21期

中国农学通报 2014,30(21):235-239 Chinese Agricultural Science Bulletin 适宜当归实时荧光定量分析的总 RNA 提取方法研究 温随超 1 1,2 1,2 1, 雒军, 王引权, 荔淑楠 ( 1 甘肃中医学院, 兰州 730000; 2 甘肃省高校中 ( 藏 ) 药化学与质量研究省级重点实验室, 兰州 730000) 摘要 : 为了有效消除次生物质 多糖和多酚类物质的严重干扰, 获得高质量适宜于实时荧光定量分析的当归总 RNA, 本研究采用 CTAB 法 试剂盒法和 Trizol 法分别提取当归根 茎 叶组织的总 RNA, 并通过紫外可见光分光光度计 非变性琼脂糖凝胶电泳和反转录荧光定量 PCR 检测总 RNA 的纯度 产率 完整性及质量结果表明 :CTAB 法提取的当归根 茎 叶组织总 RNA 纯度较高 完整性较好且叶组织总 RNA 得率较高 ; 试剂盒法所提的总 RNA 完整性亦较好, 但纯度略差且各组织的得率均较低 ;Trizol 法提取的茎组织总 RNA 能满足荧光定量 PCR 要求, 但提取的根和叶组织总 RNA 均出现严重污染, 无法满足后续研究要求因此,CTAB 法是一种经济 可靠 适宜当归实时荧光定量分析的总 RNA 提取方法本研究结果为今后有效开展当归分子生物学研究奠定了方法学基础, 也为其他药用植物总 RNA 的提取提供了参考关键词 : 当归 ; 总 RNA; 提取方法 ; 实时荧光定量分析中图分类号 :S567.23+9 文献标志码 :A 论文编号 :2013-3279 An Appropriate Method of Isolating Total RNA from Angelica sinensis for Quantitative RT-PCR Wen Suichao 1, Luo Jun 1, 2, Wang Yinquan 1, 2, Li Shunan 1 ( 1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2 Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province, Lanzhou 730000) Abstract: In order to effectively eliminate the severe disturbances of the secondary substances, polysaccharides and polyphenolics and obtain a high- quality RNA from the tissues of Angelica sinensis for quantitative RT-PCR, three methods of CTAB, Kits and Trizol reagent were used for isolations of total RNA from the roots, stems and leaves of Angelica sinensis, respectively. The purity and yield of the total RNA isolated were detected by a UV/VIS spectrometer, the integrity of total RNA isolated was analyzed by the nondenaturing agarose gel electrophoresis and the quality of total RNA isolated was validated by the quantitative RT-PCR. The results showed that RNAs of the roots, stems and leaves isolated by CTAB method had a better integrity and purity, and the yield of leaves was higher than that of the roots and stems. The total RNAs isolated by Kits method had a good integrity, but there were a lower yield and poorer purity; RNAs of the stems by Trizol reagent could be used for the quantitative