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Easy Cloning T-vector (pec-t) 目录号 :T003

... 1 pec-t... 2 Easy Cloning T-vector... 2 2 Taq Master Mix... 5 2 Fast Taq Master Mix... 7 DL2000 Plus DNA Marker... 9 PCR A... 10 PCR... 10

SinoBio Easy Cloning T-vector 是一种 PCR 产物高效 TA 克隆的专用 T 载体 它由 pbluescript II KS 载体改造而成 : 保留了 pbluescript II KS 载体全部的酶切位点 ;PCR 产物插入位点处于多克隆酶切位点的中间, 其两侧都有众多的酶切位点可供选择 由于本载体以 pbluescript II KS 载体为基础构建而成, 所以它具有同 pbluescript II KS 载体相同的功能 :PCR 产物插入后可以利用 α- 互补性进行蓝白斑筛选, 挑选阳性克隆 可以用 M13 通用引物和 T7,T3 启动子引物对 PCR 产物进行测序 含有 T7 及 T3 RNA 聚合酶的启动子, 可以对插入片段进行体外转录 pec-t vector(25 ng/μl) 40μl T4 DNA Ligase 30μl 2 Quick Ligation Buffer 500μl 10 Ligation Buffer 500μl Control Insert(50 ng/μl) 10μl 两种 Ligation Buffer 中均不含连接酶 附赠 : 2 Taq Master Mix ( 快速上样型 ) 1ml 2 2 Fast Taq Master Mix ( 快速上样型 ) 1ml DL2,000 Plus DNA Marker 100μl -20 o C 提供 2 快速连接系统 (15 分钟即可完成连接反应 ) 及 10 传统型连接系统 ( 过夜连接可获得最佳连接效果 ), 具体使用说明见后 附赠 2 Taq Master Mix,2 Fast Taq Master Mix ( 快速 PCR 系统 ), 及 DL2,000 Plus DNA Marker, 满足您的 PCR 鉴定 电泳实验需求 Control Insert 克隆后的白色菌落中, 有 90% 以上含有 Insert DNA 片段 Control Insert 克隆后, 经测序确认 T 突出的存在 1

pec-t f1 (+) origin 135 441 LacZ alpha fragment 451 832 multiple cloning site 653 776 puc origin 1174 1841 Amp resistance gene 1992-2849 *www.sinobio.net Easy Cloning T-vector 1. Insert DNA 使用高保真酶扩增的 PCR 片段为平末端, 进行 TA 克隆前需先进行一步 加 A 反应 下表列出使用不同试剂扩增片段后 加 A 反应的需求 A Taq 酶 (E001,E005)Fast Taq(E029) Super Taq(E030,E034)Taq Plus (E009,007)Super Taq Plus(E032, E036) 及热启动 Taq 酶等 A Pfu 酶 (E002,E006) Fast Pfu(E031,E035) 及其他高保真酶类 2

PCR 产物作为 Insert DNA, 应该纯化后再进行载体连接, 尽量减少 PCR 产物中的短片段 DNA( 甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段 ) 残存引物等杂质对 TA 克隆效率的影响 2. Insert DNA T 可按以下方法计算 Insert DNA 的用量 : Insert DNA 和 T 载体的摩尔数比为 M (2~10:1 均可, 常用比例为 3:1), 假设 T 载体的使用量为 Y ( 单位 ng),insert DNA 长度为 I ( 单位 kb),t 载体大小为 V ( 单位 kb), 则 Insert DNA 的用量 X ( 单位 ng) 可用以下公式计算 : X = Y * M * I / V 一般情况下,T 载体的使用量 (Y) 为 50ng/ 反应, 而 Insert DNA 和 T 载体的摩尔数比 (M) 采用 3:1, 欣百诺目前推出的 3 种 T 载体大小 (V) 都为 3kb, 那么 1kb 大小 (I) 的 Insert DNA( 如试剂盒自带的 Control Insert 片段 ) 需要加入量 : X = 50 * 3 * 1 / 3 = 50 (ng) 3. 例如下午完成 PCR 片段制备, 需要傍晚前完成连接反应, 以便转化实验后可以过夜培养, 请采用快速连接体系 快速连接体系配制, 以 Control Insert(1kb) 为例 : ddh 2 O 6μl 2 Quick Ligation Buffer 10μl pec-t vector(25 ng/μl) 2μl Control Insert(50 ng/μl) 1μl T4 DNA Ligase 1μl 连接反应温度及时间 : 16 或 25 下, 保温 15 至 30 分钟 * 保温 5 分钟也能正常进行连接反应, 但反应效率略为降低 25 下进行连接, 其效果略差于 16 下连接效果 而更高的温度 (>26 ) 则较难形成环状 DNA 连接效率偏低时, 可适当延长连接反应时间, 但过长的连接时间 ( 如数小时 ) 连接效果反而会变差 一些较难连接的片段 ( 如大片段 ), 请采用传统型 10 T4 DNA Ligation Buffer 体系进行尝试 例如傍晚完成 PCR 片段制备, 需要连接过夜, 第二天进行转化实验, 请采用传统型 10 Ligation Buffer 3

