第九讲能够传染致病的蛋白质粒子——普列昂 1、上寻常的诺贝尔奖获得者 1997年度诺贝尔奖生理及医学奖普鲁西纳博士（S.B.Prusiner）(美国加州大学会山分校医学院)表彰他在研究和发现一种新的蛋白质性质致病因子(普列昂)中所做的贡献引发传染病的罪魁祸首——病原物病源物传染病低等动物血吸虫血吸虫病绕虫绕虫病原生动物疟原虫疟疾睡眠虫嗜睡病变形虫阿米巴痢疾真菌（霉菌和酵母）霉菌皮肤、指甲真菌感染白假绿酵母鹅口疮肺组细胞浆首病细菌百日咳白喉破伤风风湿病肺炎痢疾炭疽伤寒鼠疫（anthrak）(typhoid) (plague) 梅毒淋病脓肿 (syphilrs)(gonorrhed)(abscessus) 结核 (tuberculisis) 立克次氏体斑症伤寒支原体类胸膜肺炎衣原体沙眼病毒流感、脊髓灰质炎（小儿麻痹症）腮腺炎肺炎麻疹（measles）天花肝炎狂犬病(rabies) 上述各种病源物的共同特点（它们都是生物）细胞形态生物：低等动物、原生动物、真菌、细菌、立克次氏体、衣原体非细胞形态生物：病毒一、作为病源物的细菌和病毒二、“病毒”引起的疾病三、普列昂的发现四、尚未结束的论争一、作为病源物的细菌和病毒 1、细菌是原核生物——单细胞、没有细胞核细菌很小，一般直径为0.5＊5u,大约为动、椊物细胞的几百分之一。细菌的细胞没有细胞核，属于原核细胞细菌的外形可以有很大变化因此有：球菌、杆菌、葡萄球菌等还有一种染色方法——革兰氏染色法——把细菌区分为两大类：革兰氏阳性菌 G+ 紫色金黄色葡萄球菌革兰氏阴性菌G＊粉红/黄大肠杆菌 2、病毒是非细胞形态微生物没有细胞结构最简单大拿病毒只有蛋白质分子和核酸分子组成，称为核衣壳有些结构夊杂的病毒，还有包膜包在核衣壳外面病毒为专性活细胞内寄生的生物病毒繁殖（夊制）在寄主细胞内进行以噬菌体为例：附着——识别过程浸染——病毒核酸合成病毒外壳蛋白质组装——形成一批子代病毒粒子裂解——寄主细胞破裂，释出病毒粒子病毒粒子直径约0.1微米（100nm）病毒仍然以核酸作为遗传物质细菌和病毒都符合公认是“中心法则” 二、“慢病毒”引起的疾病 18世纪冰岛羊搔痒病 1920s H.Creutzfieldt 人CJ病 A.Jacob s 巴布亚＊新几内亚 Kuru病 1980s 英国疯牛病对这类疾病的研究，以羊搔痒病为代表，困难很大：发病率低病程慢传染病/遗传病上清楚病因/病原物找上到人们智能猜想：有一种“慢病毒”在起作用三、普列昂的发现 1、以改进检测方法为突破点目标：分离、纯化病原物、并加以鉴定，每一步都离上开检测方法 2、得到难以公布的实验结果原来预期得到小型病毒结果，所有实验数据都表明，病原物是一种大分子，但上是核酸，而是蛋白质。1974＊年发表第一篇文章：提出羊搔痒病病原物是一种蛋白质。蛋白质性质感染颗粒（Proteinaceous Infectious Particle,Prion）普列昂概念的提出，引起轩然大波。许多人问：没有核酸，这个病原物如何增值？如何传染本身的遗传信息。许多人怀疑：可能还是存在核酸，只是未能检测出来。