检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 Laboratory Medicine,May 2017,Vol. 32,No 肺结核 (pulmonary tuberculosis,tb) 是一种慢性感染性疾病, 也是一种慢性炎症性疾病由于耐药性结核菌的传播人类免疫缺陷

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1 394 检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 Laboratory Medicine,May 2017,Vol. 32,No. 5 文章编号 : (2017) 中图分类号 :R 文献标志码 :A DOI : /j.issn 活动性肺结核患者外周血产 IL-37b 淋巴细胞比例增加及其临床意义刘淦斌 1, 张俊爱 2, 代友超 2, 庄泽岗 3, 陈晨 3, 易来龙 1 2, 徐军发 (1. 东莞市第六人民医院, 广东东莞 ;2. 广东医科大学检验医学研究所, 广东东莞 ; 3. 广东省医学分子诊断重点实验室, 广东东莞 ) 摘要 : 目的检测活动性肺结核 (ATB) 患者外周血产白细胞介素 37b(IL-37b) 淋巴细胞比例, 探讨其临床意义方法采用流式细胞术对 42 例 ATB 患者外周血产 IL-37b 淋巴细胞进行检测, 并对 8 例患者进行治疗后跟踪检测, 以 10 名健康志愿者作为对照组结果 ATB 患者外周血产 IL-37b 淋巴细胞比例明显高于对照组, 8 例跟踪患者治疗后产 IL-37b 淋巴细胞比例显著下降 ; 结核抗体阳性患者外周血产 IL-37b 淋巴细胞比例高于结核抗体阴性患者 ; 痰涂片阳性患者产 IL-37b 淋巴细胞比例显著高于痰涂片阴性患者 ; 复治 ATB 患者产 IL-37b 淋巴细胞比例显著高于初治患者体外卡介苗刺激可致人外周血单个核细胞 (PBMC) 中产 IL-37b 淋巴细胞比例显著增加, 且在 ATB 组增加更显著结论 ATB 患者外周血中产 IL-37b 淋巴细胞比例增加与 ATB 的严重程度及预后相关, 检测外周血产 IL-37b 淋巴细胞比例有可能成为 ATB 疗效评估的指标关键词 : 白细胞介素 37b; 淋巴细胞 ; 流式细胞术 ; 活动性肺结核 Elevation of interleukin-37b-producing lymphocyte proportion in patients with active pulmonary tuberculosis LIU Ganbin 1,ZHANG Junai 2,DAI Youchao 2,ZHUANG Zegang 3,CHEN Chen 3,YI Lailong 1,XU Junfa 2. (1. Dongguan Sixth People's Hospital,Dongguan ,Guangdong,China;2. Institute of Laboratory Medicine,Guangdong Medical University,Dongguan ,Guangdong,China;3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Medical Molecular Diagnostics,Dongguan ,Guangdong,China) Abstract:Objective To investigate the proportion of interleukin (IL)-37b-producing lymphocytes in patients with active pulmonary tuberculosis (ATB). Methods IL-37b-producing lymphocytes in peripheral blood from 42 patients with ATB were determined by flow cytometry,and the 8 patients were followed up. A total of 10 healthy subjects were enrolled as healthy control group. Results The proportion of IL-37b-producing lymphocytes in patients with ATB was higher than that in healthy control group,and it was decreased after treatment in the 8 followed-up patients. The proportion of IL-37b-producing lymphocytes in patients with positive tuberculosis antibody and positive sputum smear were higher than those in patients with negative tuberculosis antibody and negative sputum smear,respectively. The proportion of IL-37b-producing lymphocytes in patients received