传统型连接体系配制, 以 Control Insert(1kb) 为例 : ddh 2 O 14μl 10 Ligation Buffer 2μl pec-t vector(25 ng/μl) 2μl Control Insert(50 ng/μl) 1μl T4 DNA Ligase 1μl 连接反应温度及时间 : 16 保温 3 小时以上或过夜 * 10 Ligation Buffer 融化时, 如果出现少量沉淀属正常现象, 请于 37 保温溶解混匀后使用 连接反应亦可在 4 保温过夜, 或室温保温数小时, 但反应效率较 16 保温过夜略低, 实践表明, 连接反应的温度越低, 达到理想连接效率的所需时间越长, 温度较高则所需时间较短 4. 转化时请尽量使用较高效率感受态细胞, 以保证能得到比较多的阳性克隆数目 如果需要进行蓝白筛选时, 请确保宿主细胞具有正确的基因型 (F 编码的 [LacZ M15]) 产生 ω Fragment, 才可能和载体 DNA 产生的 LacZ α 多肽相结合, 表现出 β- 半乳糖苷酶活性 (α- 互补性 ) * : 由于 2 Quick Ligation Buffer 中含有 PEG 成分, 对于使用 2 Quick Ligation Buffer 的连接产物, 我们推荐使用化学方法制备的感受态来转化连接产物 如要采用电转化, 需先将快速连接产物进行柱纯化以去除 PEG 5. 欣百诺已推出的 3 种 T 载体试剂盒都可进行蓝白斑筛选, 但实际实验中由于欣百诺 T 载体试剂盒有着很高的阳性率, 蓝白斑筛选所起的减少鉴定步骤工作量的作用并不明显, 因此对于常规的 PCR 片段连接, 我们并不推荐增加蓝白斑筛选步骤, 而是直接进行阳性克隆检测 : 我们建议使用 PCR 的方法, 利用试剂盒自带的高速 PCR 扩增试剂 2 Fast Mast Mix 直接进行菌落 PCR 鉴定, 相关的操作请参考 2 Fast Mast Mix 使用说明 ( 第 7 页 ) 对较难一些较难克隆的片段( 如较大的 PCR 片段 ), 可考虑进行蓝白斑筛选, 以减少转化子鉴定的工作量 4