普鲁西纳回忆说：在寻找核酸上，D.Riesuer和我所花的功夫比其他任何人都多。 3、更深入的研究，更意外的结果，随着研究的深入，得到更多打破传统观念的结果：（1）寻找Prn＊p基因编码普列昂蛋白（PrP）D基因，上但在染病动物脑中存在，亦在正常动物脑中找到，而且表达得一样多。（2）普列昂蛋白（PrPsc）在正常动物脑的功能是什么？找上到答案。剔除PrP基因的遗传工程小鼠（PrP%）,看上出病症，似乎一切正常，亦正常生育。（3）PrP%小鼠作出贡献把染病小鼠的脑提取物接种给PrP%小鼠，后者上染病。同样的脑提取物，接种给普通小鼠PrP+/+，后者被染病。（4）对PrPc和PrPsc两种来源蛋白质做结构分析都是由2089氨基酸残基组成的疏水性很强糖蛋白氨基酸序列 RNA剪辑均无差别翻译后修饰（5）终于找到PrPc和PrPsc在高级结构上有巨大差别 PrPc PrPsc α＊螺旋％％ β＊折叠％％（6）PrPc和PrPsc在高级结构上的差别反映在两者在细胞内的行为和代谢特征 PrPc PrPsc 胞内定位细胞表面胞质内蛋白酶水解水解完全局部水解（2）综合上面得到的结果，提出一个理论设想：搔痒病的发生是因为PrPsc的入侵，把脑细胞中原来就有的PrPc“带坏”，是PrPc 重新折叠，形成新的高级结构，变成了PrPsc。增多的PrPsc形成淀粉样斑，造成脑细胞破坏，空斑出现。（8）蛋白质/蛋白质大分子间相互作用PrPsc使PrPc “带坏” 这个基本的理论设想，除了以上述实验为基础，还进一步得到以后实验支持。转染过程发病潜伏期用病仓鼠的PrPsc 感染小鼠天在小鼠中连续传代后天用病小鼠的PrPsc 感染仓鼠天在仓鼠中连续传代后天仓鼠PrPsc感染接受仓鼠PrP基48＊天因的转基因小鼠 MoPrPc —— SHaPrPc （9）与人有关的几种普列昂病 Family Creutzfield-Jakob Disedse(家族CJ病) Gerstmamann-Sträussler-Scheinleer Syndrem(GSS综合症) Fatal Familial Insomnis(家族性致死失眠症) 三种病都是神经退行性疾病都为显性遗传病都十分少见,FFI仅见于5个家族中现在都找到PrP基因突变。基因突变——氨基酸序列改变 ——容易出现PrPsc高级结构疯牛病的PrPsc可以使人致病四、争论还在继续 1、上少权威科学家仍持怀疑态度。怀疑的核心是否仅仅普列昂蛋白起病原物作用？是否还有未检出的核酸？ 2、普鲁西纳正在制药公司资助下，把研究转向治疗普列昂病药物的开发。美国巴尔的摩大厦中心分子神经病毒学主任R.G.Rowher：“诺贝尔奖可能有利于在此领域的深入研究”明尼苏达大学微生物系主任A.Haase:“诺奖委员会应等到确实证实仅仅是蛋白质本身在感染中起作用，没有其他因子参与，再授奖才合适。” 耶鲁医学院神经病理学主任L.Manuelidis:“诺奖的授予可能窒息上同观点的深入探讨。” 美国媒体报道标题：“美国科学家因一项有争议的研究或诺贝尔医学奖”

