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支杜
7 years ago
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1 同等学力人员硕士学位论文论文题目继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究研究生姓名指导教师姓名专业名称研究方向论文提交日期陈兴年凌春华呼吸内科感染性疾病 2014 年 3 月

5 继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究中文摘要继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究中文摘要目的结核病 (Tuberculosis,TB) 是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 感染引起的慢性传染性疾病, 主要发生在肺部, 是世界上分布最广最古老的的一种疾病虽然继发性肺结核在肺结核疾病中占比较大的比例, 但关于继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清中炎症相关细胞因子的研究较少本研究检测血清白介素 1(IL-1) 白介素 2 受体 (IL-2R) 白介素 6(IL-6) 白介素 8(IL-8) 白介素 10(IL-10) 肿瘤坏死因子 α(tnf-α) 等在继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者的含量, 并探讨其可能的临床意义方法采用酶联免疫方法 (ELISA) 检测 71 例继发性肺结核患者和 21 例对照组血清中 IL-1 IL-2R IL-6 IL-8 IL-10 和 TNF-α 的水平变化 ; 采用 ELISA 检测 11 例非结核分枝杆菌肺病患者和 14 例对照组血清中 IL-1 IL-2R IL-6 IL-8 IL-10 TNF-α 和 PCT 的水平变化结果 1 与对照组相比较, 继发性肺结核组血清中 sil-2r 和 TNF-α 的含量明显升高 (P<0.01), 而 IL-1 IL-6 IL-8 和 IL-10 的含量无明显变化 (P>0.05) 进一步分析结果显示, 继发性肺结核组血清中 sil-2r 的含量与抗酸杆菌的数量有关 (P<0.05), IL-10 的含量在有空洞的继发性肺结核患者血清中明显升高 (P<0.05) 2 与对照组相比较, 非结核分枝杆菌肺病组血清中 TNF-α 的含量明显升高 (P<0.05), 而 IL-1 IL-2R IL-6 IL-8 IL-10 和 PCT 等五个细胞因子的含量无明显变化 (P>0.05) 进一步分析结果显示, 非结核分枝杆菌肺病组血清中 TNF-α 等六个细胞因子的含量变化与是否空洞无关 (P>0.05) I

6 中文摘要继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究结论 1 血清 TNF-α sil-2r 和 IL-10 可作为继发性肺结核感染严重程度诊断的主要指标, 具有重要的研究价值 2 TNF-α 在非结核分枝杆菌肺病的感染和形成过程中起着非常重要的作用, 是非结核分枝杆菌肺病感染的重要指标关键词 IL-2R; 继发性肺结核 ; 非结核分枝杆菌肺病 ;TNF-α;IL-10 作者 : 陈兴年指导老师 : 凌春华 II

7 继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究英文摘要 The clinical study of serum cytokines in patients with secondary tuberculosis and nontuberculous mycobacteria disease Abstract Objective Tuberculose is a chronic infectious disease induced by mycobacterium tuberculosis infection, which is mainly occurred in the lung tissue, and is considered to be a most ancient and most distributed disease in the world. Although secondary tuberculosis accounts for a major rate of patients with tuberculosis, the serum inflammatory cytokines in patients with secondary tuberculosis and nontuberculous mycobacteria disease are largely unknown. Therefore, our study is aimed to investigate the serum IL-1, IL-2R, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α and PCT levels in patients with secondary tuberculosis and nontuberculous mycobacteria disease and their clinical significance. Methods The serum contents of IL-1, sil-2r, IL-6, IL-8, TNF-α and IL-10 were examined in 71 patients with secondary tuberculosis and 21 controls using ELISA assay. The serum contents of IL-1, IL-2R, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α and PCT were examined in 11 patients with nontuberculous mycobacteria disease and 14 controls. Results 1. The serum sil-2r and TNF-α levels in patients with secondary tuberculosis significantly increased compared with the controls (P<0.01), however, the serum IL-1 and IL-10 contents were not greatly affected (P>0.05). Further analysis showed that changes of serum sil-2r in patients with secondary tuberculosis correlated with the number of acid fast bacilli (P<0.05), and the IL-10 contents in patients of secondary tuberculosis with cavity greatly increased compared with those without cavity (P<0.05). III

