第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 411 图 1 先导化合物及设计的目标化合物结构 Fig.1 Thestructuresofleadcompoundsanddesignedcompounds 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 AVⅢ 型 6

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虑柳
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1 第 35 卷第 4 期应用化学 Vol.35Is 年 4 月 CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY Apr ,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 a 李善花王宝睿黄志宁曲 ( 厦门大学 a 宁 a 苗方笑乔 a 红郑满意王海莉梁 a 医学院 ; 药学院福建厦门 ) 涵李福男摘要低氧诱导因子 l(hif 1) 与肿瘤细胞的生长侵袭和耐药密切相关, 在肿瘤细胞内 HIF 1 高度表达, 因此新型的 HIF 1 抑制剂可作为潜在的抗肿瘤药物本文合成了 9 个 1,3 取代吲唑衍生物通过蛋白质印迹 (WesternBlot) 法及实时定量荧光 PCR(Realtime PCR) 等方法检测了其对 HIF 1 及其靶基因血管内皮生长因子 (VEGF) 表达水平的影响, 并以 3 (5 羟甲基 2 呋喃基 ) 1 苯甲基吲唑 (YC 1) 为阳性对照药物初步评价了其体外抗肝癌细胞增殖的生物活性实验发现化合物 7 可显著抑制 HIF 1 及其下游靶基因 VEGF 的表达, 且体外抗肝癌增殖生物活性优于 YC 1, 半抑制浓度 (IC 50 ) 值为 10 37μmol/L 研究结果表明,3 (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 对甲苯磺酰基 ) 吲唑具有靶向抑制 HIF 及良好的抗肝癌活性作用关键词吲唑 ;HepG2 细胞 ; 低氧诱导因子 l; 抗肝癌活性中图分类号 :O626.3 文献标识码 :A 文章编号 : (2018) DOI: /j.isn 肝细胞癌 (Hepatocelularcarcinoma,HCC) 是全球最常见的肿瘤之一, 越来越多的研究发现, 炎性微环境在包括肝癌在内的多种肿瘤进展血管生成和侵袭中发挥了重要作用 [1] 低氧诱导因子 l(hif 1) 是调控肿瘤内缺氧效应的关键转录因子, 包括 HIF 1α 和 HIF 1β 它能控制肿瘤细胞在缺氧条件下众多基因的表达, 改变肿瘤细胞内糖代谢的方式, 增强肿瘤组织血管生成, 促进肿瘤细胞的增殖侵袭及转移由于细胞内对 HIF 1 的调控主要通过其 α 亚基进行, 因此 HIF 1α 抑制剂成为抗肿瘤药物的研究热点 HIF 1α 能够在 3 个方面加快糖酵解 :1)HIF 1α 转录表达出的与线粒体相关的酶类 ( 如丙酮酸脱氢酶激酶 1,PDK1 等 );2)HIF 1α 的表达上调其下游的葡萄糖转运蛋白靶基因 (GLUT1 和 GLUT3);3) 激活转录与葡萄糖代谢和糖酵解相关的关键酶类 ( 如磷酸甘油酸酯激酶 1,PGK1 等 ) [2] 其中,HIF 抑制剂 3 (5 羟甲基 2 呋喃基 ) 1 苯甲基吲唑 (YC 1) 因抑制 HIF 1α 表达及影响 HIF 1α 稳定性, 而表现出潜在的抗肿瘤特性 [3 4] [5] 近年来, 有大量的磺酰胺类抗肿瘤药物的研究发表 Lo 等将已有的抑制血管生成的磺酰胺类 [6] 药物 LY32262 和 LY33169 结构进行改造获得了抗肿瘤活性更强的新化合物刘菲等设计合成的一系列磺酰脒化合物也具有良好的抗肺癌肝癌及结肠癌的作用此外, 在本课题组的前期研究中发现, 在改造结构中连接哌啶基不仅能够提高化合物的稳定性, 还能够调节化合物的 ph 值 [7 8] 本文在前期研究工作的基础上, 以 HIF 抑制剂 YC 1 为先导化合物, 经优化药效基团设计合成了 9 个包含磺酰和哌啶结构的 1,3 取代吲唑类化合物所合成的化合物采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 法初步评价了其对肝癌 HepG2 细胞增殖的体外抑制活性其先导化合物及设计的目标化合物结构如图 1 所示收稿, 修回, 接受福建省科技厅项目 (2015Y0081,2015J01350); 厦门大学大学生创新创业训练计划项目 (2016X0644, ) 通讯联系人 : 李善花, 副教授 ;Tel: ;Fax: ;E mail:lish@xmu.edu.cn; 研究方向 : 分子生物学

