脱氧核糖核酸 (DNA),DNA 主要由核苷酸组成, 而核苷酸是由核糖 碱基和磷酸基团构成 有两类碱基 : 嘌呤和嘧啶 嘌呤包括腺嘌呤 (A) 和鸟嘌呤 (G), 嘧啶包括胞嘧啶 (C) 和胸腺嘧啶 ( T ) 核苷酸连接在一起形成多核苷酸, 一个 DNA 分子包含两条互补的核苷酸链, 两条链的碱基对 (A 与 T,G 与 C) 以氢键连接起来, 形成双螺旋结构 一条染色体上含有一个不间断的双链 DNA 分子, 它们可以在细胞核中找到 每个生物的基因组就分布在它的染色体上 二倍体具有两组染色体 : 一组来源于母本, 另一组来源于父本 单倍体只有一组染色体 大多数植物和动物是二倍体 染色体的数目因生物种类的不同而有很大的差异 人类有 23 对染色体, 其中 22 对为常染色体,1 对为性染色体 小鼠有 19 对染色体, 而果蝇只有 3 对染色体 基因是染色体上的一段可以翻译成蛋白质的 DNA 序列 一个基因的不同形式叫作等位基因, 等位基因通常用字母来表示 基因之间以及基因同环境之间的相互作用会影响个体的可观测的性状, 如毛发 皮肤的颜色或易感病性 ( 如癌症 麻疹等 ) 表型是指生物个体的一个或一组可观测的性状 性状可以是质量的, 也可以是数量的 位点是染色体上的某一点或是一个 DNA 片段 遗传标记位点是 DNA 片段, 它在个体间有所差异, 基因和遗传标记均被称为遗传位点, 我们将不加区别地使用位点和标记这两个词 12

19 一个个体基因型是指某个位点上的特定等位基因组合 当从母本上获得的等位基因同从父本上获得的等位基因一样时, 那么这个个体在这个位点上被称为是纯合子, 否则称为杂合子 与杂合子具有相同表型的纯合子中的基因称为显性基因, 而杂合子中的另一个等位基因称为隐性基因 如果两个纯合子均能同杂合子区分开来, 那么这两个等位基因称为共显性等位基因 从一个亲本那里获得的一组等位基因叫作配子 遗传标记的发展给试图定位控制复杂性状基因的遗传学家们带来了很大的希望 基于 DNA 多态性的遗传标记一般来说在表型上是中性的, 而且数量之多能够覆盖整个基因组 常用的遗传标记有 RFLP SSR AFLP ISSR EST SSLP 和 SNP 1 畅 2 减数分裂 当两个配子 精子和卵子融合在一起时, 受精完成, 并形成一个简单的二倍体受精卵, 然后发育成为个体 减数分裂是二倍体亲本细胞变成四个单体子细胞的过程 在减数分裂过程中, 先是一轮 DNA 的复制, 然后是两次细胞核的分裂 第一次分裂是减数的, 此时染色体数目减半 ; 第二次分裂是等数的 在第一次分裂之前, 染色体开始复制, 产生姊妹染色单体, 并连接在着丝粒处 随后在第一次分裂的前期, 同源染色体配对和联会, 联会的同源染色体包含四个染色单体, 称为二阶体 一旦配对完成后, 非姊妹染色单体上的片段会发生交换, 因此造成遗传物质的重组 在第一次分裂的后期, 染色体开始分离, 此时用显微镜可以观察到交换的结果, 即交叉现象 每个二阶体排列在赤道板的两侧, 同源染色体分离并移向两极, 每一极只有同源染色体中的一个 在第二次分裂过程中, 染色体收缩, 姊妹染色单体仍由着丝粒连接在一起, 但彼此分散得很开 然后着丝粒分裂, 染色单体被拉向两极, 两极的染色单体形成新的子核, 同时细胞质又分为两部分 这样经过两次分裂, 形成四个子细胞 图 1 畅 1 描述了交换的过程 图 1 畅 1 两个非姊妹染色单体的交换 Fig.1 畅 1 A single crossover between two non 唱 sister chromatids 1 畅 3 重组 干扰和遗传距离 考虑在两个位点上的基因型分别为 Aa 和 Bb 的个体, 其配子为 AB 和 ab 在减数分 13