treatment again was higher than that in patients received initial treatment. The proportion of IL-37b-producing lymphocytes in peripheral blood mononuclear cell (PBMC)increased after the stimulation by bacillus Calmette-Guerin vaccination,especially for ATB patients. Conclusions The proportion of IL-37b-producing lymphocytes in patients with ATB is correlated with the severity and prognosis of ATB. The proportion of IL-37b-producing lymphocytes might be a parameter for evaluating the curative effect in ATB. Key words:interleukin-37b;lymphocytes;flow cytometry;active pulmonary tuberculosis 基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( ); 广东省自然科学基金项目 (2015A ); 广东医科大学面上培育项目 (2XK14058) 作者简介 : 刘淦斌, 男,1981 年生, 学士, 主治医师, 主要从事结核免疫研究通信作者 : 徐军发, 联系电话 :

2 检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 Laboratory Medicine,May 2017,Vol. 32,No 肺结核 (pulmonary tuberculosis,tb) 是一种慢性感染性疾病, 也是一种慢性炎症性疾病由于耐药性结核菌的传播人类免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus,hiv) 的感染环境因素等原因致使结核病的发病率在我国居高不下, 目前缺乏有效的抗结核病新药和可预防成人结核病发病的疫苗, 而免疫治疗得到了认可 [1] 有研究显示, 结核病患者均存在继发性免疫功能低下和固有免疫功能不足 [2], 但其机制尚未完全清楚白细胞介素 37b(interleukin-37b,IL-37b) 是 IL-1 家族成员 7(IL-F7) [3], 在人外周血及部分组织中均有表达 [4-6] 最近研究显示, 在特应性皮炎患者血浆中其含量明显高于健康者 [7], 在乙型肝炎 [8] 患者和急性冠状动脉综合征患者血浆中也明显升高 [9] ;HIV 感染者 IL-37 升高明显, 其升高水平与体内 HIV 载量呈正相关 [10] 我们之前的研究结果显示, 活动性肺结核 (active pulmonary tuberculosis,atb) 患者血浆 IL-37b 水平升高, 并与疾病的严重程度密切相关 [11] 但 ATB 患者血浆 IL-37b 的来源以及 IL-37b 在外周血细胞中的表达情况迄今未见报道本研究利用流式细胞术检测 ATB 患者外周血产 IL-37b 淋巴细胞比例, 探讨该群细胞在 ATB 中的临床意义 1 材料和方法 1.1 研究对象 42 例 ATB 患者, 男 20 例, 女 22 例, 年龄 (37.60±11.54) 岁, 均为东莞市第六人民医院住院患者, 患者依据彭卫生主编的新编结核病学的诊断标准纳入, 所有患者无合并糖尿病肝炎肾炎 HIV 感染以及自身免疫性疾病, 患者近期未使用免疫调节剂,42 例患者入院时为治疗前组, 对其中 8 例患者进行为期 3 周的治疗后跟踪研究, 该 8 例患者为随机抽取的患者选择 10 名健康志愿者作为对照组, 男女各 5 名, 年龄为 (35.56±10.76) 岁, 所有参与者胸透检查正常, 近期无结核病接触史, 结核菌素皮肤试验 (tuberculin skin test,tst) 阴性, 血常规检测未见异常本研究经广东医科大学道德伦理委员会的批准, 并征得研究对象的知情同意 1.2 试剂及仪器鼠抗人 I L b 单克隆抗体 ( L i f e S p a n B i o S c i e n c e s ) ; 异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠 IgG 二抗 (BD Biosciences);Fixation/ Permeabilization kit(bd Biosciences); 卡介苗 ( 由广东医科大学检验医学研究所保存 ); 淋巴细胞分离液 ; 结核分枝杆菌抗体检测试剂盒 ( 胶体金法, 广州健仑生物科技有限公司 ); Canpo2 型流式细胞仪 (BD Biosciences) 1.3 方法临床样本的收集及处理样本由东莞市第六人民医院结核病区医护人员协助收集, 抽取患者空腹外周静脉血 10 ml, 抽血后 6 h 内处理 ATB 患者入院时抽取 1 次血样, 为治疗前样本 ; 在治疗 3 周后再次抽样, 为治疗后样本在常温吸取血浆保存后, 