2 第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 411 图 1 先导化合物及设计的目标化合物结构 Fig.1 Thestructuresofleadcompoundsanddesignedcompounds 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 AVⅢ 型 600MHz 核磁共振谱仪 ( 瑞士 Bruker 公司 );Q Exactive 型质谱仪 ( 美国 ThermoFisher 公司 );AB3200Q 型 TRAP MS 质谱仪 ( 美国 AB 公司 );Victor3V 型多功能酶标仪 ( 美国 Perkin Elmer 公司 );CEM DISCOVER 环形聚焦单模微波合成系统 ( 美国 CEM 公司 ) 细胞株 HepG2( 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 ), 实验室自行传代培养 1 Boc 4 甲烷磺酰氧基哌啶 ( 98%, 北京伊诺凯科技有限公司 ) N,N 二甲基甲酰胺 ( 98%,DMF, 上海泰坦科技股份有限公司 ) 硅胶 ( 青岛海洋化工集团 ), 其它所用试剂均为市售化学纯或分析纯 1.2 合成 (5 甲醛 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 (3) 的合成将 1 00g(8 46mmol) 吲唑与 2 37g (9 32mmol) 碘晶体溶解于 10mLDMF 中, 加入饱和氢氧化钠溶液 5mL, 室温搅拌 3h 反应完毕后, 加水乙酸乙酯萃取 3 次, 有机层用无水硫酸钠干燥, 减压蒸除溶剂除去溶剂后, 将 2 05g(8 40mmol) 中间产物与 2 37g(8 48mmol)1 Boc 4 甲烷磺酰氧基哌啶再次溶于 10mLDMF 中, 在冰浴下加入碳酸钾搅拌 10min 后, 在油浴中加热到 100, 搅拌过夜反应后加水乙酸乙酯萃取 3 次, 有机层依次用稀盐酸溶液纯水饱和氯化钠溶液分别萃取 2 次, 后用无水硫酸钠干燥, 减压蒸除溶剂, 经硅胶柱层析 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 10) 分离得获得淡黄色固体 ( 中间体 2) 将 3 50g(8 20mmol) 中间体 2,1 38g(9 86mmol)5 甲醛基呋喃 2 硼酸和 0 95g(0 82mmol) 四 ( 三苯基膦 ) 钯溶解于 50mL 乙二醇二甲醚 (DME) 中, 加入 5mL 饱和碳酸氢钠溶液, 在微波反应器中以 125,120W 的条件反应 15min 用水乙酸乙酯萃取 3 次, 有机层用饱和氯化钠溶液萃取 2 次, 减压蒸除溶剂将其溶于 20mL 乙酸乙酯, 缓慢滴入 5~6 滴浓盐酸, 室温搅拌 4h, 除去溶剂后, 经硅胶柱层析 (V( 甲醇 ) V( 二氯甲烷 )=1 10) 分离得获得 1 87g 白色固体 ( 中间体 3), 收率 74 8% (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 (4) 的合成将 2 36g(8 00mmol) 中间体 3 与 1 21g (3 20mmol) 硼氢化钠在干燥的 Ar 气条件下, 缓慢滴入 15mL 无水乙醇, 室温搅拌 10h 反应完成后, 加入稀盐酸溶液调节反应液 ph 值至 7, 抽滤去除沉淀, 减压蒸干溶剂, 经硅胶柱层析 (V( 甲醇 ) V( 二氯甲烷 )=1 8) 获得 1 40g 白色固体 ( 化合物 4), 收率 56% 1 HNMR(600MHz,DMSO d 6 ),δ:8 20(d,