20 裂过程中, 该个体可能产生四种配子 :AB ab Ab 和 ab 前两个称为非重组配子, 它们同亲本的染色体是一样的 ; 而 Ab 和 ab 称为重组配子, 这是由两个位点之间的奇数次交换所产生的 注意, 如果两个标记之间没有发生重组, 那么并不意味着两个标记之间没有发生交换, 因为两个位点之间的偶数次交换将会产生亲本的基因型 Sturtevant(1913) 提出了重组率的概念以度量两个位点之间的距离 两个位点之间的重组率 r 定义为双杂合子的亲本所产生的重组配子的比例 由于可能发生多重交换, 重组率不具有可加性, 即 r AC r AB + r BC 其中,r X Y 是位点 X Y 之间的重组率 (X Y 可用 A B C 替换 ) 通常用符合系数 ( C) 来度量交换干扰的程度, 符合系数定义为两个相邻区间双交换的频率同无干扰条件下的双交换期望频率的比值 g11 C = ( g 01 + g 11 )( g 10 + g 11) (1 畅 1) 其中,gij 是第一个区间发生 i 次重组 第二个区间发生 j 次重组的概率 干扰系数定义为 I = 1 - C, 因此若 C = 0, 则称为完全干扰 ; 若 C < 1, 则称为正干扰, 即一个区间中交换的发生会抑制邻近区间交换的发生 ; 若 C > 1, 则称为负干扰 观察表明, 对于紧密连锁的小区间, 其符合系数接近于 1 染色体上一对标记之间以摩尔根为单位的遗传距离就是在减数分裂过程中单染色体标记之间平均发生交换的次数 然而, 由于交换是不可观测的, 因此通常用作图函数来推断遗传距离 常用的作图函数有 (1) Haldane(1919) r = 1 2 (1 - e - 2 d ), d = ln(1-2 r) (1 畅 2) (2) Kosambi(1944) 其中,d 是以摩尔根为单位的遗传距离 r = 1 2 tanh(2 d), d = 1 4 ln r 1-2 r (1 畅 3) 1 畅 4 作图函数 作图函数提供了把遗传距离转换成重组率的变换, 有两种方法可用于推导作图函数 第一种方法就是假定长度为 x 的区间的交换次数服从某一概率分布, 这样重组率就是区间中发生奇数次交换的概率 第二种方法考虑两个相邻区间的重组事件, 并允许干扰的存在, 由此得到一个微分方程, 其解便是作图函数 下面详细地介绍这两种方法 第一种推导作图函数的方法设 Pk 为长度为 x 摩尔根的区间发生 k 次交换的概率, 由于在这个区间中只有发生奇数次的交换才能观测到一个重组, 因此重组率 rx 为 rx = P1 + P3 + P5 + (1 畅 4) Haldane 假设 Pk 服从泊松分布, 这意味着两个相邻区间的交换相互独立, 而且较短区间的交换概率同区间长度成正比 根据泊松分布, 长度为 x 摩尔根的区间中发生 k 次交换的概率为 14

21 P k = ( λx) k e - λx k! 其中,λ 为单位区间中的期望交换次数 由于单位区间中交换次数的期望值认为是 1, 即 有 λ = 1, 因此 此时有 于是 P k = xk e - x k! rx = x + x3 3! + x5 x2 +, r x = 1 + 5! 2! + x4 4! + r x + rx = 1 + x + 1 2! x ! x3 + = e x (1 畅 5) 考虑到 x = 0,rx = 0, 解上述微分方程可得 Haldane 的作图函数为 而其反函数为 r x = 1 2 (1 - e - 2 x ) (1 畅 6) x = ln(1-2 r x), 0 rx < 1 2, r x = 1 2 (1 畅 7) 第二种推导作图函数的方法考虑相邻的两个区间的重组率 设三个位点 A B 和 C 的顺序为 A B C,A 和 B 之间的图距为 x,b 和 C 之间的图距为 h 令 M( x) 为将图距 x 转换成重组率的作图函数, 并假定当 x 足够小时,rx = M( x) = x 记 gij 为重组事件的概 率, 如 g10 表示第一区间发生重组而第二区间没有发生重组事件的概率, 则 A 和 C 之间的 重组率 rac 可表示为 rac = g10 + g01 如果没有干扰的话, 那么 rac = g10 + g01 = rab(1 - rbc) + (1 - rab) rbc = rab + rbc - 2 rab rbc (1 畅 8) 而且 g11 = rab rbc 当干扰存在时, 双重组概率为 g11 = CrAB rbc,a 和 C 之间的重组率可 表示为 rac = rab + rbc - 2 CrAB rbc (1 畅 9) 其中,C 为符合系数 用作图函数来表示重组率, 则 (1 畅 9) 式可表示为 或 M( x + h) = M( x) + M( h) - 2 CM( x) M( h) M( x + h) - M( x) h = M( h) - 2 CM( x) M( h) h 当 h 0 时,M( h)/ h 1, 因此上式两边取极限得微分方程 d r x d x = 1-2 Crx (1 畅 10) 15

22 令 C = 1, 解微分方程就得到 Haldane 作图函数 当 C = 1 时, 相邻的两个区间重组相 互独立, 这种假设实际上隐含了泊松分布 令 C = 2 rx, 将得到 Kosambi 作图函数 其反函数为 rx = 1 e 4 x e 4 x + 1 (1 畅 11) x = 1 4 ln r x 1-2 r x (1 畅 12) 对于 C 取不同的假设, 由 (1 畅 10) 式可得到其他作图函数 (Ott, 1999) 当 C 1 时, 由 (1 畅 10) 式导出的作图函数不适合多于三个位点的分析 (Ott,1999) 1 畅 5 实验交配群体 近交系是由兄妹连续交配至少 20 代而产生的, 其结果是近交系中的个体在所有的位点上都是纯合子 包括小鼠在内的许多生物的近交系已用于遗传分析 利用实验生物, 通过在相同的环境下培育子代, 可控制可能影响性状的环境因素 任何两个近交系的表型差异几乎都源于特定的遗传基础 近交系已广泛地用于连锁分析和定位 Q T L, 近交系还可用于构建遗传图谱 利用近交系可以得到两类常见的交配群体, 即回交群体和 F2 代群体 为了方便起见, 我们以具有等位基因 A 和 a 的单个位点 A 来描述这两种交配群体 对于二者, 第一步就是用两个近交系交配 :AA aa 其子代称为 F 1 代, 所有的 F 1 代个体在遗传上彼此相同, 并且所有的位点均为杂合子 Aa 1 畅 5 畅 1 回交群体 F 1 代个体与基因型为 AA 或 aa 的个体间的交配称为回交, 回交子代形成回交群体 回交子代将从 F 1 代亲本那里得到属于纯系的两个等位基因之一 根据孟德尔的第一分离定律, 对于任何给定的位点, 有近一半子代的基因型为 Aa, 另一半子代的基因型为纯合子 (AA 或 aa) 我们将回交子代在某个位点为纯合子的基因型记为 A, 而杂合子则记为 H 从统计学的观点来看, 回交策略是最简单的, 每个子代可认为代表了单个减数分裂事件, 可以识别每个重组, 而且两个位点之间的重组率也容易被确定 1 畅 5 畅 2 F2 群体 两个 F1 代个体之间交配的子代形成 F2 代群体, 每个 F2 代个体将从双亲那里得到两个纯系祖亲的基因 同样, 根据孟德尔第一分离定律, 在任何位点上, 子代三种基因型的分布为 :25 % 为纯合子 AA,25 % 为纯合子 aa,50 % 为杂合子 Aa 一般记基因型 AA 为 A, aa 为 B,Aa 为 H 进一步, 记不确定基因型 AA 或 Aa 为 C,aa 或 Aa 为 D F2 子代所提供的重组信息比回交子代多一倍, 但是, 不幸的是 F2 代数据难以分析, 这是因为在杂合子中的位点不可能区分何种等位基因来自于何种亲本 16