RT-PCR, but RNAs of the roots and the leaves were highly polluted, which was ineligible for the subsequent operations. Therefore, CTAB method could be indicated as an economical, reliable and applicable method for isolating total RNA from Angelica sinensis for quantitative RT-PCR. This work established a methodology basis for the research on the molecular biology of Angelica sinensis, and also provided a reference for the total RNA extraction of other medicinal plants. 基金项目 : 国家自然科学基金项目 海拔梯度影响当归产量与品质形成的生理生态机制研究 (81060327); 钾素营养对当归品质形成的影响及生理机理研究 (81060327) 第一作者简介 : 温随超, 男,1988 年出生, 硕士在读, 研究方向 : 药用植物栽培生理生态及分子生物学通讯作者 : 王引权, 男,1963 年出生, 甘肃甘谷人, 教授, 博士, 博士生导师, 研究方向 : 药用植物栽培生理生态及分子生物学通信地址 :730000 兰州市定西东路 35 号甘肃中医学院,Tel:0931-8768293,E-mail:kjkfpp@163.com收稿日期 :2013-12-16, 修回日期 :2014-04-03

236 中国农学通报 http://www.casb.org.cn Key words: Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Total RNA; Extraction method; Quantitative RT-PCR 0 引言 当归 [Angelica sinensis(oliv.)diels.] 为伞形科当归 属多年生草本植物, 其干燥根是中国一味常用大宗中 药材, 具有补血活血 调经止痛 润肠通便之功效 [1] 近年来, 随着当归药食两用量的增加, 种植面积逐年扩大, 保证和提高药材质量已成为当归栽培的首要任务 [2] 应用现代分子生物学技术, 从功能基因调控等水平揭 示当归药材质量形成的机制, 对当归优质栽培和遗传 育种具有重要意义在分子生物学技术研究中, 获得 纯度高 完整性好的 RNA 是顺利进行反转录 (RT- PCR) cdna 文库构建 基因扩增与克隆以及 Northern 杂交等研究的必要条件 [3-5] 当归除含有内酯类 生物 碱类 有机酸类及中性油类等多种成分外, 还含有大量 的酚类物质和多糖 [6] 这些酚类物质易氧化成醌类, 与蛋白质和核酸形成不可逆的高分子聚合物, 多糖在 低离子强度的缓冲液中易与核酸形成共沉淀 [7], 这对 高纯度 RNA 的获得带来很大干扰目前用于当归总 [8] RNA 提取方法多数是基于 Trizol 方法, 如 Zhang 等采 用 Trizol (Sangon, Shanghai) 法提取当归叶片中的马铃 [9] 薯病毒 RNA;Yu 等采用 Trizol (Invirogen, 美国 ) 方法 [10] 从当归生殖期的花蕾中提取总 RNA; 吴永娜等用 (Trizol Sangon, 上海 ) 方法从当归幼苗鲜根中提取总 RNA 但至今尚未见到提取当归成药期不同组织中 总 RNA 方法的研究报道本研究分别采用 CTAB 法 商业试剂盒法和 Trizol 法提取当归成药期根 茎及叶 组织总 RNA 并进行对比分析, 以期筛选出适宜荧光定 量分析的当归总 RNA 提取方法, 为当归分子生物学相 关研究奠定方法学基础 1 材料与方法 1.1 材料 当归植株于 2013 年 8 月采自甘肃岷县茶埠镇试验 基地 ( 海拔 3030 m, 东经 104 06', 北纬 34 29') 田间 挖取当归全株, 将其冷冻于装有干冰的泡沫箱中, 带至 实验室后迅速用去离子水冲洗干净, 将根 茎 叶分离 后液氮迅速冷冻, 而后于 -80 超低温冰箱保藏, 用作 RNA 提取的材料 Cetrimonium Bromide (CTAB) LiCl 和 Polyvinylpyrrolidone-360 (PVP-360) 均为 