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权朱
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1 6 11 Vol. 6 No Journal of Food Safety and Quality Nov., 2015 王菡 1*, 李高华 1, 张阳 2, 陈涛 2, 薛小平 2 (1., ; 2., ) 摘要 : 目的,, 方法 ±0.64 nm,, 结果 4 μg/ml, 5 min 结论, 关键词 : ; ; Detection of organphosphorus pesticides residual using lateral flow immune colloidal gold chromatography technology WANG Han 1*, LI Gao-Hua 1, ZHANG Yang 2, CHEN Tao 2, XUE Xiao-Ping 2 (1. The Inspection and Quarantine Technology Center of Shaanxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi an , China; 2. Xi an Libang Pharmaceutical Co., Ltd., Xi an , China) ABSTRACT: Objective To prepare the colloidal gold for the rapid detection of organicphosphorus pesticides on the basis of the specific monoclonal antibodies against a class of organicphosphorus pesticides. Methods Uniform texture colloidal gold with a diameter of nm was prepared by tannin-sodium citrate reduction method, then labeled monoclonal antibody, and assembled colloidal gold immune chromatography testing board. The colloidal gold and gold labeled antibodies were identified by ultraviolet spectrum, fluorescence spectroscopy, transmission electron microscopy, and dynamic light scattering. Results The testing board was validated to complete a detection assay within 5 min, and the LOD value of chlorpyriphos-ethyl was 4 μg/ml. Conclusion Colloidal gold test strip had a high sensitivity, and the matrix interference effect was not obvious. KEY WORDS: gold immune chromatography assay; organphosphorus pesticides; monoclonal antibody 1 引言 (gold immune chromatography assay, GICA) :,, 基金项目 : (2013IK179) Fund: Supported by the Science and Technology Planning Project of General Administration of Quality Supervision and Quarantine of the People s Republic of China (2013IK179) * 通讯作者 :,,, wanghan128@126.com *Corresponding author: WANG Han, Master, Engineer, The Inspection and Quarantine Technology Center of Shaanxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi an , China. wanghan128@126.com

2 ( ), ( ), ( ) ( ),,, 16.08±0.64 nm,,, 2 材料与方法 2.1 材料试剂和仪器试剂 ( ); ( ); ( ); (BSA)(Roche); (AuCl 4 )( ) 仪器 (680, Bio-Rad); (U-3310, HITACHI); (Milli-Q, ); (U-3310, HITACHI); (F-4500, HITACHI); (JEM-EX2000, JEOL); ( Malvern) 2.2 方法胶体金制备 -, A B A B 60, B, A,, 7 10 min 胶体金标记单克隆抗体 0.1 mol/l K 2 CO mol/l HCl ph 8.3, ph ph 1 ml 0.1 ml (McAb), 10% NaCl 0.1 ml, 4 h (mg) (flocculation point, FP) 10%, 10 ml 1 mg/ml McAb 0.5 ml, ph,, 1 mg 5 min 5%BSA, 1% 1500 r/min 4 15 min,,, r/min 4 15 min,, 0.02 mol/l TBS(pH 8.2, 1%BSA, 0.05% ), 2 3, 1 ml TBS, 50%, 胶体金单克隆抗体结合物的免疫性鉴定紫外 - 可见光谱扫描 (0.5 mmol/l, ph 8.3) ph ~700 nm, 225 nm/min, 1 nm 荧光光谱分析 5 nm, 240 nm/min, 1 nm, 295 nm, 300~500 nm (0.05 mmol/l, ph 8.3) Table 1 表 1 鞣酸 - 柠檬酸三钠还原法 Tannin-sodium citrate reduction method A B 1% (ml) 0.1 mol/l K 2 CO 3 (ml) 1% (ml) H 2 O(mL) 1%HAuCl 4 (ml) H 2 O (ml)

11, : 4411 2.2.6 电镜鉴定 Formavar, 37, 80.2 kv, 100 k,, 50, SPSS13.0 2.2.7 Dynamic light scattering (DLS) 分析 gold-mcab zeta, 25, ph 8.3 2.2.8 侧向层流胶体金免疫试纸条的制备 Sun [1] : (OD 519 =40), ; PBS (1 mg/ml) (T ), 1 cm IgG (0.