23 1 畅 6 极大似然法与似然比检验 越广泛 极大似然法是参数估计中的一个重要方法, 而似然比检验在假设检验中的应用越来 设 Y 为一实值随机向量, 其联合分布密度函数为 f( y,θ) 其中,θ Ω 为联合密度 的参数向量,Ω 为参数空间 给定数值向量 y,θ Ω 的似然函数定义为 满足等式 的 θ^ 称为参数 θ 的极大似然估计 定义为 L( θ ;y) f( y ;θ) (1 畅 13) L( θ^;y) = max θ Ω L( θ ;y) (1 畅 14) 设检验的零假设为 H 0 :θ Ω 0, 而备择假设为 H 1 :θ Ω 1, 则该检验的似然比统计量 若数据向量 y 的似然函数为 Λ = max L( θ ;y) θ Ω Ω 0 1 max L( θ ;y) θ Ω 0 n L( θ ;y) i = 1 f( y i ;θ) 倡其中,y i 为 y 的分量, 则当 n 时, 极大似然估计 θ^ 收敛于参数的真值 θ (1 畅 15) 具有这样性 倡质的估计称为具有一致性或相合性 在适当的正则条件下,θ^ 渐近地服从均值为 θ 和协 方差矩阵为 B - 1 的多元正态分布, 其中 B - 1 = - E 抄 2 [ln L( θ ;y)] 抄 θ i 抄 θ j 倡 θ (1 畅 16) 而且, 当零假设为真时,T = 2ln Λ 渐近地服从自由度为 ν 的卡方分布 其中,ν 为参数空 间 Ω 和 Ω0 的维数之差 1 畅 7 EM 算法 EM 算法 (Dempster et al.,1977) 是一种迭代计算极大似然估计的方法, 对于一些不完全的观察数据特别有用 在很多应用领域里, 如遗传连锁分析,EM 算法不但在概念上而且在计算上都比较简单 (Lander and Green,1991) 假定有两个样本空间 : 一个是完全的观察空间 X, 另一个是不完全的观察空间 Y 从 X 到 Y 有一个映射 x y( x), 它将完全的观察值对应于我们在实验中能够观察到的不完全观察值 设来自完全样本空间 X 的一个样本 x 的密度或频率函数为 f ( x θ), 其中 θ 为未知的参数, 则由其导出的 y( x) 密度或频率函数为 g( y θ) 对于给定的一个不完全的观察值 y, 希望找到参数 θ 使得似然函数 g( y θ) 达到最大 假定 f( x θ) 具有指数族的形式 17

24 f( x θ) = b( x)exp[ θt( x) T ]/ a( θ) (1 畅 17) 其中,θ 为 1 r 的向量参数,t( x) 为 1 r 的完全数据充分统计量的向量, 上标 T 表示转 置运算 EM 算法定义如下 :1 给出 θ 的一个初始值 ;2 将 θ 的初值当作真值, 计算充分统计 量的期望值 ;3 将充分统计量的期望值当作是一个完全的观察值, 计算 θ 的极大似然估 计 ;4 重复前两步 下面是 EM 算法的详细描述 假定 θ ( p) 是经过 p 步迭代计算后的 θ 估计值, 那么新 估计值按以下方法获得 E 步骤 : 通过计算 t ( p) ( x) = E[ t( x) y, θ ( p) ] 来估计完全数据的充分统计量 t ( p) ( x) ; M 步骤 : 选取 θ ( p + 1) 使得似然函数 f[ t ( p) ( x) θ ( p) ] 达到最大 E 步骤的命名是由于在这一步需要计算充分统计量的期望值, 而 M 步骤是要找出一 个简单问题 ( 即对密度或频率函数 f 而非 g) 的极大似然估计 EM 算法具有一些优良的数学性质, 即似然函数 g( y θ) 随着连续的迭代计算而不减 少, 最后收敛于局部 ( 有时可能是全局 ) 的最大值点 此外,EM 算法还具有实用上的优 点, 它易于编程, 这是由于完全数据的似然函数一般具有较简单的形式 最后,EM 算法 的初值可以在一个较大的范围内选取而使得估计收敛到极大值点 下面是说明 EM 算法的一个简单而又经典例子 (Dempster et al.,1977) 设某种动物有 197 只, 属于四种基因型, 基因型的记数服从四分类的多项分布 四种 基因型的观察数据为 四种基因型的频率分布为 其中,0 θ 1 因此 ( y1 + y2 + y3 + y4)! g( y θ) = y1! y2! y3! y4! y = ( y1, y2, y3, y4) = (125,18,20,34) θ, 