3 412 应用化学第 35 卷 J=8 25Hz,1H),7 93(d,J=8 25Hz,1H),7 75(d,J=3 85Hz,1H),7 56(dt,J=0 73,7 70Hz,1H), 7 38(t,J=7 61Hz,1H),7 33(d,J=3 85Hz,1H),5 14~5 21(m,1H),3 43~3 49(m,3H),3 14~ 3 21(m,3H),2 39~2 48(m,3H),2 12~2 22(m,3H) MS(ESI) 计算值 C 17 H 19 N 3 O 2 [M +H] + : 298 1, 实测值 : (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 乙酮哌啶基 ) 吲唑 (5a) 的合成将 1 00g(3 39mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 ( 中间体 3) 溶于 5mL 二氯甲烷 (DCM), 加入 0 40g(5 09mmol) 乙酰氯, 缓慢滴入 0 5mL 三乙胺, 室温搅拌 3h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 1 10g 白色固体将 1 10g (3 26mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 37g (9 78mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 10) 分离得到 0 74g 白色固体, 收率为 64% mp243 3~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 09(d,J=8 25Hz,1H), 7 38~7 48(m,3H),7 23(ddd,J=1 19,6 56,8 02Hz,1H),6 83(d,J=3 30Hz,1H),6 46(d,J= 3 30Hz,1H),4 78(d,J=13 76Hz,1H),4 74(s,2H),4 65 ~4 69(m,1H),4 03(d,J=14 12Hz, 1H),3 25~3 34(m,1H),2 80~2 88(m,1H),2 37(dq,J=4 31,12 20Hz,1H),2 26(dq,J=4 31, 12 20Hz,1H),2 16(s,3H),2 07~2 13(m,2H); 13 CNMR(151MHz,CDCl 3 ),δ:169 0,153 9,148 8, 139 6,136 1,126 6,121 9,121 4,121 3,109 6,108 9,107 7,57 6,56 1,45 6,40 8,31 7,31 1,21 4 MS(ESI) 计算值 C 19 H 21 N 3 O 3 [M+H] + :340 2, 实测值 : (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 丙烷酮哌啶基 ) 吲唑 (5) 的合成将 1 00g(3 39mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 ( 中间体 3) 溶于 5mLDCM, 加入 0 47g(5 09mmol) 丙酰氯, 缓慢滴入 0 5mL 三乙胺, 室温搅拌 3h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 1 08g 白色固体将 1 08g (3 09mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 35g (9 27mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 10) 分离得到 0 73g 白色固体, 收率为 61% mp249 8~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 08(d,J=8 25Hz,1H), 7 39~7 45(m,2H),7 22(t,J=7 24Hz,1H),6 83(d,J=3 30Hz,1H),6 45(d,J=3 30Hz,1H), 4 80(d,J=13 02Hz,1H),4 74(s,2H),4 66(t,J=4 17,11 14Hz,1H),4 07(d,J=13 75Hz,1H), 3 25(t,J=12 75Hz,1H),2 83(t,J=12 20Hz,1H),2 41(q,J=7 34Hz,2H),2 27~2 38(m,2H), 2 16(s,1H),2 04~2 13(m,2H),1 19(t,J=7 43Hz,3H); 13 CNMR(151MHz,CDCl 3 ),δ:172 3, 154 0,148 9,139 7,136 1,126 6,121 9,121 4,121 3,109 6,109 0,107 7,57 7,56 3,44 7,41 0, 31 8,31 2,26 6,9 6 MS(ESI) 计算值 C 20 H 23 N 3 O 3 [M+H] + :354 2, 实测值 : (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 异丁烷酮哌啶基 ) 吲唑 (5c) 的合成将 1 00g(3 39mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 ( 中间体 3) 溶于 5mLDCM, 加入 0 54g(5 09mmol) 异丁酰氯, 缓慢滴入 0 5mL 三乙胺, 室温搅拌 3h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 1 07g 白色固体将 1 07g (2 96mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 34g (8 88mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 10) 分离得到 0 74g 白色固体, 收率为 59% mp215 0~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 08(d,J=8 25Hz,1H), 7 39~7 45(m,2H),7 23(dt,J=0 83,7 29Hz,1H),6 83(d,J=3 30Hz,1H),6 46(d,J=3 12Hz, 1H),4 82(d,J=12 65Hz,1H),4 74(d,J=5 50Hz,2H),4 68(t,J=4 24,11 26Hz,1H),4 16(d, J=12 84Hz,1H),3 28(t,J=12 20Hz,1H),2 79~2 90(m,2H),2 36(d,J=10 64Hz,1H),2 26(d, J=10 45Hz,1H),2 16~2 20(m,1H),2 06~2 16(m,2H),1 14~1 22(m,6H); 13 CNMR(151MHz,