Sigma 产品, Trizol reagent(invirogen, 美国 ), 多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒 (BioTeke, 北京 ),cdna 合成试剂盒 (Takara, 大连 ), 荧光定量 PCR 试剂盒 (Promega, 美 国 ),DNA marker(transgen, 北京 ), 其他生化试剂均 为分析纯产品引物由生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司合成 1.2 总 RNA 提取 RNA 提取所有塑料器具, 均用含 0.1% DEPC(V/V) 超纯水浸泡过夜,121 湿热灭菌 20 min, 弃去液体, 放入 60 烘箱中干燥备用研钵 研杵及玻璃用具等用洗涤剂清洗干净, 蒸馏水冲洗后晾干, 在 180 烘箱中烘烤 3 h 后备用 [11] 1.2.1 CTAB 法参照 Pandit 等指出的方法进行, 并略做改进提取缓冲液 :100 mmol/l Tris-Cl 2% CTAB (m/v) 2% PVP-360(m/V) 30 mmol/l EDTA 1.5 mol/l NaCl 2%(V/V) β-me(β- 巯基乙醇 ) 和 CLA( 氯仿与异戊醇比例为 24:2 的混合物 )将 1 g 组织材料置于含液氮的研钵中充分研磨成粉末状取约 1/10 的粉末转入内含 0.9 ml,65 预热提取缓冲液的离心管中, 充分振荡混匀后置于 65 水浴锅孵育 20 min, 期间每 5 min 充分振荡一次冷却至室温后, 加等体积 CLA, 剧烈振荡 30 s,12000 g 4 离心 10 min 水相转入另一离心管, 加约 1/3 体积 10 mol/l 的 LiCl, 混匀后置 -20 冰箱 30 min 12000 g 4 离心 10 min, 沉淀溶解于 0.5 ml 无 RNase 的去离子水, 加 0.5 ml 水饱和酚抽提一次, 再加入等体积 CLA 抽提一次,12000 g 4 离心 10 min 水相转入另一离心管, 加 1/10 体积 3 mol/l ph 5.4 的醋酸钠, 再加 1 体积冷却处理的异丙醇, 置 -20 冰箱 30 min 12000 g 4 离心 10 min, 沉淀悬浮于 500 μl 无 RNase 的去离子水配制的 70% 乙醇 12000 g 4 离心 10 min, 弃去上清, 沉淀干燥后溶于 50 μl 无 RNase 的去离子水 1.2.2 试剂盒法试剂盒选用北京百泰克生物技术有限公司生产的多糖多酚植物总 RNA 离心柱型快速提取试剂盒 1 g 材料置于含液氮的研钵中充分研磨成粉末状取约 1/10 的粉末按照试剂盒说明书上的要求进行操作, 最后用 50 μl 无 RNase 的去离子水溶解 洗脱总 RNA 1.2.3 Trizol 法操作步骤参照 Trizol reagent 试剂说明书进行 1 g 材料置于含液氮的研钵中充分研磨成粉末状取约 1/10 的粉末转入内含 1 ml Trizol 裂解液的离心管中, 充分振荡 30 s, 室温静置 5 min,12000 g 4 离心 5 min 取上清液到新的离心管中, 加 0.2 ml 氯仿, 剧烈振荡 15 s,12000 g 4 离心 15 min 此时匀浆液分为三层, 吸取上清液转移至另一新的离心管向上清液中加入等体积的异丙醇, 充分混匀后在

温随超等 : 适宜当归实时荧光定量分析的总 RNA 提取方法研究 237 室温 (15~30 ) 静置 10 min 12000 g 4 离心 10 min 弃去上清, 加入 500 μl 无 RNase 的 70% 乙醇,12000 g 4 离心 5 min 后弃去乙醇, 沉淀干燥后溶于 50 μl 无 RNase 的去离子水 1.3 RNA 纯度 产率和完整性检测取 1 μl 总 RNA 样品, 在紫外可见光分光光度计 (Thermo BioMate 3S, 美国 ) 测其 A 260/A 280 和 A 260/A 230 的光密度比值及浓度根据检测的浓度值, 按照每克植物材料提取的 RNA 总量算出其产率采用 1% 非变性琼脂糖凝胶电泳进行总 RNA 完整性检测, 分别取约 200 ng 总 RNA 样品,2 μl 6 溴酚蓝加样缓冲液和无 RNase 的去离子水混合构成 12 μl 体系, 点样于非变性琼脂糖凝胶加样孔中, 电泳缓冲液采用 1 TAE 于 140 V 电压电泳后用凝胶成像分析系统 (ChemiDoc XRS+, 美国 ) 观察和拍照 1.4 