3 11, : 电镜鉴定 Formavar, 37, 80.2 kv, 100 k,, 50, SPSS Dynamic light scattering (DLS) 分析 gold-mcab zeta, 25, ph 侧向层流胶体金免疫试纸条的制备 Sun [1] : (OD 519 =40), ; PBS (1 mg/ml) (T ), 1 cm IgG (0.5 mg/ml) (C ); 1% BSA, 2 h PBST,, ; ( - ) 0.25 cm 6 cm,, 胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应,,, T :, T ;,, ( ),, C, IgG, ( ) Fig Configuration of the lateral laminar immune colloidal gold strip test (1 mg/ml) PBS μg/ml,,, 20%,, 3 结果与分析 3.1 胶体金单克隆抗体结合物的免疫性 gold-mcab 2, McAb 1:8 10 3,, McAb, 表 2 Table 2 抗体滴度 Antibody titer ( 10 3 ) Gold - McAb McAb

4412 3.2.2 仪器扫描鉴定 3.2 3.2.1 第6卷食品安全质量检测学报紫外- 可见光谱扫描结果如图 2 所示, A 为未标记的胶体金溶液的紫外- 荧光光谱分析如图 3 所示, 295 nm 激发光作用下, 可在 300~500 nm 范围内观察到抗体的发射光谱可见扫描光谱, B 为标记单抗后立即进行紫外-可见光谱扫描的结果, 在 280 nm

4 仪器扫描鉴定第6卷食品安全质量检测学报紫外- 可见光谱扫描结果如图 2 所示, A 为未标记的胶体金溶液的紫外- 荧光光谱分析如图 3 所示, 295 nm 激发光作用下, 可在 300~500 nm 范围内观察到抗体的发射光谱可见扫描光谱, B 为标记单抗后立即进行紫外-可见光谱扫描的结果, 在 280 nm 处出现一新的吸收峰, 与蛋白吸收峰相符 C 是将 gold-mcab 离心弃去未结合的抗体以后, 进行紫外-可见光谱扫描得到的, 它分别于 519 nm 左右和 280 nm 左右有两个较低的吸收峰图 3 胶体金颗粒及其标记单克隆抗体的荧光光谱 Fig. 3 Fluorescence spectrum of free antibody, antibody-colloidal conjugates and colloidal gold a. 未标记抗体; b. CG-mAb; c. 胶体金图 2 胶体金颗粒及其标记单克隆抗体的紫外光谱 Fig. 2 UV-vis spectrum of colloidal gold and antibody-colloidal gold conjugates 电镜鉴定胶体金和 gold-mcab 的 TEM 图片见图 4 两种形式金颗粒的粒度和形状都比较均匀, 标记前粒径平均值为 12.82±0.48 nm; 标记后粒径平均值为 A 为胶体金, B 为 CG-McAb 且标记后未洗涤, C 为 CG-McAb 且标 16.08±0.64 nm, 经方差分析, 两者有显著性差异, 记后洗涤去除未标记抗体, 以上均不含稳定剂 P<0.001 A 未结合抗体的胶体金, B 结合抗体的胶体金颗粒, 即 CG-McAb Fig. 4 图 4 TEM 图象及标记前后胶体金颗粒的粒径分布 TEM images and size distribution of colloidal gold particles and conjugated antibody-colloidal gold particles

5 11, : DSL 分析 5, DSL : 15.0±3.4 nm, 25.0±6.45 nm, 100%, 6, zeta mv, zeta -8.8 mv, 1% BSA, zeta mv 3.3 胶体金试纸条对毒死蜱标准液的反应 4 μg/ml( 7), 10 μg/ml, 5 min 20%,, 6 μg/ml 15 μg/ml, ( 8) 4 讨论 1), 3 (1) :, ( ), (2) :,, (3) :, [2] A:, B: CG-McAb 5 Fig. 5 Particle size by DLS A:, B: CG-McAb BSA, C: CG-McAb BSA 6 zeta Fig. 6 Zeta potential result

4414 食品安全质量检测学报第6卷抗原, 容易出现假阴性, 而且过量的抗体蛋白质还会影响到金标的稳定性蛋白质和胶体金结合的最佳 ph 值条件在蛋白质的等电点附近或略高于等电点这样蛋白质的净电荷为 0 或偏负, 避免了因静电作用而引起聚集蛋白质结合上胶体金后, 要用 BSA 凝胶聚乙二醇或酪蛋白等稳定剂稳定金标溶液这些稳定剂能封闭胶体金表面未和蛋白结合的位点而减