8 英文摘要继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究 2. The serum TNF-α levels in patients with nontuberculous mycobacteria disease significantly increased compared with the controls (P<0.05), however, the serum IL-1, IL-2R, IL-6, IL-8, IL-10, and PCT were not greatly affected (P>0.05). Further analysis showed that changes of serum IL-1, IL-2R, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α and PCT in patients with nontuberculous mycobacteria disease did not correlated with cavity (P>0.05). Conclusion 1. The serum TNF-α, sil-2r and IL-10 levels may be a set of valuable marks for the diagnosis and progression of secondary tuberculosis infection. 2. The serum TNF-α level is significantly increased in patients with nontuberculous mycobacteria disease, which may contribute to the diagnosis of nontuberculous mycobacteria disease infection. Key words IL-2R;secondary tuberculosis;nontuberculous mycobacteria disease; TNF-α;IL-10 Written by Chen Xing-nian Supervised by Ling Chun-hua IV

9 目录引言...1 第一部分继发性肺结核患者血清中细胞因子的测定及其临床意义... 6 材料与方法... 7 实验结果... 9 讨论第二部分非结核分枝杆菌肺病患者血清中细胞因子的测定及其临床意义材料与方法实验结果讨论结论与展望...21 参考文献...22 综述...29 参考文献英文缩略词...40 攻读硕士学位期间发表的论文...41 本研究获得的基金支持...42 致谢...43

11 继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究引言引言结核病 (Tuberculosis,TB) 是由结核分支杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 感染引起的慢性传染性疾病, 主要发生在肺部, 是世界上分布最广最古老的的一种疾病结核病曾经在全世界流行, 引起数亿人的死亡 1950 年起, 多种抗结 [1] 核药物的出现有效地控制了结核病的流行然而, 由于多数国家不重视, 因此, 在三十多年前, 结核病出现第三次全世界性的大流行由于结核病独特的社会因素和医学特性, 近年来结核病已日益威胁到人类的健康根据世界卫生组织测算, 全世界约 1/3 的人口已感染了结核杆菌, 照这一趋势, 未来十年内将会有三亿新发结核杆菌感染病例据统计, 全球的结核病患者共有约两千万, 此外每年将有万新发 [2, 3] 结核病, 每天约有 8000 人死于结核病中国的结核病现状也不容忽视据世界卫生组织统计, 中国的结核病人数位居全 [4] 世界第二位, 仅次于印度, 是世界上 22 个结核病高发的国家之一 2000 年第四次全国结核病流行病学抽样调查显示, 中国约有 5.5 亿人感染过肺结核, 现有活动性和涂阳肺结核的患病率分别为 367/10 万和 122/10 万, 估算全国有活动性肺结核病人 500 万, 其中涂阳结核病人 150 万 ; 每年约有 13 万人死于结核病, 死亡平均年龄为 55.2 岁结核病疫情在经济不发达的中西部地区最高, 比经济发达的东部沿海省份高 2 倍 ; 农村人口的活动性和涂阳肺结核患病率分别为 397/10 万和 131/10 万, 均高于城市城 [2, 3, 5, 6] [6] 镇人口结核病是我国农村因病致贫因病返贫的主要疾病之一非结核分枝杆菌 (nontuberculous mycobacteria,ntm) 是分枝杆菌属内除 MTB 复合 [7] 群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌迄今为止, 共发现 154 种 NTM 和 13 个亚种, 大部分为腐物寄生菌, 仅少部分对人体致病 NTM 可以侵犯人体肺脏淋巴结骨骼 [8, 9] 关节皮肤和软组织等组织器官, 并可引起全身播散性疾病近年来, 国内外非结 [10] 核分支杆菌病疫情呈现上升趋势, 甚至有可能超过结核病由于 NTM 在自然界广泛存在, 大部分是腐物寄生菌, 人主要从环境中的水土壤和气溶胶感染 NTM 而患病, 极少数通过动物传播给人从总的趋势上来说, 我们南方非结核分支杆菌病高于北方, 沿海高于内地, 气候温和地区高于寒冷地区平原与沿海无显著差异, 而平原 [11] 与山区沿海与山区则有极显著差异, 呈现沿海平原高于山区的势态 1