反转录荧光定量 PCR 检测分别取不同提取方法的当归各个组织总 RNA 约 700 ng, 按照 cdna 合成试剂盒 (Takara DRR036A, 大连 ) 上的说明书操作进行反转录反应体系为 10 μl 体系, 反转录完成后再加无菌水稀释成 30 μl 实时荧光定量 PCR 采用 Promega 公司的荧光定量 PCR 试剂盒按照说明书进行操作, 参照已报道的当归 [10] 肌动蛋白 (Actin) 序列, 设计一对荧光定量 PCR 检测引物 (P1,P2) P1:5 -TGGTATTGTGCTGGATTCTG GT-3,P2:5 -TGAGATCACCACCAGCAAGG-3, 扩增产物约为 110 bp 其具体反应体系: 荧光定量 PCR mix(2 )10 μl,cdna 1 μl, 上游引物 (10 μmol/μl) 和下游引物 (10 μmol/μl) 各 0.8 μl, 无菌去离子水 7.4 μl, 反应总体积为 20 μl, 每个 cdna 样本重复 3 次扩增程序 :95 预变性 2 min,95 变性 15 s,60 退火 30 s, 72 延伸 30 s( 在此步骤检测荧光信号 ), 共进行 32 轮循环 1.5 数据处理数据采用 SPSS 16.0 进行统计和分析 Ct 值差异性利用 ANOVA 分析, 采用 Duncan s 检验 2 结果与分析 2.1 电泳结果由图 1 可见,CTAB 法 Trizol 法 商业试剂盒法方法均能从当归根 茎 叶组织中提取出总 RNA, 呈现出完整的 18 S rrna 和 28 S rrna 条带 CTAB 法无拖尾, 说明 RNA 无降解, 完整性好而 Trizol 法和试剂盒法有不同程度的拖尾, 且 Trizol 法在点样孔周围还出现一些荧光条斑, 这可能是蛋白核酸复合体沉淀或 [12] 受多糖等大分子物质残留杂质污染所致 1~3,4~6 和 7~9 分别表示 CTAB 法 试剂盒法和 Trizol 法提取的当归根 茎 叶总 RNA 图 1 不同方法提取当归各组织总 RNA 电泳图 2.2 总 RNA 纯度和产率核酸的 A 260/A 280 值在 1.80~2.00 之间, 且 A 260/A 230 值接近 2.00 表示所提 RNA 纯度较高, 有效地排除了多糖 [13] 及酚类物质的干扰 由表 1 看出 CTAB 法提取的各组织 RNA 的 A 260/A 280 值在 1.97~2.02 之间,A 260/A 230 值在 1.89~2.30 之间, 说明纯度较高试剂盒法所提 RNA 的 A 260/A 280 值在 1.74~1.91 之间, 但 A 260/A 230 值在 0.85~ [14] 1.42 之间, 说明可能有多糖和酚类的污染存在, 去盐步骤不够充分 Trizol 法提取总 RNA 的 A 260/A 280 值均小于 1.7, 说明蛋白质污染严重, 且 A 260/A 230 均小于 1.0, 所提取的总 RNA 纯度较差从总 RNA 的得率显示,Trizol 法提取各组织总 RNA 得率较高, 但由电泳结果已知 Trizol 法所提取的 RNA 污染较严重, 可能会影响分光光度计读数的准确性 CTAB 法和试剂盒法对根和茎的总 RNA 提取得率相当, 但 CTAB 法提取叶的总 RNA 得率要显著高于试剂盒法 2.3 荧光定量 PCR 在荧光定量 PCR 技术中,Ct 值表示反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数, 因此 Ct 值

238 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 表 1 不同方法提取当归各组织总 RNA 纯度和产率的比较 表 2 荧光定量 PCR 的 Ct 值比较 方法 组织 A260/A280 吸光度比值 A260/A230 产率 /(μg/g) 提取方法 CTAB 法 根 26.45 ±0.14b 茎 24.30±0.18a 叶 25.32±0.24b 根 1.97 1.89 13.4 试剂盒法 26.54±0.17b 24.35±0.18a 25.29±0.14b CTAB 法 茎 2.02 2.30 16.5 Trizol 法 30.77±0.29a 24.73±0.21a 30.01±0.40a 叶 1.98 1.87 162.4 根 1.91 1.42 17.5 试剂盒法 茎叶 1.74 1.87 0.89 0.85 8.9 66.2 根 1.48 0.45 26.6 Trizol 法 茎 1.66 0.87 40.1 叶 1.44 