4 第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 413 CDCl 3 ),δ:175 5,153 9,148 9,139 7,136 1,126 6,121 9,121 4,121 3,109 6,109 0,107 7,57 7, 56 4,44 6,41 1,32 0,31 3,30 2,19 6,19 4 MS(ESI) 计算值 C 21 H 25 N 3 O 3 [M+H] + :368 2, 实测值 : (5 羟甲基 2H 呋喃 ) 1 (1 丁烷酮哌啶基 ) 吲唑 (5d) 的合成将 1 00g(3 39mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 ( 中间体 3) 溶于 5mLDCM, 加入 0 54g(5 09mmol) 丁酰氯, 缓慢滴入 0 5mL 三乙胺, 室温搅拌 3h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 1 05g 白色固体将 1 05g (2 87mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 33g (8 61mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 10) 分离得到 0 73g 白色固体, 收率为 59% mp205 9~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 08(d,J=8 25Hz,1H), 7 43~7 45(m,1H),7 39~7 42(m,1H),7 23(ddd,J=1 19,6 56,8 02Hz,1H),6 83(d,J= 3 30Hz,1H),6 46(d,J=3 30Hz,1H),4 80(d,J=13 57Hz,1H),4 74(s,2H),4 67(t,J=4 17, 11 23Hz,1H),4 05~4 11(m,1H),3 22~3 29(m,1H),2 79~2 86(m,1H),2 35~2 40(m,3H), 2 20~2 35(m,2H),2 07~2 14(m,2H),1 71(m,2H),1 00(t,J=7 43Hz,3H); 13 CNMR(151MHz, CDCl 3 ),δ:171 6,153 9,148 9,139 7,136 1,126 6,121 9,121 4,121 3,109 6,109 0,107 7,57 7, 56 3,44 9,40 9,35 4,31 8,31 2,18 8,14 1 MS(ESI) 计算值 C 21 H 25 N 3 O 3 [M+H] + :368 2, 实测值 : (5 甲醛 2 呋喃 ) 吲唑 (6) 的合成将 1 00g(8 46mmol) 吲唑与 2 37g(9 32mmol) 碘晶体溶解于 10mLDMF 中, 加入饱和氢氧化钠溶液 5mL, 室温搅拌 3h 反应完毕后, 加水乙酸乙酯萃取 3 次, 有机层用无水硫酸钠干燥, 减压蒸除溶剂除去溶剂后, 将 1 98g(8 11mmol) 中间体,1 25g (8 92mmol)5 甲醛基呋喃 2 硼酸和 0 94g(0 81mmol) 四 ( 三苯基膦 ) 钯溶解于 50mLDME 中, 加入 5mL 饱和碳酸氢钠溶液, 在微波反应器中以 125,120W 的条件反应 15min 加水乙酸乙酯萃取 3 次, 有机层用饱和氯化钠溶液萃取 2 次, 减压蒸除溶剂经硅胶柱层析 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )= 1 5) 分离得获得 1 36g 白色固体 ( 中间体 6), 收率 76% 1 HNMR(600MHz,DMSO d 6 ),δ:13 72(s, 1H),9 68(s,1H),8 17(d,J=8 25Hz,1H),7 73(d,J=3 67Hz,1H),7 66(d,J=8 44Hz,1H),7 48 (ddd,j=0 92,7 01,8 21Hz,1H),7 32(ddd,J=0 73,7 02,8 02Hz,1H),7 29(d,J=3 67Hz,1H); 13 CNMR(151MHz,DMSO d 6 ),δ:178 2,154 6,151 9,141 5,135 0,127 4,125 6,122 7,120 9,120 3, 111 4, (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 苯磺酰基 ) 吲唑 (7a) 的合成将 1 00g(4 72mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 吲唑 ( 中间体 6) 溶于 5mLDCM, 加入 1 25g(7 08mmol) 苯磺酰, 缓慢滴入 1mL 三乙胺, 室温搅拌 6h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V( 二氯甲烷 )=1 2) 分离得到 1 61g 白色固体将 1 61g(4 57mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 52g(13 71mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 1 05g 白色固体, 收率为 63% mp 198 6~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 22(d,J=8 62Hz,1H),8 09(d,J=8 07Hz,1H), 7 98~8 00(m,2H),7 58(ddd,J=0 92,7 24,8 34Hz,1H),7 51 ~7 55(m,1H),7 41 ~7 45(m, 2H),7 36~7 40(m,1H),7 07(d,J=3 30Hz,1H),6 47(d,J=3 48Hz,1H),4 73(s,2H),1 70(r s,1h); 13 CNMR(151MHz,CDCl 3 ),δ:155 7,146 8,143 3,141 4,137 4,134 1,129 5,129 2,127 5, 124 7,123 4,122 3,113 4,111 5,109 8, (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 对甲苯磺酰基 ) 吲唑 (7) 的合成将 1 00g(4 72mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 吲唑 ( 中间体 6) 溶于 5mLDCM, 加入 1 35g(7 08mmol) 对甲苯磺酰, 缓慢滴入 1mL 三乙胺, 室温搅拌 6h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经