7 Lateral laminar colloidal gold strip test results at CE concentrations of 0, 10, 4, 1 μg/ml (from the left) 在曲线 C 中弃去了未偶联的单抗, 因而 280 nm 吸收峰低于 B A 即未标记的胶体金于 519 nm 处出现的吸收峰可归因于胶体金表面基质的共振现象[4] 曲线 C

由于蛋白结构中存在酪氨酸和色氨酸残基, 当用特定波长激发光照射样品时, 可在 300~400 nm 范围内观测到荧光发射光谱图 3 示偶联物的荧光光谱与未标记抗体在相同激发条件下得到的荧光光谱相比, 曲线的形状与峰的位置都极其相似, 说明在耦联后, 抗体的三级结构完好, 推测其免疫反应性基本不受影响比较二者发射光谱强度, 耦联后出现明显的荧光淬灭, 再对照胶体金的图8

6 4414 食品安全质量检测学报第6卷抗原, 容易出现假阴性, 而且过量的抗体蛋白质还会影响到金标的稳定性蛋白质和胶体金结合的最佳 ph 值条件在蛋白质的等电点附近或略高于等电点这样蛋白质的净电荷为 0 或偏负, 避免了因静电作用而引起聚集蛋白质结合上胶体金后, 要用 BSA 凝胶聚乙二醇或酪蛋白等稳定剂稳定金标溶液这些稳定剂能封闭胶体金表面未和蛋白结合的位点而减弱非特异性反应, 还能为胶体金标记物提供一种更稳定的环境 2) 紫外可见图谱中曲线 B 和 C 于 280 nm 处出现蛋白质特征峰(由色氨酸和酪氨酸中的电子迁移所致), 说明单克隆抗体已吸附在胶体金颗粒表面 [3]; 图7 侧向层流胶体金试纸条对不同浓度毒死蜱的反应 (毒死蜱浓度从左至右为: μg/ml) Fig. 7 Lateral laminar colloidal gold strip test results at CE concentrations of 0, 10, 4, 1 μg/ml (from the left) 在曲线 C 中弃去了未偶联的单抗, 因而 280 nm 吸收峰低于 B A 即未标记的胶体金于 519 nm 处出现的吸收峰可归因于胶体金表面基质的共振现象[4] 曲线 C 中 519 nm 左右的吸收峰较 A 中的低, 是因为在标记后的洗涤过程中, 一些胶体金颗粒被丢弃; 同时, 曲线 B C 中 525 nm 左右的吸收峰与 A 相比有一定程度红移, 且峰型变宽, 可能是由于标记后胶体金直径增大, 均匀度降低[5] 偶联胶体金后抗体的三级结构是否发生改变直接决定了抗体的免疫反应性, 而抗体的三级结构可通过荧光光谱进行研究 [3,6] 由于蛋白结构中存在酪氨酸和色氨酸残基, 当用特定波长激发光照射样品时, 可在 300~400 nm 范围内观测到荧光发射光谱图 3 示偶联物的荧光光谱与未标记抗体在相同激发条件下得到的荧光光谱相比, 曲线的形状与峰的位置都极其相似, 说明在耦联后, 抗体的三级结构完好, 推测其免疫反应性基本不受影响比较二者发射光谱强度, 耦联后出现明显的荧光淬灭, 再对照胶体金的图8 土壤提取液中添加标准毒死蜱后加入侧向层流胶体金试纸条反应(左侧: 空白土壤提取液右侧: 添加 6 μg/ml 毒死蜱后土壤提取液) C: control line; T: test line Fig. 8 Evaluation of lateral laminar colloidal gold strip with blank soil extract (left strip) and soil extract spiked with chlorpyriphos-ethyl at a concentration of 6 μg/ml (right strip) 荧光谱线可推测, 胶体金对抗体的色氨酸和酪氨酸残基具有荧光淬灭作用[7] 透射电镜鉴定 gold-mcab 的平均直径为 16.08±0.64 nm; 据文献报道, 制备免疫层析试纸条使用的胶体金标记物粒径的经典范围应在 10 nm 20 nm 之间, 本实验制作的胶体金标记物粒径符合次范围且质地均匀, 可以用作制备免疫层析试纸条间主要由上述三种作用力维持, 因此在金标的缓冲动态光散射也称相关光谱学(photon correlation 液中避免加入会破坏这些作用力的物质, 比如避免 spectroscopy), 其原理是通过测量胶体颗粒在液相中使用高盐缓冲液表面活性剂和含有巯基或汞的防腐的布朗运动速率从而计算出颗粒的粒径分布[8]; 这种剂等胶体金标记抗体时, 不能有过量的待标记抗体对粒径的估计方法是基于对所测量的纳米颗粒均为存在过量游离的抗体会和胶体金上的抗体竞争反应球形的假设, 因而所给出的信息并未涉及颗粒的几