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耸宁
5 years ago
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1 A New Type of Pathogen - The Way to Prion

2 1997 Nobel Laureate in Medicine - Dr. Prusiner For his discovery of Prions - a new biological principle of infection

3 Dr. S. B. Prusiner 1968, Ph.D, Medical School of U. Penn. 1984,U. California, Dept. of Neurology 1997, Nobel Prize in Physiology or Medicine

4 Another related work by Gajdusek 1976, Nobel Prize for their discoveries concerning new mechanisms for the origin & dissemination 传播 of infectious diseases

5 Gajdusek visited Sichuan Univ. 2005

6 About Kuru 库鲁病, 新几内亚震颤病 Kuru: epidemic in New Guinea, especially in women & children No fever, inflammation 炎症, or immune reaction. not like contagious 传染性的 Developed damage to brain tissue Dying after 6-12 months, > 3,000 among 35,000 natives in 20 years

7 Gajduske studied Kuru Since 1950s Kuru related to ritual 与宗教仪式有关 1959, cannibalism 食人 forbidden by government 政府禁止仪式中的食人部分 Children born since then not suffer A few cases occurred: long latent period 潜伏期长?

8 More about Kuru Symptom 病症 Epidemic 流行规律 Slices of brain tissue 脑组织切片 Not Inheritance 遗传 Poisoning 中毒 Malnutrition 营养缺乏

9 Is Kuru contagious 库鲁病有传染性? Infect mouse with brain tissue no success Like Scrapie 羊搔痒病 Infect Chimpanzee: successful! Occurred in 1.5 year Kuru is contagious!

10 Other disease with similar symptom studied by Gajdusek 其他在症状上与 Kuru 相似的疾病 Creutzfeldf Jakob Low occurring rate: 1/106, but over the world Successfully infected chimpanzee & pig But all with latent period over 1 year

11 Spongioform encephalopathies 海绵状脑病 4 similar diseases infecting Primates 灵长类 1. Kuru 2. CJ 3. Scrapie 羊搔痒病 4. Mink Scrapie 水貂搔痒病 Question: Are four pathogens similar, or the same?

12 Spongioform empty spot in a CJ patient 病人脑组织中的海绵状空斑

13 Infection ways of four disease 感染途径 1. Kuru: ritual cannibalism 食人宗教仪式 2. CJ: medical stuff from patients 医务人员与病人接触 3. CJ Inheritance: parents to offspring 遗传 4. Animal infection: may obtained from foods 取食传染

14 Difficulty to identify the pathogen 寻找病源物遇到障碍 1. Pathogen can not be cultured 2. Chimpanzee is too expensive 3. Latent period is too long (1.5 year)

15 Characteristics of the pathogen 病原物的特性和本质 1. Heating, UV&anti-alkylant can t destroy it 加热紫外线抗烷化剂对 Kuru 病原物无作用 Effective to virus 2. No fever, no inflammation 不发烧无炎症 3. No antibody nor interferon produced 不产生抗体, 不产生干扰素 Different from virus!

16 Caidusek was awarded due to for their discoveries concerning new mechanisms for the origin and dissemination 传播 of infectious diseases Next breakthrough for Prusiner on the pathogen study?

17 The discovery of Prion

18 Prusiner s study Breakthrough: improvement of analysis method Goal: isolation & purification of pathogen Cannot be done without analysis

19 1st progress: Scrapie from sheep to mouse 第一个进步 : 把搔痒病从羊转至小鼠 Latent period: 3-5 yr 4-5 month

20 Check: 2rd Progress: analysis method End point titer analysis 终点滴度检测法 Brain tissue Titer maximum: 150 d Isolation & purification d 1 year Appearance of symptom 4-5 month

21 More improvement: Latent period analysis 潜伏期检测法 Common method End point titer analysis Improved method Latent period analysis 12 month 70 days 60 mouse 4 Hamster 仓鼠 Quicken by 100 times!!!

22 Results hard to be published Expected: small virus Results from experiment data: Pathogen: not small virus, no nucleic acid, but protein particle

His first publication on Scrapie 8 years of effort (1974-1982) 1982:

23 His first publication on Scrapie 8 years of effort ( ) 1982: the pathogen of Scrapie is Proteinoceous Infectious Particle (Prion)

24 A great disturbance! I doubt: there may be nucleic acid not detected? How the pathogen proliferate without nucleic acid? How the genetic information replicate?

25 KEY: Is there nucleic acid in prion? Dr. Riesuer and I have spent more time on looking for nucleic acid than anybody else - Prusiner

26 Nobel Lecture - Prions STANLEY B. PRUSINER. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95, pp , November 1998

27 Further investigation, more unexpected results! Looking for Prn-p gene coding Prion PrP exists not only in infected animals, but also in normal ones With the same amount of expressed products

28 PrP c PrP sc 正常小鼠得病小鼠 PrP protein not only exists in the infected mouse; PrP sc is not regulated by regulator

29 Function of PrP c in normal animal? 普列昂蛋白在正常动物脑中的功能 No answer after many experiments PrP % with PrP deleted shows no symptom, and can replicate

30 染病小鼠脑提取物 PrP % 小鼠 PrP +/+ 小鼠 Conclusion: the existence of PrP c is required for the infection

31 Character of PrP c Consists of 208 amino acids, MW 33~35 kd Signal peptide of 22 amino acids on N terminal N 端有 22 个氨基酸残基组成的信号肽序列 GPI Receptor binding site of 23 amino acids on C terminal is a membrane-binding protein on CLDs C 端有由 23 个氨基酸残基组成的糖基磷酸肌醇锚 (GPI) 受体结合位点, 说明 PrP c 是一种膜结合蛋白, 并定位于细胞膜的穴样内陷类结构 (CLDs)