2 Taq Master Mix 本制品是将 PCR 反应所需的 Taq 酶 dntp 混合物 MgCl 2 以及反应缓冲液预先配置成的 2 倍浓度的混合物 SinoBio 2 Taq Master Mix 专为常规 PCR 扩增反应优化, 扩增长度可达 8kb, 能对 4kb 及其以下长度的片段进行高效地扩增 使用时只需在加入模板和引物并稀释到 1 倍浓度即可进行 PCR 反应, 大大地简化了操作过程, 减少了操作过程中的污染 SinoBio 2 Taq Master Mix 提供含快速上样型 / 普通型两种形式供您选择, 快速上样型已含染料 ( 蓝色 ), 在 PCR 反应完成后可直接电泳, 节省时间 经测试, 染料的加入不影响 PCR 反应 高效 : 以 λdna 为模板, 扩增长度可达 8kb, 高效扩增 4kb 片段 灵敏 : 可从 0.05ng 人基因组 DNA 模板中扩增出特定基因片段 稳定 : 反复冻融几十次,4 放置 30 天, 室温放置一周, 扩增性能不受影响 快捷 :PCR 反应所必需试剂全集于一管之中, 数分钟即可完成反应体系配制 便利 : 适用各种常规体系,PCR 反应后可直接电泳 ( 快速上样型 ) 1) 常规 PCR 鉴定 2) 小片段目标基因克隆 3) 平端 PCR 产物加 A 1 Taq Master Mix 1 反应缓冲体系 (ph 8.5), datp, dgtp, dctp, dttp 各 200μM, 2mM MgCl 2, Taq 酶及稳定剂 -20 o C 使用本试剂扩增得到的 PCR 产物 3' 端有一突出 A 碱基, 可直接克隆于 T 载体中 当扩增较长片段时, 推荐使用 SinoBio Taq plus Master Mix, Taq plus 对于较长的 DNA 片段扩增具有更高的扩增效率及保真度 经多次柱纯化,SDS-PAGE 检测纯度大于 95%;PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残 5

留, 无核酸内 外切酶污染 50μl PCR 2 Taq Master Mix 25μl 上游引物 0.2-1.0μM( 终浓度 ) 下游引物 0.2-1.0μM( 终浓度 ) 模板 1-50ng( 质粒 ) 10ng-1μg( 基因组 ) ddh 2 O 至 50μl 当扩增片段 <3K 时 94 1 分钟 30 秒 30 次循环 : 94, 30 秒 57, 30 秒, 72, 60 秒 /1kb( 根据产物长度调整 ) 72 5 分钟 4 保温 当扩增片段 3K( 推荐引物长度 30bp) 时 94 20 秒 30 次循环 : 94,5 秒, 68,60 秒 /1kb( 根据产物长度调整 ) 72 5 分钟 4 保温 5ng 0.5ng 0.05ng 0.005ng 0.0005ng M 10 20 30 40 50 M 0.5 bp 1kb 2kb 4kb 6kb 8kb M 50μl 5 ng ~ 0.0005 ng DNA, 500 bp T Taq Master Mix( ) SinoBio Taq Master Mix 0.005ng 0.05ng 50μlLamda DNA 10 20 30 40 50 SinoBio Taq Master Mix SinoBio Taq Master Mix 50 PCR SinoBio Taq Master Mix 50μlLamda DNA 500bp 1kb 2kb 4kb 6kb 8kb SinoBio Taq Master Mix 500bp 8kb SinoBio Taq Master Mix 6

2 Fast Taq Master Mix 本制品采用 2 Master Mix 形式, 将 PCR 反应所需的聚合酶 dntp 混合物 MgCl 2 上样染料以及反应缓冲液预先配置成 2 倍浓度的混合物 使用时只需加入模板和引物并稀释到 1 倍浓度即可进行 PCR 反应, 简化了操作过程, 减少了操作过程中的污染 上样染料的加入不影响 PCR 反应, 在 PCR 反应完成后可直接电泳, 节省时间 本制品采用了新型的 Fast Taq 酶, 该酶是 SinoBio 采用分子进化技术在普通 Taq 酶基础上改造 制备的新型快速聚合酶, 其扩增速度为普通 Taq 酶的数倍,72 保温 15 秒可延伸 1kb 以上, 因此可大幅度减少 PCR 延伸过程所需要的时间, 达到缩短整个 PCR 反应的目的 ** Fast Taq 扩增速度为 15 秒 /kb, 长时扩增可能会引起非特异性扩增 省时 : 配以高速 PCR 聚合酶 Fast Taq 大幅缩短 PCR 鉴定所需时间 高效 : 以 λdna 为模板, 扩增长度可达 8kb, 能高效扩增 4kb 片段 稳定 : 反复冻融几十次,4 放置 30 天, 室温放置一周, 扩增性能不受影响 1) 常规 PCR 鉴定 2) 小片段目标基因克隆 3) 平端 PCR 产物加 A 1 Fast Taq Master Mix 1 反应缓冲体系 (ph 8.5), datp, dgtp, dctp, dttp 各 200μM, 2mM MgCl 2, Taq 酶及稳定剂 -20 o C 使用本制品扩增得到的 PCR 产物 3' 端有突出 A 碱基, 可直接克隆于 T 载体中 经多次柱纯化,SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一的目的条带 ;PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留, 无核酸内 外切酶污染 7