12 引言继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究继发性肺结核为成年结核中最常见的类型包括浸润病变干酪病变增殖病变 [12] 空洞病变结核球以及纤维钙化等多种不同性质的病变继发性肺结核目前主要包括浸润型和纤维空洞型肺结核是由结核杆菌引起的机体炎症反应和变态反应共存的呼吸道传染病结核杆菌侵入人体后, 结核杆菌抗原刺激肺内巨噬细胞受体, 巨噬细胞分泌大量细胞因子, 机体既介导炎症反应发生, 发挥防御作用, 又介导变态反应 [13] 出现, 造成机体的免疫损伤和肺组织的破坏结核病和非结核分枝杆菌病在一定程度上都属于免疫紊乱性疾病, 存在多种细胞因子的异常变化近年来, 随着细胞和分子免疫学的进展, 对有关细胞因子在结核病和非结核分枝杆菌病免疫应答中的作用机制进行了广泛的研究, 已经成为当今国内外相关学科的研究热点有研究表明,Thl/Th2 免疫失衡在结核发病过程中起非常重要的作用 Thl/Th2 的平衡假说由 Mosmann 等在 1986 年率先在小鼠体内发现 Th 根据其分泌的细胞因子及其 [14] 功能可以分为 Thl 和 Th2 两类 Thl 细胞主要分泌 IFN ll-2 ll-12 TNF-α 等细胞因子, 主要介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答, 参与细胞免疫以及迟发型超敏性炎症, 因此,Thl 细胞在机体抗胞内病原体感染中发挥重要作用 Th2 细胞主要分泌 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13 等, 主要功能为刺激 B 淋巴细胞增殖并产生抗体, 参 [15] 与组织的损伤修复, 与体液免疫有关两类细胞主要通过产生的细胞因子相互调节和制约, 从而维持其在体内的平衡 Thl 分泌的 IFN 诱导 Thl 自身增殖分化, 但抑制 Th2 细胞增殖 ; 而 Th2 分泌的 IL-4 诱导 Th2 自身增殖分化, 但抑制 Thl 细胞的增殖在参与结核病免疫应答的细胞因子中, 最主要的细胞因子包括 TNF-α IL-1β IL-12 IL-10 IL-6 IL-17 和 IFN-γ [16] 研究显示,TNF-α 基因缺陷的小鼠对结核分枝杆菌感染的易感性明显增强, 并且还参与了肉芽肿的形成 ;IL-1 介导的信号通路是宿主防御 MTB 感染的重要组成部分研究表明,MTB 感染所导致小鼠低水平 IFN-γ 的产生肉芽肿形成的缺陷和较低的生存率与 І 型 IL-1 受体基因剔除相关 IL-12 是由 MTB 感染所诱导的细胞因子, 依赖于 MTB 感染的肺泡巨噬细胞中 IFN-γ 的表达, 该细胞因 [17] 子的缺陷能够导致人类对分枝杆菌病的易感性, 其信号是通过 IL-12R 的结合或者 [18] [19] IL-23R 来完成, 而 IL-12R 基因的突变与结核病的易感性密切相关 IL-10 和 IL-6 共同调节机体对结核杆菌的免疫应答,IL-10 能够通过下调 IL-12 的产生, 抑制巨噬细 2