5 414 应用化学第 35 卷硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 2) 分离得到 1 52g 白色固体将 1 52g(4 15mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 47g(12 45mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 1 01g 白色固体, 收率为 58% mp 203 5~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 21(d,J=8 44Hz,1H),8 08(d,J=8 07Hz,1H), 7 86(d,J=8 25Hz,2H),7 51~7 60(m,1H),7 37(t,J=7 52Hz,1H),7 21(d,J=8 25Hz,2H), 7 06(d,J=3 48Hz,1H),6 46(d,J=3 30Hz,1H),4 73(s,2H),2 32(s,3H),1 73(rs,1H); 13 CNMR(151MHz,CDCl 3 ),δ:155 6,146 8,145 4,143 2,141 4,134 5,129 8,129 4,127 6,124 6, 123 4,122 2,113 4,111 3,109 8,57 6,21 6 HRMS(ESI) 计算值 C 19 H 16 N 2 O 4 S[M+H] + : , 实测值 : (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 (1 间甲苯磺酰基 ) 吲唑 (7c) 的合成将 1 00g(4 72mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 吲唑 ( 中间体 6) 溶于 5mLDCM, 加入 1 35g(7 08mmol) 间甲苯磺酰, 缓慢滴入 1mL 三乙胺, 室温搅拌 6h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 2) 分离得到 1 37g 白色固体将 1 37g(3 74mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 42g(11 22mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 2) 分离得到 0 89g 白色固体, 收率为 51% mp 199 0~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 22(d,J=8 62Hz,1H),8 10(d,J=8 07Hz,1H), 7 81(s,1H),7 78(d,J=7 70Hz,1H),7 58(ddd,J=1 10,7 20,8 39Hz,1H),7 36~7 40(m,1H), 7 28~7 35(m,2H),7 07(d,J=3 30Hz,1H),6 47(d,J=3 48Hz,1H),4 74(d,J=4 77Hz,2H), 2 35(s,3H),2 14(rs,1H); 13 CNMR(151MHz,CDCl 3 ),δ:155 6,146 9,143 2,141 4,139 6,137 3, 135 0,129 5,129 1,127 8,124 7,124 6,123 4,122 2,113 4,111 4,109 8,57 6,21 3 MS(ESI) 计算值 C 19 H 16 N 2 O 4 S[M+H] + :369 1, 实测值 : (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 苄基吲唑 (7d) 的合成将 1 00g(4 72mmol)3 (5 甲醛 2 呋喃 ) 吲唑 ( 中间体 6) 溶于 5mLDCM, 加入 1 21g(7 08mmol) 溴化苄, 缓慢滴入 1mL 三乙胺, 室温搅拌 6h 反应后, 加水二氯甲烷萃取 2 次, 有机层用饱和食盐水萃取 2 次后, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 甲醇 ) V(DCM)=1 2) 分离得到 1 22g 白色固体将 1 22g(4 04mmol) 白色固体在干燥的环境下, 溶于无水乙醇, 在冰浴下搅拌 5min, 缓慢加入 0 46g(12 12mmol) 硼氢化钠, 持续冰浴搅拌 10min 后恢复室温, 搅拌 3h 充分反应后, 加入稀盐酸溶液淬灭, 调 ph 值至 7, 抽滤除去沉淀, 减压旋蒸经硅胶层析柱 (V( 乙酸乙酯 ) V( 正己烷 )=1 3) 分离得到 1 01g 白色固体, 收率为 71% mp111 0~ HNMR(600MHz,CDCl 3 ),δ:8 05(d,J=8 07Hz,1H),7 33~7 37(m,1H),7 29(dd,J=7 98, 14 76Hz,3H),7 23~7 26(m,1H),7 19~7 23(m,3H),6 87(d,J=3 30Hz,1H),6 46(d,J= 3 30Hz,1H),5 64(s,2H),4 74(s,2H),3 47(s,1H) MS(ESI) 计算值 C 19 H 16 N 2 O 2 [M+H] + :305 1, 实测值 : 靶向抑制 HIF 及体外抗肝癌增殖活性的评价 MTT 法 : 将处于对数生长期的 HepG2 细胞接种于 96 孔板 (5000 个 / 孔 ), 培养 24h 后给药, 药物浓度梯度设置为及 20μmol/L, 给药 48h 后进行 MTT 活性检测细胞增殖实验 : 将处于对数生长期的 HepG2 细胞接种于 12 孔板 ( 个 / 孔 ), 培养 24h 后给药, 药物浓度梯度设置为 1 10 及 20μmol/L, 分别于给药 1 2 和 3d 后进行细胞计数蛋白质印迹法 (WesternBlotasay): 将处于对数生长期的 HepG2 细胞接种于 60mm 培养皿, 培养 24h 后, 按照 1 10 和 20μmol/L 的浓度梯度给药, 同时予以低氧模拟剂去铁胺 (Desferioxamine,DFX) 130μmol/L 处理细胞, 给药 24h 后收集细胞, 裂解细胞制备蛋白样品, 经 8% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) 转膜封闭后, 分别以 / 的 HIF 1α/β actin(β 肌动蛋白 ) 抗体 4 孵育过夜, 经的二抗室温孵育 1h, 应用 ECL 试剂盒显影