0.8 940.2 [15] 越小, 表明起始拷贝数越多 从表 2 的 Ct 值比较可以看出, 根部中 Trizol 法的 Ct 值显著高于 CTAB 法和试剂盒法的 Ct 值 (P<0.05), 表明其起始拷贝数偏小 ; 茎部中各方法的 Ct 值无显著性差异 ; 而叶部中 Trizol 法的 Ct 值亦显著高于 CTAB 法和试剂盒法的 Ct 值 注 : 表中数值为平均值 ± 标准差 (n = 3), 同一列不同字母表示显著性差异 (P<0.05) (P<0.05), 表明其起始拷贝数也偏小由 Ct 值数据比较可推断,Trizol 法提取根和叶的起始拷贝数偏小 (Ct 值 >30), 可能是由于 Trizol 法提取的根和叶的总 RNA 杂质较多, 抑制了反转录反应为进一步验证, 对其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析, 结果显示 ( 图 2),CTAB 法和试剂盒法各泳道扩增条带清晰, 大小和 Actin 基因片段的理论大小一致 ( 约为 110 bp), 成功地实现了荧光定量 PCR 扩增 ; 但 Trizol 法的根和叶条带亮度很淡且大小明显小于 100 bp, 说明没有扩增出目的基因片段, 检测到的荧光信号为引物二聚体所致 M 表示 DNA marker;1~3,4~6 和 7~9 分别表示 CTAB 法 试剂盒法和 Trizol 法提取的当归根 茎 叶总 RNA 图 2 荧光定量 PCR 产物的电泳图 3 结论本研究采用 CTAB 法 试剂盒法和 Trizol 法对当归成熟根 茎 叶组织总 RNA 的提取进行了对比研究, 结果表明,CTAB 法提取的总 RNA 纯度较高 完整性较好, 能成功运用于荧光定量 PCR 分析, 此外 CTAB 法提取的叶组织总 RNA 得率较高, 因此在需要较高 RNA 浓度的实验或低表达基因研究中可以选择以叶组织为材料进行提取 ; 试剂盒法所提的总 RNA 完整性亦较好, 也能运用于荧光定量 PCR 分析, 但纯度略差且各组织的得率较低 ;Trizol 法提取的茎组织总 RNA 能满足要求, 但提取的根和叶组织总 RNA 均出现严重污染, 无法满足后续研究的要求 4 讨论高品质的 RNA 是荧光定量 PCR 分析的必要前提, 因此, 反转录前必须要保证 RNA 的纯度和完整性 [16] 达到要求 Trizol 法是一种比较常用的 RNA 提取方法, 能够抑制细胞释放出核酸酶的同时释放出核酸, 具有快速 高效的特点本研究中用 Trizol 法提取的当归根和叶组织的总 RNA 颜色较深, 尤其根部总 RNA 有难溶于水的黑褐色胶状物沉淀存在, 这种褐变现象可能除了与酚类物质的氧化有关, 也可能与当归含有复杂的多糖 色素等成分有关分光光度计测量结果显示此法提取的当归各组织总 RNA 纯度差, 含杂质较多荧光定量 PCR 结果显示, 根和叶的 Ct 值明显偏

温随超等 : 适宜当归实时荧光定量分析的总 RNA 提取方法研究 239 高, 均大于 30, 经电泳检测为引物二聚体, 说明无法满 足荧光定量分析的要求因此, 我们认为, 如果用 Trizol 法提取高质量的当归总 RNA, 就需要对宽泛的 [17] [18] Trizol 法加以改进和优化, 这与林海妹等 杨晓燕等 的研究结果一致 已有许多公司研制出了多种植物提取总 RNA 的 商业试剂盒, 但由于植物种类的多样性及 RNA 的特异 性, 采用宽泛型的试剂盒提取的 RNA, 其质量往往难 有保障 [19] 本研究用商业多糖多酚总 RNA 试剂盒提 取的当归组织总 RNA 虽然完整性较好, 纯度也基本能 满足荧光定量 PCR 的要求, 但总 RNA 的产率且较低, 甚至还出现由多糖及酚类物质引起的污染问题, 这对 RNA 纯度要求更高的后续研究产生较大影响, 同时商 业试剂盒的价格昂贵, 无疑将提高研究成本 [4] CTAB 法是植物组织提取总 RNA 的常用方法 [20] 为了防止当归总 RNA 提取过程中多酚物质的氧化, 去 除多糖和提高纯度, 本研究对文献报道的 CTAB 法进 行了改良, 即在裂解液中增加了能更好络合多酚类物 质的 PVP 结果表明, 经改进的 CTAB 法比 Trizol 法和 试剂盒法更能有效地去除当归多糖和酚类物质, 且提 取的总 RNA 纯度较高, 完整性较好, 产率较大由此 可见, 对当归组织而言,CTAB 法为一种稳定 经济 可 靠 适合实时荧光定量分析的总 RNA 提取方法 参考文献 [1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 [S]. 