13 继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究引言胞的活性, 进而影响 T 细胞 IFN-γ 的产生 ; 同时 IL-10 能够直接抑制 CD4+ 的 T 细胞的应 [20] 答, 以及结核杆菌感染细胞抗原呈递的能力虽然 IL-6 能够抑制 T 细胞的免疫应答, [21] 但是在其缺陷的小鼠中, 能够导致病原体的载量过早升高以及 IFN-γ 表达的下降, 提示 IL-6 在初始天然免疫应答中的重要作用暴露于高剂量的结核杆菌卡介苗,T 细 [22-24] 胞所产生的 IL-17 高效的免疫应答为快速的炎症反应和对机体的保护是必须的 IFN-γ 表达于 CD4+ 和 CD8+ 的 T 细胞和自然杀伤细胞, 是控制结核感染的一个关键性的 [25] 细胞因子, 能够激活巨噬细胞杀伤和清除结核杆菌以及提高 MHC 抗原呈递的能力而 IFN-γ 在人类抗结核防御中所发挥的关键作用主要表现在增加 IFN-γ 的受体或 [26] IL-12R 缺陷的患者对分枝杆菌感染的易感性 TNF-α 由很多免疫细胞分泌, 如巨噬细胞和 T 细胞, 包括 Th1 和 Th17 细胞, 在宿主抗结核分枝杆菌感染的保护性免疫反应中起到很重要的作用具有生物活性的 TNF-α [27] 的产生与机体的免疫状态以及结核分枝杆菌株的毒力有关,TNF-α 对于机体包围感染部位防止扩散起到很重要的作用结核分枝杆菌感染有 TNF-α 基因缺陷的 C57BL/6 [28] 小鼠, 不能形成有效的结核结节用 TNF-α 抗体中和 TNF-α 作用导致小鼠吞噬细胞 [29] 产生的炎性趋化性细胞因子减少多种药物耐药结核患者外周血单个核细胞用结核 [30] 分枝杆菌抗原刺激后, TNF-α 产量明显减少活动性肺结核患者血清 TNF-α 含量明 [31] 显高于正常人, 说明 TNF-α 在结核免疫反应中起重要作用同时,TNF-α 还是一种多效性的细胞因子, 体内适量的 TNF-α 对机体抗感染有一定的保护作用, 而分泌过多时造 [32] [33] 成组织坏死, 可致病情恶化 Price 等对此进行了研究, 发现 TNF-α 能够通过自分泌和旁分泌的方式上调基质金属蛋白酶 9 (Matrix Metalloproteinase-9) 的分泌, 后者会造成对组织的破坏由此看来, TNF-α 也有它反方面的作用 sil-2r 由 Rubin 等于 1985 年首次发现并报道, 它是一种重要的免疫抑制因子, [34] 与 IL-2 介导的免疫反应密切相关 IL-2 亦称为细胞生长因子, 是 1976 年 Morgan 等在激活的淋巴细胞培养的上清液中分离出的一种促人 T 淋巴细胞生长和繁殖的细胞活素, 各种细胞表面均有能与 IL-2 结合的蛋白, 称为 IL-2 受体 IL-2 受体有两种 : 表达在细胞膜表面的膜结合型 mil-2r 和游离于血清中的 sil-2r 白细胞介素 2 受体 (IL-2R) 主要由活化的 T 淋巴细胞释放 sil-2r 在结核病病灶以及全身的表达是通过调节 IL-2R 的水平, 致使 Thl 型细胞因子产生减少,Thl/Th2 平衡失调, 机体防御结核 3

14 引言继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究杆菌感染能力下降, 所以结核病患者 sil-2r 水平与机体所处的免疫状态及病情严重程度密切相关激活的淋巴细胞在膜表面表达 MIL-2R 的同时也向外释放 sil-2r, 使得细胞恢复至静息状态 sil-2r 可作为循环中单个核细胞活化的敏感定量指标, 也有 [35] 助于肺结核活动病情的判别国内外的研究报道表明, 结核病活动期患者血清中 sil-2r 水平明显高于健康对照组 Tabata 等报道一位 80 岁的老人患纵隔癌合并肺结 [36] 核,sIL-2R 水平显著增高, 经过抗结核治疗后,sIL-2R 水平明显下降 IL-10 开始称细胞因子合成抑制因子, 后改为 IL-10, 它是细胞因子网络中为数不多的抑制性细胞因子 IL-10 含 178 个氨基酸残基, 裸肽分子量 18.7kDa [37] IL-10 是由 TH2 TH0 单核巨噬细胞 B 细胞等产生的抑炎细胞因子,IL-10 可以降低 CD4 [38] 和 CD8 T 细胞的活性, 下调单核巨噬细胞的协同刺激分子的表达, 从而使抗原提呈途 [39] 径减少 ; 慢性结核分枝杆菌感染者中,IL-10 抑制机体过高的免疫应答, 抑制细胞 [40] [41] 介导的抗结核分枝杆菌感染免疫反应, 减少 TNF-a 及抗原特异性 IFN-r 产生 IL-6 由个氨基酸残基组成, 是由激活的 T 细胞巨噬细胞成纤维细胞上皮细胞等细胞产生的一种促炎细胞因子, 它作用于 T 细胞 B 细胞肝细胞和浆细胞等多种细胞, 具有多种生物学功能 :IL-6 能增加炎症细胞因子产生并提高炎症反应 [42] 强度, 增加机体的免疫力 ;IL-6 协调 IL-1, 促进 B 细胞分化增值和抗体的产生, 诱导肝脏细胞合成和释放急性期蛋白机体感染结核分枝杆菌后,IL-6 可以诱导保护 [43] 性 T 细胞的产生, 激活 T 细胞分泌 IFN-r, 加强 IFN-r 的作用, 促使粒细胞和巨噬细 [44] [45] 胞增殖, 诱导 B 细胞 T 细胞的形成, 并诱导肝细胞产生急性反应蛋白降钙素原 (Procalcitonin,PCT) 是降钙素的前体物质, 分子量为 13kDa, 由 116 个氨基酸糖蛋白组成, 生理情况下,PCT 由甲状腺滤泡旁细胞合成, 正常人血浆 PCT 的浓度 <0.10ng/mL, 全身性感染时 PCT 可以达到 0.50ng/mL, 非常严重的感染时甚至可以达到 l0ng/ml [46], 在内毒素刺激反应出现 2~6h 内即升高最初升高后,PCT 值的下降与其在血浆中的衰减和新生成的 PCT 间的平衡密切相关, 体内半衰期为小时, 在体内外稳定性好, 适合应用于临床检测在细菌感染时, 全身各种组织多种类型细胞 ( 神经内分泌肝肺等 ) 都可以出现 PCT 合成, 导致 PCT 连续释放, 是一个易于检测的指标致使其在感染性疾病中的应用价值越来越得到人们的重视 TNF-α IL-1 sil-2r IL-10 IL-6 和 IL-8 等多种细胞因子在结核病中起一定的 4