6 第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 415 荧光定量逆转录聚合酶链反应 (Realtime PCR): 将处于对数生长期的 HepG2 细胞接种于 35mm 培养皿, 培养 24h 后, 按照 1 10 和 20μmol/L 的浓度梯度给药, 同时予以 DFX130μmol/L 处理细胞, 给药 24h 后收集细胞, 提取核糖核酸 (RNA), 逆转录为互补 DNA(cDNA), 应用 ABI 公司生产的 stepone 实时定量 PCR 仪检测 VEGF 信使 RNA(mRNA) 的水平 2 结果与讨论 2.1 目标化合物的合成路线目标化合物的合成见 Scheme1 和 Scheme2 在 Scheme1 中首先将吲唑 ( 化合物 1) 与碘晶体溶解于 DMF 中, 在碱性条件下生成 3 碘吲唑, 将其与 1 Boc 4 甲烷磺酰氧基哌啶在碳酸钾的催化下生成中间体 2 [9 10] 中间体 2 与 5 甲醛基呋喃 2 硼酸溶解于 DME 中, 在饱和碳酸氢钠中加入催化剂四 ( 三苯基膦 ) 钯, 经微波反应后用稀盐酸处理获得中间体 3 [11] 中间体 3 经硼氢化钠催化的还原反应, 获得 3 (5 羟甲基 2 呋喃 ) 1 哌啶基吲唑 ( 化合物 4) 化合物 4 经简单的脱水缩合反应可获得化合物 5a~ 5d Scheme1 Synthesisrouteofthetargetcompounds5a~5d 2.2 目标化合物的生物学数据基于本课题组已报道的二芳醚类抗肿瘤活性的研究结果 [7 8], 本文设计并合成出了 9 个 1,3 取代吲唑衍生物 4 5a~5d 7a~7d 采用 MTT 法测试化合物对人肝细胞癌 HepG2 细胞株的体外增殖抑制作用 [12] 实验重复 3 次, 取平均值, 阳性对照药物为 7d(YC 1)( 表 1) 在此基础上进一步比较了不同浓度的化合物 7 与阳性对照 YC 1 对 HepG2 细胞存活率的抑制作用, 采用细胞计数检测了化合物 7 对 HepG2 细胞体外增殖的抑制作用 ( 图 2); 应用 Westernlot 及 Realtime PCR 等方法检测了化合物 7 对 HIF 1 及其下游基因 VEGF 表达的靶向抑制作用 ( 图 3)

7 416 应用化学第 35 卷 Scheme2 Synthesisrouteofthetargetcompounds7a~7d 表 1 化合物 4 5a~5d 和 7a~7d 对 HepG2 细胞株的 IC 50 Tale1 IC 50 valuesofcompounds4,5a~5d,7a~7donhepg2cellineinvitro Compounds R IR@20μmol/L/% a IC 50 /(μmol L -1 ) nottested 5a 8.83 nottested c nottested 5d nottested 7a nottested c nottested Continuedonnextpage

第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 417 continuedfrompreviouspage Compounds R IR@20μmol/L/% IC 50 /(μmol L -1 ) 7d(YC 1) 54.21 16.56 a.ir:iresartan;.

8 第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 417 continuedfrompreviouspage Compounds R IR@20μmol/L/% IC 50 /(μmol L -1 ) 7d(YC 1) a.ir:iresartan;.nottestedastheinhaitationrateofpreliminaryscreeninglesthan50%. 图 2 化合物 7 显著抑制 HepG2 细胞的增殖 Fig.2 ProliferationofHepG2celswassignificantlyinhiitedycompound7 A.MTTasaywasperformedyYC 1anddiferentdoescompound7(n=4)( P<0 05);B.thegrowthcurvesofHepG2cels treatmentwithdiferentdoescompound7(n=3)( P<0 01) 图 3 化合物 7 抑制 HepG2 细胞 HIF 1α(A) 及靶基因 VEGF(B) 的表达 Fig.3 ExpresionofHIF 1αandtargetgeneVEGFwereinhiitedycompound7inHepG2cels A.westernlotanalysiswasusedtoexaminetheexpresionofHIF 1αandβ actinproteinsinhepg2celsafterincuationwith compound7anddfxfor24h;b.realtime PCRwasusedtoexaminethemRNAlevelofVEGFinHepG2celsafterincuationwith compound7anddfxfor24h(n=3)( P<0 01) 初步的细胞凋亡粗筛 MTT 试验后, 我们可以从粗筛结果中看出一些变化 : 相较于具有活泼氮氢的化合物 4, 引入简单烷基结构 ( 化合物 5a~5d) 能够提高化合物的 HepG2 细胞抑制率 ; 化合物 5a~5d 对比可以看出简单烷基链并不是越长越有利, 过长的或是空间结构更加复杂的烷基结构反而会降低化合物的抑制活性, 很有可能是因为过多的烷基破坏了化合物原本空间的电子云分布, 降低了其与对应受体的结合率 ; 化合物 7a~7c 与已知化合物 YC 1( 化合物 7d) 结构相近, 磺酰基的替换并没有对化合物的活性造成太大影响, 甚至略有降低, 但在苯环上引入甲基后有所改变, 对位甲基取代的稳定结构提升了化合物的活性, 很可能是因为甲基的存在形成共轭, 使化合物的电子云密度分布发生改变 ( 共平面化趋于平均 ) 我们以 50% 为分界线, 抑制率低于 50% 的化合物不再做进一步分析, 而抑制率高于 50% 的化合物 5 7 和 7d 进行了进一步 MTT 分析求出其 IC 50 值实验结果表明, 相较于阳性对照 YC 1 的抑