50μl PCR 2 Fast Taq Master Mix 25μl 上游引物 0.2-1.0μM( 终浓度 ) 下游引物 0.2-1.0μM( 终浓度 ) 模板 微量菌液或菌体 或 1ng-500g( 基因组 DNA) ddh 2 O 至 50μl 当扩增片段 <3K 时 94, 1 分钟 30 秒 30 次循环 : 94,30 秒 57,30 秒 72, ( 根据产物长度调整 ) 72, 5 分钟 4, 保温 当扩增片段 3K( 推荐引物长度 30bp) 时 94, 1 分钟 30 秒 30 次循环 : 94,5 秒 68, ( 根据产物长度调整 ) 72, 5 分钟 4, 保温 8

DL2000 Plus DNA Marker SinoBio DNA Marker 为预混 1 Loading Buffer 的 DNA 溶液, 可直接电泳 100,250,500,750( 加亮 ),1000,2000, 3000( 加亮 ),4000,5000 bp, 其中 750,3000bp 条带浓度加倍, 约为 20 ng/μl, 显示为亮带, 使电泳结果更容易辨认, 亦可用于定量 3000 750 短期使用可置于 4 C, 长时间保存 ( 超过 90 天 ) 请冻存于 -20 C 10 mm Tris-HCl,10mM EDTA,5% Glycerol,0.0025% 溴酚蓝 5 μl 每孔 ( 或按每毫米胶孔宽度上 1 μl 量 ) SinoBio DNA Marker 750 3000 3000 3000 3000 3000 500 500 注 : 图中斜体标注的条带为指示条带, 浓度约为 20 ng/μl, 其余条带大小为 10 ng/μl 9

SinoBio PCR A 取 1-7μl 纯化的 PCR 产物 ( 约 100ng) 加上 2μl 5 Taq DNA 聚合酶缓冲液 ( 含有 MgCl 2 ), 加入终浓度为 0.25 mm 的 datp( 推荐 ) 或 dntp, 以及 1U 的 Taq DNA 聚合酶, 加蒸馏水至 10 μl,72 反应 15-30min 取 1-2μl 进行连接反应 ( 产物纯化后连接效果更佳 ) 可按等比例扩大反应体系 取 5-10μl 纯化的 PCR 产物 ( 约 100ng), 加入等体积 2 Taq PCR Master Mix, 72 反应 15-30min 取 1-2μl 进行连接反应 ( 产物纯化后连接效果更佳 ) 可按等比例扩大反应体系 SinoBio PCR 1. 配置 20μl PCR 反应体系 2. 用无菌牙签或 10μl 小枪头挑取单个菌落 3. 接种至另一相应抗生素平板上, 在编号的方格内保种 4. 将此牙签或小枪头在 PCR 反应液中轻轻搅动几次, 您也可以挑取单菌落后先在 PCR 反应液中轻轻搅动两 三次, 其后将牙签或小枪头置于装有 3ml 含相应抗生素培养基的试管中摇菌后保种 5.PCR 反应预变性, 采用 95 2~5 分钟以充分裂解细菌释放模板 DNA 6. 取 5~10μl PCR 产物跑胶检测, 以确定阳性克隆 1. 取若干个 1.5ml 无菌 EP 管, 加入相应抗性的培养基 0.5ml 2. 用无菌牙签或 10μl 小枪头挑取单个菌落置于 1.5mlEP 管进行摇菌培养 3. 培养若干小时, 待菌液略微出现浑浊时, 直接吸取菌液进行菌液 PCR 鉴定 4. 配置 20μl PCR 反应体系, 并加入微量 (~0.2μl) 菌液作为模板 5.PCR 反应预变性, 采用 95 2~5 分钟以充分裂解细菌释放模板 DNA 6. 取 5~10μl PCR 产物跑胶检测, 以确定阳性克隆 如需扩增较长片段, 推荐使用 SinoBio 2 Fast Taq Master Mix, 将大幅缩短 PCR 鉴定所需的时间, 并简化实验操作步骤 10

