HF104-总RNA提取试剂盒(TRIzol法).doc

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忌狄
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1 您最好的产品供应商全球性商业合作伙伴选择原平皓收获成功总 RNA 提取试剂盒 (TRIzol 法 ) 目录号 HF104 使用手册实验室使用, 仅用于体外

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3 总 RNA 提取试剂盒 (TRIzol 法 ) 目录号 :HF104 目录编号 HF HF 包装单位 20 次 50 次试剂盒组成储存稳定性 : 试剂盒组成保存 20 次 50 次 TRIpure 室温 20 ml 50 ml 氯仿室温 4ml 10 ml 异丙醇室温 10 ml 25 ml RNase-freeWater 室温 5 ml 13ml 75% 乙醇室温 20ml 50 ml 适用范围 : 适用于各种动植物组织 / 细胞总 RNA DNA 蛋白的快速抽提产品储存 : TRIpure 在室温下能稳定保存 12 个月,4 C 最佳重要提示 : 有毒物接触皮肤或者不慎吞服, 会导致灼伤一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗若感不适, 看医生并寻求苯酚和其他成分的正确治疗方案 - 1 -

4 产品介绍 : TRIpure 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性加入氯仿后离心, 样品分成水样层和有机层 RNA 存在于水样层中收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原在除去水样层后, 样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原乙醇沉淀能析出中间层的 DNA, 在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白共纯化 DNA 对于样品间标准化 RNA 的产量十分有用无论是人动物植物还是细菌组织, 该方法对少量的组织 (50-100mg) 和细胞 ( ) 以及大量的组织 ( 1g) 和细胞 (>10 7 ) 均有较好的分离效果 TRIpure 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品所有的操作可以在一小时内完成 TRIpure 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染故而能够作 RNA 印迹分析斑点杂交 poly(a)+ 选择体外翻译 RNA 酶保护分析和分子克隆如果是用于 PCR, 当两条引物位于单一外显子内时, 建议用扩增级的 DNase I 来处理抽提的总 RNA TRIpure 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种 RNA 的析出例如, 从大鼠肝脏抽提的 RNA 琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色, 可见许多介于 7 kb 和 15 kb 之间不连续的高分子量条带 (mrna 和 hnrna 成分 ), 两条优势核糖体 ~5 kb (28S) 和 ~2 kb(18s), 低分子量 RNA 介于 0.1 和 0.3 kb 之间 (trna, 5S) 当抽提的 RNA 用 TE 稀释时其 A260/A280 比值 1.8 注意事项 : 1. 当 TRIpure 用量少于 2ml 时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管 2. 当 TRIpure 用量较大时, 可以使用玻璃试管 (Corex) 或聚丙材质试管, 事先检验以确保该试管可以耐受加入 TRIpure 和氯仿后 12,000 g 的离心力不可使用有裂缝或者破损的试管 3. 离心前小心平衡试管 4. 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口, 聚丙烯管必须盖紧 5. 从少量的组织 (1~10mg) 或细胞 (10 2 ~10 4 ) 中分离 RNA 样品 : 往组织或细胞中加入 800µl TRIpure 待样品裂解后, 加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作在用异丙 - 2 -

5 醇沉淀 RNA 之前, 加入 5~10μg 无 RNA 酶的 glycogen 作为水样层的载体为降低其黏度在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组 DNA Glycogen 会留在水样层中并和 RNA 共析出在浓缩到 4mg/ml 之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制 PCR 6. 在匀化后和加入氯仿之前, 样品可以在 60~ 70 C 保存至少一个月 RNA 沉淀 ( 步骤 4,RNA 漂洗 ) 溶于 75% 的乙醇在 2~8 C 至少可以保存一周, 在 5~ 20 C 下至少可保存一年 7. 台式离心机最大能达到 2,600 g 的离心力, 如果将离心时间延长到 30~60 分钟可以满足步骤 2 和步骤 3 中的操作 RNA 抽提操作步骤 :( 实验前请先阅读注意事项 ) 提示 : 用 TRIpure 抽提 RNA 时要戴手套和护眼罩避免接触皮肤和衣服在化学通风橱完成操作, 避免呼吸道吸入. 如无例外, 所有的操作应该在在 15~30 C 的条件下实验所需试剂但未提供的物品 : 1. 氯仿 2. 异丙醇 3. 75% 乙醇 ( 用 DEPC 处理过的水配制 ) 4. 无 RNA 酶的水或 0.5% SDS 溶液调配无 RNA 酶的水将水加入无 RNA 酶的玻璃瓶中, 加入 DEPC 至 0.1% (v/v) 放置过夜并高压灭菌 SDS 溶液必须用 DEPC 处理过并经高压灭菌的水配制 1. 匀浆化作用 a. 组织用 glass 或强力匀浆器搅匀组织样品, 每 50~100mg 组织加 1ml 的 TRIpure 匀浆化时组织样品容积不能超过 TRIpure 容积的 10% b. 单层生长的细胞直接往直径 3.5 cm 的培养板中加入 1ml 的 TRIpure 溶解细胞, 通过移液管分次移 - 3 -