9 418 应用化学第 35 卷制率 (IC 50 =16 56μmol/L) 而言, 化合物 5 和 7 表现出较好的抗肝癌活性, 其中化合物 7 的 IC 50 =10 37μmol/L 尤为突出苯环上引入推电子基团甲基后活性增加, 其对位取代活性最强初步推测可能与取代基的诱导效应及苯环上电子云密度有关从图 2A 可以看出, 在给药化合物 7 后,HepG2 细胞存活率随着给药浓度增加逐渐降低, 而且化合物 7 对 HepG2 细胞的抑制率要优于阳性对照药 YC 1 从图 2B 可以看出, 相对于空白对照, 给药化合物 7 后,HepG2 细胞体外增殖速度显著降低, 而且随着给药浓度增加,HepG2 细胞体外增殖速度逐渐降低化合物 7 通过 WesternBlot 及 Realtime PCR 等方法检测了其对 HIF 1 及其靶基因 VEGF 表达水平的影响, 从图 3A 可以看出, 化合物 7 可显著抑制 HIF 1 的蛋白表达, 图 3B 显示的是随着化合物 7 给药浓度增加,HIF 1 下游靶基因 VEGF 的 mrna 表达水平逐渐被抑制综上所述, 新结构 3 取代 1 对甲苯磺酰基吲唑类化合物具有靶向抑制 HIF 及良好的抗肝癌活性作用由于化合物数量有限, 因此其它取代基对抗肿瘤活性的影响有待于进一步研究 3 结论本文设计合成了 9 个 1,3 取代吲唑衍生物生物活性评价结果表明其具有不同程度的 HIF 1 抑制作用将先导化合物 YC 1 的苄基结构替换为哌啶或苯磺酰结构, 发现化合物 5 和 7 活性优于 YC 1 的化合物, 为今后的设计提供了理论和实验依据特别是化合物 7 具有良好的 HIF 1 靶向抑制作用及抗肝癌活性 (IC 50 =10 37μmol/L), 并较好地抑制了 VEGF 的表达水平因此, 化合物 7 可作为潜在的抗肿瘤药物更深层次机制, 如 HIF 1 相关的信号通路和蛋白的关系, 有待进一步研究参考文献 [1]LIANGHongyuan,LUZaiming.CurentSituationandPerplexityofComprehensiveInterventionalTherapyforPrimaryLiver Cancer[J].JClinHepatol,2016,32(1):44 48(inChinese). 梁宏元, 卢再鸣. 原发性肝癌综合介入治疗现状与困惑 [J]. 临床肝胆病杂志,2016,32(1): [2]DenkoNC.Hypoxia,HIF1andGlucoseMetaolismintheSolidTumour[J].NatRevCancer,2008,8(9): [3]TsuiL,FongTH,WangIJ.YC 1TargetingofHypoxia InducileFactor 1ΑReducesRGC 5CelViailityandInhiits CelProliferation[J].MolVis,2012,18: [4]TsuiL,FongTH,WangIJ.TheEfectof3 (5 Hydroxymethyl 2 Furyl) 1 Benzylindazole(YC 1)onCelViaility UnderHypoxia[J].MolVis,2013,19: [5]LoK,Hipskind P,AikinsJ,etal. AcylSulfonamide anti Proliferatives:Benzene SustituentStructure Activity RelationshipsforaNovelClasofAntitumorAgents[J].JMedChem,2004,47(22): [6]LIUFei,LIUNan,HELing.SynthesisandAntitumorActivitiesofSulfonylAmidineDerivatives[J].ChineseJSynth Chem,2014,22(4): (inChinese). 刘菲, 刘楠, 何菱. 磺酰脒衍生物的合成及其抗肿瘤活性 [J]. 合成化学,2014,22(4): [7]YangSM,HuangZN,ZhouZS,etal.Structure aseddesign,structure ActivityRelationshipAnalysis,andAntitumor ActivityofDiarylEtherDerivatives[J].ArchPharmRes,2015,38(10): [8]HouJ,ZhaoW,HuangZN,etal.EvaluationofNovelN (Piperidin 4 Yl)BenzamideDerivativesasPotentialCelCycle InhiitorsinHepG2Cels[J].ChemBiolDrugDes,2015,86(2): [9]XiaoJ,JinC,LiuZ,etal.TheDesign,Synthesis,andBiologicalEvaluationofNovelYC 1DerivativesasPotent Anti HepaticFirosisAgents[J].OrgBiomolChem,2015,13(26): [10]ZhangD,KohlmanD,KrushinskiJ,etal.Design,SynthesisandEvaluationofBicyclicBenzamidesasNovel5 HT1F ReceptorAgonists[J].BioorgMedChemLet,2004,14(24): [11]AnH,KimNJ,JungJW,etal.Design,SynthesisandInsightintotheStructureActivityRelationshipof1,3 Disustituted IndazolesasNovelHIF 1Inhiitors[J].BioorgMedChemLet,2011,21(21): [12]Gamet PayrastreL,LiP,LumeauS,etal.Sulforaphane,aNaturalyOccuringIsothiocyanate,InducesCelCycleArest andapoptosisinht29humancoloncancercels[j].cancerres,2000,60(5):