15 继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究引言作用, 调节结核病的免疫反应过程但是, 迄今为止, 关于以上的细胞因子在继发性肺结核和非结核分枝杆菌病中的表达及其作用国内外甚少报道因此, 本研究利用酶联免疫法 (ELISA) 测定继发性肺结核和非结核分枝杆菌病及正常对照组中 TNF-α IL-1 sil-2r IL-10 IL-6 和 IL-8 等多种细胞因子水平的变化情况, 并探讨这些细胞因子在继发性肺结核和非结核分枝杆菌病发病过程中的作用本研究在国内外鲜有报道 5

16 第一部分继发性肺结核和非结核分枝杆菌肺病患者血清细胞因子的临床研究第一部分继发性肺结核患者血清中细胞因子的测定及其临床意义结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性感染性疾病, 主要特征是干酪样坏死和肉芽组织增生为结核病可以侵犯人体多个器官, 其中以肺组织最为常见, 约占各器官结核总数的 80% 以上结核病 (Tuberculosis,TB) 历史悠久, 在人类有历史记录前已经存在它曾经是 18 世纪至 20 世纪前叶在欧洲和美洲主要肆虐的公共传染病之一结核病严重危害人们的身体健康, 历史上曾造成数以亿计的人死亡该病直至 1882 年 Robert koch 发现结核分枝杆菌, 人类才进入了与结核病斗争的现代阶段尤其是以异烟肼和利福平为标志的有效抗结核化疗时代的到来, 使结核病疫情得到控制和下降但由于全球人口迅速膨胀人口流动加速战争难民人类免疫缺陷病毒 [5, 47, 48] 感染和爱滋病流行, 发展中国家疫情依然严重, 而发达国家也出现疫情回升中国是结核病发病率较高的国家之一,2010 年第五次全国结核病流行病学调查显示, 活动性结核病患者 459/10 万, 菌阳患者 66/10 万, 提示结核病的诊治仍然是国家结核病控制策略中的重要措施在今后 10 年, 如不能全面有效地实施现代结核病控制策略, 预计全国将新增结核病患者万人, 将给国家和人民带来沉重的负担, 严重制约我国经济和社会的发展继发性肺结核多发生在成人, 该病病程长, 容易反复, 活动性病变与愈合病变并存, 易于引起肺内播散, 影响多个肺野, 肺组织的纤维化及邻近组织的肺顺应性降低, [49, 50] 对肺功能也有影响近年来, 随着细胞和分子免疫学的进展, 对有关细胞因子在结核病中的作用机制进行了广泛的研究, 已经成为当今国内外相关学科的研究热点虽然继发性肺结核在肺结核疾病中占据比较大的比例, 但关于继发性肺结核患者血清中炎症相关细胞因子的研究较少本文拟采用酶联免疫方法 (ELISA) 对继发性肺结核患者血清中白介素 1(interleukin 1,IL-1) 可溶性白介素 2 受体 (soluble interleukin 2 receptor,sil-2r) 白介素 10(interleukin 10, IL-10) 白介素 6(interleukin 6, IL-6) 白介素 8(interleukin 8, IL-8) 和肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α, TNF-α) 的含量变化进行检测, 探讨其临床应用价值, 为揭示继发性肺结核的免疫学机制辅助 6

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