1 4 (1 - θ), 1 4 (1 - θ), 1 4 θ y 4 θ y 4 θ y y 4 θ θ 4 (1 畅 18) 若使用 EM 算法求 θ 的极大似然估计, 则将 y 看成是来自一个五分类的多项分布的 不完全数据 其中, 各类的频率分别为 1 2, 1 4 θ, 1 4 (1 - θ), 1 4 (1 - θ), 1 4 θ 即将四分类中的第一类分成两类 这样, 完全数据为 x = ( x1, x2, x3, x4, x5) 其中,x1 + x2 = y1,x3 = y2,x4 = y3,x5 = y4 于是 ( x1 + x2 + x3 + x4 + x5 )! f( x θ) = x 1! x 2! x 3! x 4! x 5! 参数 θ 估计的 EM 算法如下 E 步骤 : 给定 θ 的当前值 θ ( p), 计算 x1 x2 的当前期望值 : 1 2 x x θ x 4 θ x x 4 θ θ 5 (1 畅 19) 18

25 估计为 x ( p) 1 = θ( p), x ( p) 2 = θ( p) θ( p) M 步骤 : 将完全数据 [ x ( p) 1,x ( p) 2,18,20,34] 代入 (1 畅 19) 式, 可得参数 θ 的极大似然 θ ( p + 1) = x ( p) x ( p) 重复 E 步骤和 M 步骤, 直到 θ ( p) 和 θ ( p + 1) 差的绝对值小于某个临界值为止 表 1 畅 1 是初 值为 0 畅 25 临界值为 0 畅 时的迭代计算结果, 参数 θ 的极大似然估计为 θ^= 0 畅 6268 表 1 畅 1 EM 算法的结果 Table 1 畅 1 The results of arithmetic EM p θ ( p) θ ( p + 1) - θ ( p) p θ ( p) θ ( p + 1) - θ ( p) 0 0 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 畅 8 皮尔逊卡方统计量 在遗传分析中, 常用皮尔逊 (Pearson) 卡方统计量来检验群体的基因型是否满足一定 的分离比, 而这种检验实际上是多项分布的假设检验问题 皮尔逊卡方统计量是似然比 统计量的一种近似 由于皮尔逊卡方统计量易于计算, 因此它比似然比统计量使用得更 加广泛 设某个生物群体的基因型有 m 种, 其基因型的记数分别为 x1, x2,, x m 现要检 验基因型是否服从一定的频率分布, 即检验零假设 是否成立 其备择假设为 H0 :( p1, p2,, p m ) ω0 = {( p 0 1, p 0 2,, p 0 m )} (1 畅 20) H1 :( p1, p2,, pm ) ω1 = {( p1, p2,, p m) ( p1, p2,, p m ) 其中,p1 + p2 + + p m = 1 ( p 0 1, p 0 2,, p 0 m )} (1 畅 21) 记 Ω = ω0 ω1,p = ( p1,p2,,pm),n = x1 + x2 + + xm, 则检验的似然比统计量为 Λ = max p Ω n! x1! x m! p x 1 1 p x 2 2 p x m m n! max p ω 0 x1! x m! p x 1 1 p x 2 2 p x m m = p 0 1 p^x 1 1 p^x 2 2 p^x m m x 1 p 0 2 x 2 p 0 m x m = m i = 1 p^i p 0 i x i (1 畅 22) 19