加入与剩余血液等量的磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline, PBS) 混匀后叠加到淋巴细胞分离液上, 以 800 g 离心 20 min, 吸取白膜层为外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell,pbmc), 用 PBS 洗涤 1 次以备后续实验使用流式细胞术检测外周血产 IL-37b 淋巴细胞的数量取以上 PBMC, 调整细胞数为个细胞, 利用 Fixation/Permeabilization kit 破膜 20 min, 洗涤后在 100 µl 体系中加入抗人 IL-37b 单克隆抗体, 常温孵育 30 min; 洗涤后加入异硫氰酸荧光素标记的二抗, 常温避光孵育 20 min; 洗涤后用 2% 多聚甲醛溶液固定, 待上机检测卡介苗活菌对 PBMC 的刺激实验将 PBMC 加入 24 孔板中, 调整细胞为个细胞 / 孔, 加入卡介苗活菌体外刺激 PBMC 培养 3 d (MOI=10 1) 收集细胞, 采用流式细胞术检测产 IL-37 淋巴细胞患者临床相关指标的检测及分组患者入院时检测外周血结核分枝杆菌抗体取清晨痰液做痰涂片, 痰涂片 3 次未找到结核分枝杆菌为痰涂片阴性,3 次之中有 1 次找到结核分枝杆菌即为痰涂片阳性初治患者为首次诊断及治疗的患者, 复治患者为结核病复发再次治疗的患者根据以上临床指标, 按结核抗体检测结果将患者分为结核抗体阳性组 (11 例 ) 和结核抗体阴性组 (24 例 ); 按痰涂片结果分为痰涂

3 检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 396 Laboratory Medicine May 2017 Vol. 32 No. 5 片阳性组 14例和痰涂片阴性组 21例结核分枝杆菌痰涂片阳性患者产IL- 按治疗情况分为初治组 16例和复治组 16 37b淋巴细胞比例 0.10%±0.02% 明显高于例个别患者因临床资料欠缺未纳入相应的痰涂片阴性患者 0.04%±0.01% t=2.624 分组 P= 见图2 1.4 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计用t检验或配对t检验进行2组间的分析采用GraphPad Prism 5.0作图以P<0.05为差异有统计学意义结果各组外周血产IL-37b淋巴细胞比例的比较 4 2 例 AT B 患者外周血产 I L b 淋巴细胞的比例 0.08%±0.06% 明显高于对照组 0.03%±0.05% t=2.463 P= 其中8例患者经治疗3周后产IL-37b淋巴细胞的比例由0.11%±0.02%明显下降为 0.03%±0.02% t=3.622 P= 见图1 注 a 产IL-37b淋巴细胞在ATB患者各临床分组中的比例流式图 b ATB初治患者与复治患者产IL-37b淋巴细胞比例的比较 c ATB结核抗体阳性患者与抗体阴性患者产IL37b淋巴细胞比例的比较 d ATB结核分枝杆菌痰涂片阳性患者与阴性患者产IL-37b淋巴细胞比例的比较图2 a 注 a 产IL-37b淋巴细胞在ATB组/对照组 M0/M1中的比例流式图 b ATB患者与对照者产IL-37b淋巴细胞比例的比较 c ATB患者治疗前后产IL-37b淋巴细胞比例的比较图1 2.2 ATB患者和对照者外周血中产IL-37b 不同临床类型ATB患者产IL-37b淋巴细胞比例的比较 2.3 不同ATB临床类型患者产IL-37b 淋巴细胞比例的比较 PBMC体外经卡介苗活菌刺激后产IL-37B ATB患者PBMC经过卡介苗活菌刺激3 d后产 IL-37b淋巴细胞比例由0.08%±0.02%明显升高至 0.21%±0.07% t=3.601 P= 对照组的PBMC经过卡介苗活菌刺激3 d后产il-37b淋巴细胞比例由0.03%±0.01%升高至0.08%±0.05% 复治患者产IL-37b淋巴细胞比例 0.09% ± 但差异无统计学意义 t=2.003 P= % 明显高于初治患者 0.04% ±0.01% ATB患者PBMC经过卡介苗活菌刺激后产IL-37b t=2.540 P= 结核抗体阳性患者产IL- 淋巴细胞比例升高的水平 0.21%±0.07% 明 37b淋巴细胞比例 0.11%±0.03% 明显高于结显较对照组刺激后 0.08%±0.05% 更为明显核抗体阴性患者 0.05%±0.01% t=2.782 P= t=3.348 P= 见图3

4 检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 Laboratory Medicine,May 2017,Vol. 32,No 注 :(a) 产 IL-37b 淋巴细胞比例体外刺激后增高流式图 ; (b)atb 患者 PBMC 体外刺激前后产 IL-37b 淋巴细胞比例的比较 ;(c) 对照组的 PBMC 体外刺激前后产 IL-37b 淋巴细胞比例的比较 ;(d)atb 患者与对照者的 PBMC 体外刺激后产 IL-37b 淋巴细胞比例的比较图 3 体外卡介苗活菌刺激后 ATB 患者产 IL-37b 3 讨论本研究结果显示,ATB 患者外周血产 IL-37b 淋巴细胞比例显著增加, 治疗后下降, 且复治患者明显高于初治患者, 结核分枝杆菌痰涂片阳性患者明显高于痰涂片阴性患者, 结核抗体阳性患者明显高于结核抗体阴性患者提示结核病的发生和疾病转归与产 IL-37b 