北京 : 中国医药科技出 版社,2010:124. [2] 王引权, 杜弢, 晋玲, 等. 甘肃当归生产中存在的问题及对策 [J]. 甘肃 农业科技,2008(11):31-33. [3] 王滨蔚, 车鹏燕, 何承忠, 等. 板栗子叶总 RNA 提取方法研究 [J]. 中 国农学通报,2012,28(22):34-38. [4] 吴田, 蓝增全. 茶梅花瓣总 RNA 提取方法的比较和分析 [J]. 中国农 学通报,2013,29(28):129-133. [5] 吴宏清, 王磊, 郭维, 等. 药用植物白木香高质量总 RNA 提取方法的研究 [J]. 中药材,2013 (7):1055-1059.. [6] 李曦, 张丽宏, 王晓晓, 等. 当归化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中药材,2013,36(6):1023-1028. [7] Muoki R C, Paul A, Kumari A, et al. An improved protocol for the isolation of RNA from roots of tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) [J]. Molecular biotechnology, 2012, 52(1):82-88. [8] Zhang Y, Wang R, Wang J, et al. A new potyvirus first isolated and identified from Angelica sinensis[j].virus genes,2009,39(1):120-125. [9] Yu G, Ma Y X, Duan J A, et al. Identification of differentially expressed genes involved in early bolting of Angelica sinensis (Apiaceae) [J]. Genetics and Molecular Research, 2012, 11(1):494-502. [10] 吴永娜, 胡静, 王引权, 等. 当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析 [J]. 中草药,2012,43(12):2485-2489. [11] Pandit S S, Mitra S S, Giri A P, et al. A quick method for isolating RNA from raw and ripe fleshy fruits as well as for co- isolating DNA and RNA from polysaccharide and polyphenoi-rich leaf tissues [J].Journal of Plant Biology,2007,50(1):60-64. [12] 钱君律, 朱融融, 黄进, 等. 纳米级壳寡糖 /DNA 复合物的制备和性能研究 [J]. 生物工程学报,2007,23(4):741-745. [13] 蔡荣, 许锋, 陈柳吉, 等. 银杏不同组织的总 RNA 提取方法的改进 [J]. 生物技术,2007,17(4): 38-41. [14] 李红熙, 徐美隆, 杨智. 一种适合葡萄多种组织的总 RNA 提取方法 [J]. 中国农学通报,2012,28(7):155-159. [15] 马月萍, 戴思兰, 马艳蓉. 荧光定量 PCR 技术在植物研究中的应用 [J]. 生物技术通报,2011,7:37-45. [16] 王梦娜, 武艳, 程国山, 等. 茶树叶片总 RNA 提取方法的比较研究 [J]. 植物生理学报,2013,49(1):95-99. [17] 林海妹, 郭安平, 王晓玲, 等. 三种改良提取长雄野生稻根叶总 RNA 方法的比较研究 [J]. 分子植物育种,2009,7(1):204-208. [18] 杨晓燕, 张波, 黄方爱, 等. 适合转录组测序的葡萄叶片总 RNA 试剂盒提取法的改进 [J]. 生物技术通报,2013,6:215-220. [19] 陈静, 高飞, 周宜君, 等. 改良 Trizol 法提取高质量蒙古沙冬青总 RNA[J]. 生物技术通报,2013(10):87-92. [20] 陈高, 单雷, 周丽侠, 等. 花生总 RNA 提取方法比较研究 [J]. 中国农学通报,2011,27(1):214-218.