26 其中,p^i = xi 为 pi 的极大似然估计 n 由于 xi = n p^i, 所以 m 2ln Λ = 2 n i = 1 p^iln p^i p 0 i m = 2 i = 1 Oiln Oi E i (1 畅 23) 其中,O i = n p^i 和 E i = np 0 i 分别为第 i 种基因型记数观察值和零假设下的期望值 由于函数 f( x) = xln x x0 所以 (1 畅 23) 式可近似地表示为 在 x 0 处的泰勒展开式为 f( x) = ( x - x0 ) ( x - x0 )2 1 x0 + (1 畅 24) m 2ln Λ 2 n i = 1 m ( p^i - p 0 i) + n i = 1 ( p^i - p 0 i) 2 p 0 i m = n i = 1 m = i = 1 ( p^i - p 0 i) 2 p 0 i ( O i - E i) 2 Ei (1 畅 25) 因为 Ω 的维数为 m - 1,ω0 的维数为 0, 因此由大样本理论可知, 当 n 较大时,2ln Λ 渐近 服从自由度为 m - 1 的卡方分布 于是, 皮尔逊卡方统计量 m X 2 = i = 1 也渐近服从自由度为 m - 1 的卡方分布 1 畅 9 显著性检验 ( Oi - Ei) 2 Ei (1 畅 26) 在似然比检验中, 当检验统计量 T 大于某一阈值 c 时, 零假设 H0 将被拒绝, 而将接受备择假设 H1 阈值 c 的选取要使得在 H0 为真的条件下, 满足 P( T > c) = α 一般地,α 取为 0 畅 05 或 0 畅 01 因此当 H0 为真时, 拒绝 H0 而接受 H1 的概率为 α, 此时称为犯了第一类错误,α 是检验的第一类错误率 当零假设为简单假设时,α 通常称为检验的显著性水平 在两个位点 A 和 B 的连锁检验中, 零假设为 H0 :rab = 0 畅 5, 备择假设为 H1 : 0 rab < 0 畅 5 如果 T 定义为 2ln Λ, 那么它将渐近地服从自由度为 1 的卡方分布 由表 1 畅 2 知,P( χ 2 1 > 2 畅 70) = 0 畅 1 因为这是一个单边假设检验, 取 c = 2 畅 7, 将得到第一类错误率或显著性水平为 0 畅 05 然而, 通常使用 LOD = log10 Λ > 3 来确定两位点间是否存在连锁关系 (Ott, 1999) 统计量 T 可用 LOD 表示为 T = 2LODln10 = 4 畅 6LOD, 因此, 用 LOD > 3 来检验连锁关系等价于 T > 4 畅 6 3 = 13 畅 8 或 Λ > 1000 来检验, 根据表 1 畅 2, 这将对应于单边检验的显著性水平为 0 畅

27 表 1 畅 2 拒绝不连锁假设的单边检验的显著性水平 ( T > c,r^ab < 0 畅 5) Table 1 畅 2 Significance levels for one 唱 sided test that rejects the hypothesis of no linkage when T > c and r^ab < 0 畅 5 c 1 畅 64 2 畅 70 5 畅 41 9 畅 畅 83 P( χ 2 1 > c) 0 畅 2 0 畅 1 0 畅 02 0 畅 畅 0002 显著性水平 0 畅 1 0 畅 05 0 畅 01 0 畅 畅 0001 在连锁分析中, 控制检验错误的思想同经典的显著性检验不同, 通常使用较低的 α 值 若用 L 表示两个位点之间连锁状态的随机变量, 则 L = 0 表示两个位点不连锁,L = 1 表示两个位点连锁 用 R 来表示这种连锁和非连锁的判定状态, 则 R = 0 表示判定两个位点不连锁,R = 1 表示判定两个位点连锁 根据连锁的真实性和判定的结果可将连锁检验分为四类, 如表 1 畅 3 所示 表 1 畅 3 连锁分析中假设检验的状态 Table 1 畅 3 The status of hypothesis in linkage analysis 项 目 接受 H 0 ( R = 0) 拒绝 H 0 ( R = 1) H 0 为真 ( L = 0) 正确 第一类错误 H 0 为假 ( L = 1) 第二类错误 正确 在经典的显著性检验中, 其目标就是要控制第一类错误, 即两个位点不连锁而被判为 连锁的概率 这个概率可表示为 α = P( R = 1 L = 0) = P( L = 0, R = 1) P( L = 0) = P( L = 0, R = 1) P( L = 0, R = 0) + P( L = 0, R = 1) 在连锁分析中, 其目标就是要控制后验第一类错误率, 即在判定两个位点连锁的情况 下而实际上这两个位点不连锁的概率 此概率为 P( L = 0, R = 1) P( L = 0, R = 1) P( L = 0 R = 1) = = P( R = 1) P( L = 0, R = 1) + P( L = 1, R = 1) (1 畅 27) P( L = 0,R = 1) = P( R = 1 L = 0) P( L = 0) = αp( L = 0) (1 畅 28) P( L = 1,R = 1) = P( R = 1 L = 1) P( L = 1) = (1 - β) P( L = 1) (1 畅 29) 其中,β 为第二类错误率, 而 1 - β 为检验的效率 因此,(1 畅 27) 式可表示为 αp( L = 0) P( L = 0 R = 1) = (1 畅 30) αp( L = 0) + (1 - β) P( L = 1) 如果随机地选取一个位点, 则在人类中 P( L = 0) 约为 0 畅 98(Ott, 1999) 取 P( L = 0) = 0 畅 98,P( L = 1) = 0 畅 02,α = 0 畅 05,β = 0 畅 05, 得 0 畅 05 0 畅 98 P( L = 0 R = 1) = 0 畅 05 0 畅 98 + (1-0 畅 05) 0 畅 02 = 0 畅 72 因此, 当检验的显著性水平为 α = 0 畅 05 时, 后验第一类错误率为 72 % 若取 α = 0 畅 0001, 即对应于连锁分析中常用的 LOD > 3, 则后验第一类错误率为 0 畅 畅 98 P( L = 0 R = 1) = 0 畅 畅 98 + (1-0 畅 05) 0 畅 02 = 0 畅 005 假定要使 P( L = 0 R = 1) = 0 畅 05, 由 (1 畅 30) 式可解得 P( L = 0 R = 1) P( L = 1) α = (1 - β) 1 - P( L = 0 R = 1) P( L = 0) = 0 畅 畅 05 (1-0 畅 05) 0 畅 02 0 畅 98 = 0 畅

28 Ott(1999) 说明了当 α = 0 畅 0001 时,P( L = 1 T = c) = 0 畅 95, 因此建议取 α = 0 畅 畅 10 分子标记数据和表型数据 这里列出一些实验或模拟的分子标记数据, 以供分析后面章节中的有关连锁分析和 Q T L 定位的统计模型 表 1 畅 4 是 Mapmaker 软件中所带的 F 2 代示例数据, 它含有 12 个表 1 畅 4 F2 群体的分子标记数据 Table 1 畅 4 Molecular marker data in F2 population 22

29 标记位点 ( 第一列 ),333 个个体 其中,A B 分别表示两种纯合的标记基因型,H 表示杂合的标记基因型, 表示缺失数据 表 1 畅 5 是 Zeng(1994) 模拟的 BC 群体第一个染色表 1 畅 5 BC 群体的分子标记数据 Table 1 畅 5 Molecular marker data in BC population 23

30 体上的 16 个分子标记数据 表 1 畅 6 是 Horvat 和 Medrano(1995) 获得的家鼠 F2 代分子标记数据及体重增量数据, 该数据可在 Q T L Cartographer 软件中找到 表 1 畅 6 家鼠的 F2 群体的分子标记数据和表型数据 Table 1 畅 6 Molecular marker and phenotype data in the mouse F2 population 倡家鼠体重的增量 24