6 出细胞裂解物依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的 TRIpure 量 ( 每 10cm 2 加 1ml) 当 TRIpure 量不足时可导致抽提的 RNA 中污染有 DNA c. 悬浮生长的细胞通过离心来沉淀细胞在 TRIpure 试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞每 5~ 的动物细胞, 植物或酵母菌细胞或每细菌加 1ml 的 TRIpure 在加入 TRIpure 前应避免洗涤细胞, 因为那样会增加 mrna 降解的可能性破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器可选方案 : 当样品富含蛋白质, 脂肪, 多糖或是细胞外物质例如肌肉, 脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤匀浆化后在 2~8 C 的条件下以 12,000 g 的离心力离心 10 分钟, 移除匀浆中不溶解的物质, 余下的沉淀中包含有细胞外膜, 多糖, 以及高分子量 DNA, 而上层的超浮游物含有 RNA 在来自于脂肪组织的样品中, 大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉在每一个个案中, 将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并继续进行下述的分离步骤 2. 分离阶段将匀浆样品在 C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解每 1ml TRIpure 加 0.2ml 氯仿盖紧样品管盖, 用手用力摇晃试管 15 秒并将其在室温下孵育 2~3 分钟在 2~8 C 下以不超过 12,000 g 的离心力高速冷冻离心 15 分钟离心后混合物分成三层 : 下层苯酚 - 氯仿层, 中间层, 上层无色的水样层 RNA 无一例外地存在于水样层当中水样层的容量大约为所加 TRIpure 容量的 60% 3. RNA 的沉淀将水样层转移到一干净的试管中, 如果希望分离 DNA 和蛋白, 有机层同样要予以保留通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA 最初均化时的每 1ml TRIpure 对应 0.5ml 异丙醇将混合的样品在 C 条件下孵育 10 分钟并在 2~8 C 下以不超过 12,000 g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟 RNA 沉淀在离心前通常不可见, 形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底 4. RNA 的漂洗移去上层悬液用 75% 的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次, 每 1ml 的 TRIpure 至少加 1ml 的 - 4 -

7 75% 乙醇旋涡振荡混合样品并在 2~8 C 下以不超过 7,500 g 的离心力高速冷冻离心 5 分钟 5. RNA 的再溶解在操作的最后, 简单干燥 RNA 沉淀 ( 空气干燥或真空干燥 5~10 分钟 ) 不要在真空管里离心干燥 RNA 尤为重要的是, 不能让 RNA 沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性部分溶解的 RNA 样品其 A260/280 比值 <1.6 用移液管尖分几次移取无 RNA 酶的水或 0.5%SDS 溶液来溶解 RNA( 当 RNA 以后要用于酶切反应时, 避免使用 SDS ) RNA 还能被 100% 甲酰胺 ( 除去离子 ) 再溶解并保存在 70 C 问题与解决方法问题评论与建议 * 肝和脾,6~10μg 每 1mg 组织或培养细胞预期的 RNA 产量 * 肾,3~4μg * 骨骼肌和脑组织,1~1.5μg * 胎盘,1~4μg * 上皮细胞 ( cultured cells),8~15μg * 纤维母细胞 ( cultured cells),5~7μg 抽提得率低 * 样品均化或裂解不完全 * 终 RNA 不完全再溶解 * 在分光光度计测量前用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA 样品低离子强度和低 ph 溶液会增加 280nm 处的光吸收值 A260/A280 比率 <1.65 * 样品匀浆化时所加的 TRIpure 量太少 * 匀浆化后样品没有在室温下放置 5 分钟 * 分离的水样层中污染有苯酚层 * 终 RNA 没有完全溶解 - 5 -

8 问题评论与建议 * 从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存 * 用于抽提的样品, 或抽提的 RNA 样品保存于 5~ 20 C, 而不是存放于 RNA 降解 60~ 70 C * 细胞经胰酶消化而分散 * 水溶液或试管污染有 RNA 酶 * 用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林 ph 低于 3.5 * 样品匀浆化时所加的 TRIpure 量太少 DNA 污染 * 用于抽提的样品包含有机溶媒 ( 例如, 乙醇,DMSO), 强缓冲液, 或碱性溶液下述的对 RNA 沉淀方法 ( 步骤 3) 的改进能从抽提的 RNA 中移去复合污染以匀浆化时每 1ml TRIpure 为例, 在水样层中加入 0.25ml 异丙醇后蛋白多糖和多糖污染再加入 0.25ml 的高盐溶液 (0.8 M 柠檬酸钠和 1.2 M NaCl) 将终溶液混匀, 离心并继续进行前述的抽提操作改进后的沉淀法能有效地析出 RNA 而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中对于含有大量多糖的植物, 要抽提其 RNA 将改进后的沉淀法和在最初匀浆化时多加一次离心 (RNA 抽提指南, 可选方案 ) 合并使用是十分必要的 For Research Use Only. Not Intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use

TRIpure Reagent 抽提指南

TRIpure Reagent 抽提指南 TRIpure Reagent ( 总 RNA 提取试剂 ) 目录号 RN01 使用手册实验室使用, 仅用于体外 TRIpure Reagent( 总 RNA 提取试剂 ) 目录号 :RN01 目录编号包装单位 RN0101 50ml RN0102 100ml 适用范围 : 适用于各种动植物组织 / 细胞总 RNA DNA 蛋白的快速抽提产品储存 : TRIpure 在室温下能稳定保存 12 个月