10 第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 419 SynthesisandAnti HepatomaActivitiesof 1,3 SustitutedIndazoleDerivativesas HypoxiaInducedFactorInhiitors LIShanhu a,huangzhining,miaofangxiao a,zhengmanyi,lianghan, WANGBaorui,QUNing a,qiaohong a,wanghaili,lifunan ( a MedicalColege; SchoolofPharmaceuticalSciences,XiamenUniversity,Xiamen,Fujian361102,China) Astract Hypoxia inducilefactor1(hif 1)iscloselyrelatedtothegrowth,invasionanddrugresistanceof tumorcelsandishighlyexpresedintumorcels,sonewhif 1inhiitorscaneusedaspotentialantitumor drugs.nine1,3 sustitutedindazolederivativesweresynthesized.theexpresionofhif 1anditstargetgene vascularendothelialgrowthfactor(vegf)weredetectedywesternblotandrealtime PCR(polymerase chainreaction),andtheanti tumoractivitiesofalthenewlysynthesizedcompoundswereevaluatedonthein vitrogrowthofhepg2cellinetaking3 (5 hydroxymethyl 2 furyl) 1 enzylindazole(yc 1)(compound 7d)aspositivecontrol.Wefoundthatcompound7significantlyinhiitedtheexpresionofHIF 1andits downstreamtargetgenevegf,andtheanti hepatomaiologicalactivityinvitroofcompound7waseter thanthatofyc 1withhalfmaximalinhiitoryconcentration(IC 50 )valuesof10 37μmol/L.Theresultsshow that3 (5 hydroxymethyl 2 furan) 1 (1 p tolylsulfonyl)indazoletargetstheinhiitionofhifactivity,ut alsohasagoodanti hepatomaactivity. Keywords indazole;hepg2cels;hypoxia inducilefactor1;anti hepatomaactivity Received ;Revised ;Accepted SupportedytheNaturalScienceFoundationofFujianProvinceofChina(No.2015Y0081,No.2015J01350),XMUTrainingProgram of InnovationandEnterpreneurshipforUndergraduates(No.2016X0644,No ) Corespondingauthor:LIShanhua,asociateprofesor;Tel: ;Fax: ;E mail:lish@xmu.edu.cn;research interests:moleculariology

Microsoft Word - a Z.doc

Microsoft Word - a Z.doc 2005 年第 63 卷化学学报 Vol.63, 2005 第 20 期, 1901~1905 ACTA CHIMICA SINICA No. 20, 1901~1905 研究论文 (±) Cudraflavanone B 及 (±)-5-O-Methyl Cudraflavanone B 的全合成研究杨永刚张宇曹小平 * ( 兰州大学化学化工学院功能有机分子化学国家重点实验室兰州 730000)

第 4 期 李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 411 图 1 先导化合物及设计的目标化合物结构 Fig.1 Thestructuresofleadcompoundsanddesignedcompounds 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 AVⅢ 型 6

第 4 期李善花等 :1,3 取代吲唑类低氧诱导因子 l 抑制剂的设计合成及其抗肝癌活性 411 图 1 先导化合物及设计的目标化合物结构 Fig.1 Thestructuresofleadcompoundsanddesignedcompounds 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 AVⅢ 型 6