11, : 4415 [9] DLS,, [10],,,, ;,,, zeta zeta,, Herry, zeta, LDV(laser doppler velocimetry) [9] zeta, zeta +30 mv -30 mv [8] 5, zeta -57.4 mv, zeta -8.8 mv, 1%BSA, zeta -12.

7 11, : 4415 [9] DLS,, [10],,,, ;,,, zeta zeta,, Herry, zeta, LDV(laser doppler velocimetry) [9] zeta, zeta +30 mv -30 mv [8] 5, zeta mv, zeta -8.8 mv, 1%BSA, zeta mv, BSA,, 4, 3), [11], 1996 Mika [12],,, Zhou [13] 0.25 μg/ml, 4 μg/ml,,,, 参考文献 [1] Sun XL, Zhang XL, Tang J, et al. Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B 1 [J]. Int J Food Microbiol, 2005, 99(2): gold in rapid assays [J]. IVD Tech, 2006, 11 (2): [3] Gole A, Sumant P, Lachke A, et al. Studies on the formation of conjugates of endoglucanse with colloidal gold [J]. Colloid Surface B, 2002, (25): [4] Pattarawarapan M, Cressey TR, Tayapiwatana C. Development of a one-step immunochromatographic strip test for the rapid detection of nevirapine (NVP), a commonly used antiretroviral drug for the treatment of HIV/AIDS [J]. Talanta, 2007, 71(1): [5],,,. [J]., 2006, 35(4): Zhao XL, Sun WR, Sun XL, et al. Production and characterization of gold labeled monoclonal antibody against MC-LR [J]. J Hyg Res, 2006, 35 (4): [6] Johne B, Hansen K, Mark E, et al. Colloidal gold conjugated monoclonal antibodies, studied in the BIAcore biosensor and in the nycocard immunoasay format [J]. J. Immunol Methods, 1995, 183(1): [7] Szabo A. Theory of diffusion-influenced fluorescence quenching [J]. J Phy Chem, 1989, 93: [8] What is Particle Size, Zeta potential and Molecular weight? [Z] [9] Tsai DS, Chen CH, Chou CC. Preparation and characterization of gold-coated silver triangular platelets in nanometer scale [J]. Mater Chem Phys, 2005, 90: [10] Aryal S, Khil MS, Dharmaraj N., et al. Radical scavenger for the stabilization of gold nanoparticles [J]. Mater Lett, 2007, 61(19): [11],. [J]., 2004, 11 (4): Chen XF, Liu SZ. Colloidal gold lebelling immunoassay and it's application in rapid detection of small molecule [J]. Pharm Biotechnol, 2004, 11(4): [12] Laitinen MPA, Vuento M. Affinity immunosensor for milk progesterone: identification of critical parameters [J]. Biosens Bioelectron, 1996, 11 (12): [13] Zhou PL. Lu YT, Zhu J, et al. Nanocolloidal gold-based immunoassay for the detection of the n-methylcarbamate pesticide carbofuran [J]. J Agric Food Chem, 2004, 52 (14): 作者简介 ( 责任编辑 : 白洪健 ) 王菡, 硕士, 工程师, 主要从事食品安全检测技术研究 wanghan128@126.com [2] James C, Helen B, Joanna S. Present and future applications of

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Microsoft Word 聂雪梅.doc 4 4 Vol. 4 No. 4 2013 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2013 聂雪梅 *, 李立, 孙利, 高飞 (, 100123) 摘要 : 2011 12,, 2007~2011,,,, 关键词 : ; ; ; ; Trade and notification situation on food import and export

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