32 糖基磷脂肌醇锚的核心结构

Comparison of 1st structure PrP c 与 PrP Sc 一级结构比较 Both

两者由同一基因编码, 其氨基酸序列完全相同 No difference of covalent

difference of secondary structure found 利用傅立叶

33 Comparison of 1st structure PrP c 与 PrP Sc 一级结构比较 Both are coded by the same gene with the same AA sequence 两者由同一基因编码, 其氨基酸序列完全相同 No difference of covalent modification 比较研究发现 PrP Sc 与 PrP c 两者并无共价修饰的区别 But big difference of secondary structure found 利用傅立叶 (Fourier) 转换红外光谱和圆二色对两者结构比较发现两者的二级结构有很大区别 PrP c 与 PrP Sc 在高级结构上明显不同!

34 Structural comparison of PrP c & PrP Sc PrP c 有 4 个 α- 螺旋, (40%) 无 β- 折叠 (3%) PrP Sc : 有 2 个 α- 螺旋 (21%) 有 4 个 β- 折叠 (54%)

35 PrP c 和 PrP sc 在高级结构上的差别, 在细胞内蛋白质的行为和代谢特征上也反映出来胞内定位 PrP c PrP sc 都依赖 GPI 附着在细胞膜表面磷酸肌醇磷脂酶 C (PIPLC) 酶解后从膜上释放不释放蛋白酶水解水解完全局部水解

36 Protein Protein interaction 蛋白质 - 蛋白质相互作用带坏 : Possible models 几种可能的模型

37 Proposed model of PrP Sc infection PrP Sc 转染机理的假设模型 Model 1: PrP c PrP* PrP*-PrP Sc PrP Sc catalysis

38 Similar proposed model of PrP Sc infection PrP Sc 转染机理的相似假设模型 PrP C PrP Sc

39 模型二 : Model 2: PrP Sc Infection PrP Sc 转染机理的假设模型 AA Mutation of PrP Sc? PrP Sc?

40 Similar proposed model: PrP Sc infection PrP Sc 转染机理的相似假设模型

41 转变在膜筏区进行

42 深入 : 普利昂相关分子 Prusiner 等在利用转基因鼠研究朊病毒繁殖过程中发现, 除 PrP 外可能还有别的蛋白分子参与 PrP Sc 的形成, 此蛋白分子被命名为蛋白质 X 突变分析发现在 PrP c 分子结构表面, 第 ,214 和 218 位氨基酸残基形成与蛋白质 X 的结合位点

43 Using Yeast to study prions Proved prion is a protein Yeast Prion Sup35, at right a magnified image.

44 Could RNA interfere with prion disease? Genetic treatment shows promise against scrapie Nature, Dec About 65% of prion genes need to be turned off to protect against scrapie.

45 英国官方统计

46 正在火化病牛以防止疯牛病的传播

47 Control of CJD Surveillance of bovine health Elimination of sick animals Banning of cow components subject to infection Ban on cows older than 30 months (no exposure to BSE in feeds)

48 一方面, 对普利昂病的研究不断进展, 另一方面, 普利昂病对人类的进攻继续扩展 ; 2003 年 12 月美国初次发现疯牛病病牛, 2004 年 1 月证实来自加拿大, 2004 年 1 月 12 日联合国粮农组织呼吁, 要各国采取更加严格的措施预防疯牛病人类与疾病的斗争就是这样一个永无休止的过程

49 185,000 in British by 2005

50 How to identify mad cows disease?

a P 700 P 680 a a Pq cytochrome Pc Fd H + ATP 酶 ATP ATP a a ATP H 2 OCO 2 H 2 O CO 2 CO 2 CO 2 CO 2 RuBP carboxylase 2

1000016 h t t p : / / w w w. k n s i. c o m. t w 248 30 (02)2299-9006 (02)2299-9110. 100 KANG SI 第一期 vol.1 P.1 P.4 P.7 P.8 99 99 99 ( ) -- ATP 1 a P 700 P 680 a a Pq cytochrome Pc Fd H + ATP 酶 ATP ATP