T T001-01A Simple Cloning T-vector(pSC-T) 1μg 500 T002-01A Easy Digestion T-vector (ped-t) 1μg 500 T003-01A Easy Cloning T-vector (pec-t) 1μg 500 PCR E005-02A 2 Taq Master Mix 1ml 3 支 95 E005-02B ( 快速上样型 ) 1ml 15 支 428 E029-02A 2 Fast Taq Master Mix 1ml 3 支 190 E029-02B ( 快速上样型 ) 1ml 15 支 855 E007-02A 2 Taq Plus Master Mix 1ml 3 支 120 E007-02B ( 快速上样型 ) 1ml 15 支 ) 540 E017-02A Hot Start Taq DNA 聚合酶 250U 220 E030-02A Super Taq DNA 聚合酶 250U 230 E009-02A Taq Plus DNA 聚合酶 250U 120 E018-02A Hot Start Taq plus DNA 聚合酶 250U 320 E032-02A Super Taq Plus DNA 聚合酶 250U 260 E002-02A Pfu DNA 聚合酶 250U 180 E031-02A Fast Pfu DNA 聚合酶 250U 310 DNA Marker DM005-01A DL2000 DNA Marker 500μl 120 DM006-01A DL2000 Plus DNA Marker 500μl 180 DM007-01A 1kb DNA Ladder I 500μl 160 DM008-01A 1kb DNA Ladder Plus I 500μl 220 DM009-01A 1kb DNA Ladder II 500μl 180 DM010-01A 1kb DNA Ladder Plus II 500μl 240 DM011-01A λ/hindiii DNA Marker 500μl 120 11

12 C041 mil-1α 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C042 mil-1β 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C033 hil-1ra 2μg/ 120;10μg/ 360;50μg/ 1080 C013 hil-2 2μg/ 240;10μg/ 600;50μg/ 1,200 C050 hil-4 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C009 hil-6 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C035 hil-8 /72 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C037 hil-8 /77 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C027 hil-10 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C018 mil-10 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C019 ril-10 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C006 hil-11 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C016 hil-15 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C045 hil-16 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C021 hil-17a 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C030 hil-17f 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C047 mil-22 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C053 hil-31 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C002 hg-csf 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C028 PEG-GCSF 2μg/ 1200;10μg/ 2400;50μg/ 6600 C003 hgm-csf(e.coli) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C040 hgm-csf(pichia) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C011 hcd40l 2μg/ 240;10μg/ 600;50μg/ 1,200 C051 hmog 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C025 hifnα-2a 2μg/ 120;10μg/ 240;50μg/ 600 C005 hifnα-2b 2μg/ 120;10μg/ 240;50μg/ 600 C007 PEG-IFNα2b 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C014 hifnγ 2μg/ 120;10μg/ 240;50μg/ 600 C008 htnfα 2μg/ 240;10μg/ 600;50μg/ 1,200 C036 htnfα-m 2μg/ 240;10μg/ 600;50μg/ 1,200 C022 htrail 2μg/ 240;10μg/ 600;50μg/ 1,200 C067 hleptin(ob) 2μg/ 120;50μg/ 360;1mg/ 1980 C055 hpf-4 (CXCL4) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C056 hnap-2 (CXCL7) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C054 hip-10 (CXCL10) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C058 BRAK (CXCL14) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C061 hmip-1α(ccl3) 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C062 hrantes(ccl5) 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C063 hmcp-2(ccl8) 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C064 hlec(ccl16) 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C065 hctack(ccl27) 2μg/ 360;10μg/ 960;50μg/ 1,800 C060 hβ-ngf 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C029 hegf 10μg/ 120;50μg/ 360;1mg/ 2200 C010 hpth1-84 10μg/ 120;50μg/ 360;1mg/ 2200 C012 hbmp2 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C038 hvegi 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980 C017 hlif 2μg/ 600;10μg/ 1,500;50μg/ 3,980 C034 hscf 2μg/ 600;10μg/ 1,200;50μg/ 3,980

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400-600-0940 上海欣百诺生物科技有限公司吴江近岸蛋白质科技有限公司 720 2 304 (021) 50798028 50798027 021-50798028-13 Email sales@sinobio.net www.sinobio.net www.novoprotein.com