淋巴细胞比例增加具有密切关系 I L 是最近发现的抑炎细胞因子, 主要由单核细胞树突状细胞自然杀伤 (natural killer,nk) 细胞浆细胞等产生有研究发现,IL-37 可来源于 PBMC, 脂多糖 (lipopolysaccharide,lps) 刺激可明显上调 PBMC 表达 IL-37 [12],Toll 样受体激动剂也可上调 IL-37 表达 [6] 另有研究显示, CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞可在胞浆中表达 IL-37,CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞活性越强,IL-37 表达水平越高 [13] 已经发现炎性肠病患者外周血及组织中 B 细胞 NK 细胞及单核细胞均有 IL-37 表达增高 [14], 另外在 IL-37 转基因动物模型中也发现 IL-37 可抑制 LPS 刺激后树突状细胞的活性 [15] 但有关 IL-37 在肺结核患者外周血中表达的报道较少, 我们以往研究发现 ATR 患者血浆 IL-37b 水平升高 [11] 但有关肺结核患者外周血 IL-37b 的来源尚未见报道有研究发现结核分枝杆菌抗原刺激可诱导 A549 细胞表达 IL-37 [16], 本研究结果发现 ATB 患者外周血中产 IL-37b 的单核细胞显著升高 ( 结果待发表 ) 迄今, 有关淋巴细胞产生 IL-37b 的报道比较少, 本研究结果显示 ATB 患者 PBMC 中产 IL-37b 的淋巴细胞比例显著高于对照组, 且患者 PBMC 中产 IL-37b 的淋巴细胞比例与患者的病情及治疗密切相关, 说明 IL-37b 参与了结核病的免疫调节过程本研究在体外利用卡介苗活菌刺激 ATB 患者 PBMC, 结果显示卡介苗活菌可使正常人和 ATB 患者 PBMC 中产 IL-37b 的淋巴细胞比例升高, 且 ATB 患者 PBMC 中表达 IL-37b 的淋巴细胞比例升高更为显著, 大约是正常人的 2 倍以上, 以上结果提示结核分枝杆菌可以在体外刺激人外周血淋巴细胞产生 IL-37b, 但对正常人的刺激作用较弱, 原因可能是结核分枝杆菌具有非特异性刺激和特异性刺激淋巴细胞产生 IL-37b 的双重作用卡介苗活菌是减毒的结核分枝杆菌, 具有细菌完整的细胞壁成分, 包括非特异性刺激淋巴细胞反应的刺激物, 同时卡介苗活菌也具有结核分枝杆菌大部分抗原, 可以刺激抗原特异性淋巴细胞本研究选择的正常人对照组 TST 均为阴性, 因此可以推测体外卡介苗活菌对人外周血淋巴细胞的刺激既有非特异性刺激也有特异性刺激, 导致患者 PBMC 受刺激后产 IL-37b 的淋巴细胞比例升高更为显著此外, 本研究结果也显示产 IL-37b 淋巴细胞数量与 ATB 患者的临床指标及实验室检查结果相关联复治患者由于结核分枝杆菌在体内存在时间较长或治疗不规范导致产 IL-37b 的淋巴细胞比例高于初治患者痰涂片阳性患者产 IL-37b 的淋巴细胞比例高于痰涂片阴性患者, 也提示结核分枝杆菌持续刺激可致产 IL-37b 的淋巴细胞数量增加因此, 结核分枝杆菌感染可致肺结核患者 T 细胞表达 IL-37b, 可能是结核分枝杆菌感染导致机体免疫抑制的机制之一

5 398 检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 Laboratory Medicine,May 2017,Vol. 32,No. 5 综上所述, 结核分枝杆菌感染致 ATB 患者 PBMC 中产 IL-37b 的淋巴细胞比例显著增加, 且与疾病病情和治疗效果关系密切, 提示诱导机体产生 IL-37b 可能是结核分枝杆菌逃逸机体免疫攻击的机制之一, 而检测产 IL-37b 淋巴细胞比例有可能成为 ATB 病情判定及疗效评估的辅助指标参考文献 [1] 中国防痨协会临床专业委员会. 结核病临床诊治进展年度报告 (2012 年 )( 第二部分结核病临床治疗 )[J]. 中国防痨杂志,2013,35(7): [2] H E R N A N D E Z - PA N D O R, O R O Z C O H, AGUILAR D. Factors that deregulate the protective immune response in tuberculosis[j]. Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2009,57 (5): [3] SMITH D E,RENSHAW B R,KETCHEM R R, et al. Four new members expand the interleukin-1 superfamily[j]. J Biol Chem,2000,275(2): [4] BULAU A M,NOLD M F,LI S,et al. Role of caspase-1 in nuclear translocation of IL-37,release of the cytokine,and IL-37 inhibition of innate immune responses[j]. Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111 (7): [5] LUO Y,CAI X,LIU S,et al. Suppression of antigen-specific adaptive immunity by IL-37 via induction of tolerogenic dendritic cells[j]. Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(42): [6] QUIRK S,AGRAWAL D K. Immunobiology of IL- 37: mechanism of action and clinical perspectives[j]. Expert Rev Clin Immunol,2014,10(12): [7] FUJITA H,INOUE Y,SETO K,et al. Interleukin- 37 is elevated in subjects with atopic dermatitis[j]. J Dermatol Sci,2013,69(2): [8] LI C,JI H,CAI Y,et al. Serum interleukin-37 concentrations and HBeAg seroconversion in chronic HBV patients during telbivudine treatment[j]. J [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] Interferon Cytokine Res,2013,33(10): JI Q,ZENG Q,HUANG Y,et al. Elevated plasma IL-37,IL-18,and IL-18BP concentrations in patients with acute coronary syndrome[j]. Mediators Inflamm,2014,2014: HØJEN J F,RASMUSSEN T A,ANDERSEN K L,et al. Interleukin-37 expression is increased in chronic HIV-1-infected individuals and is associated with inflammation and the size of the total viral reservoir[j]. Mol Med,2015,21: 张俊爱, 刘淦斌, 曾今诚, 等. 活动性肺结核患者血浆 IL-37 的检测及其临床意义 [J]. 细胞与分子免疫学杂志,2015,31(4): JACQUIER V,ESTELLE J,SCHMALTZ- PANNEAU B,et al. Genome-wide immunity studies in the rabbit: transcriptome variations in peripheral blood mononuclear cells after in vitro stimulation by LPS or PMA-ionomycin[J]. BMC Genomics,2015, 16:26. S H U A I X, W E I - M I N L, T O N G Y L, et al. Expression of IL-37 contributes to the immunosuppressive property of human CD4+CD25+ regulatory T cells[j]. Sci Rep,2015,5: FONSECA-CAMARILLO G,FURUZAWA- CARBALLEDA J,YAMAMOTO-FURUSHO J K. Interleukin 35 (IL-35) and IL-37:intestinal and peripheral expression by T and B regulatory cells in patients with inflammatory bowel disease[j]. Cytokine,2015,75(2): 吴万通, 罗悦晨, 王伟强, 等. IL-37 抑制脂多糖诱导的小鼠树突状细胞活化 [J]. 细胞与分子免疫学杂志,2015,31(4): HUANG Z,ZHAO G W,GAO C H,et al. M a n n o s e - c a p p e d l i p o a r a b i n o m a n n a n f r o m Mycobacterium tuberculosis induces IL-37 production via upregulating ERK1/2 and p38 in human type Ⅱ alveolar epithelial cells[j]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(5): ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 姜敏 )

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检验医学 2017 年 5 月第 32 卷第 5 期 Laboratory Medicine,May 2017,Vol. 32,No 肺结核 (pulmonary tuberculosis,tb) 是一种慢性感染性疾病, 也是一种慢性炎症性疾病由于耐药性结核菌的传播人类免疫缺陷