微信订购 : 扫一扫右侧二维码 网站订购 :www.cwbiotech.com 服务热线 :4006-222-360 版本号 :04/2017 NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina 二代测序快速 DNA 建库试剂盒 (Illumina) 目录号 :CW2585S(24 rxns) CW2585M(96 rxns) 保存条件 :-20 保存, 干冰运输 产品内容 Component CW2585S CW2585M 24 rxns 96 rxns End Prep Enzyme Mix 48 μl 192 μl 10 End Repair Reaction Buffer 200 μl 800 μl T4 DNA Ligase 48 μl 192 μl T4 DNA Ligase Buffer 400 μl 2 800 μl 2 HiFidelity PCR Mix 600 μl 2 1.2 ml
产品简介本试剂盒提供了 DNA 文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液, 包含除接头与 PCR 引物外的所有成分, 用于 illumina 二代测序平台 DNA 文库构建 和一般建库方法相比, 该试剂盒操作简单 方便, 极大地缩短了文库构建时间 另外, 试剂盒采用高保真 DNA 聚合酶进行文库富集, 无偏好的 PCR 扩增, 扩大了序列的覆盖区域, 可高效制备用于 illumina 二代测序平台的 DNA 文库 试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证, 最大程度上保证了文库构建的稳定性 产品特点 末端补平, 磷酸化, 加 A 一步完成 不需纯化, 直接加接头 超保真扩增, 最大程度上降低了扩增偏好性 支持多种样本, 且所得文库能够用于 Illumina GAIIx,HiSacnSQ HiSeq 2500/2000 /1000 和 MiSeq sequencing 等测序平台的测序 自备仪器 试剂和耗材 1. 磁力架 : 建议使用 DynaMag TM-2 (Cat.No. 12321D) 2.DNA 纯化回收试剂盒 : 建议使用康为磁珠法 DNA 纯化回收试剂盒 (Cat.No. CW2508) 3. 样本接头引物试剂盒 : 建议使用康为二代测序多样本接头引物试剂盒 I/II (Cat. No. CW2586/CW2587 ) 4. 无水乙醇,EB (10 mm Tris-HCl, ph 8.0), 去离子水 (ph 在 7.0-8.0 之间 ) 5. 反应管 : 建议使用低吸附的 PCR 管与 1.5 ml 离心管 ; 枪头 : 建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒 文库样本污染 实验前准备及重要注意事项 1. 避免试剂的反复冻融, 建议您首次使用试剂盒后将剩余试剂分装保存 2.PCR 产物因操作不当极易产生污染, 导致实验结果不准确, 建议将 PCR 反应体系配制区与 PCR 产物纯化区隔离, 并使用专门的移液器, 定时对各实验区域进行清洁 1
DNA 建库流程示意图 2 小时 40 分钟得到 DNA 文库 DNA 末端修复 (~50min) Adaptor 连接 (~15min) 连接 adaptor 后的 DNA 片段的选择性回收 PCR 扩增 (~15min) PCR 产物纯化 (30min) 补平 磷酸化 加 A 一步完成 两步操作一管完成 操作步骤 样本要求 : 5 ng-1 μg 打断的双链 DNA, 溶于 EB(10 mm Tris-HCl ph 8.0) 或去离子水中 DNA 纯度要求 :OD 260 /OD 280 =1.8~2.0 DNA 末端修复反应 1. 向 200 μl PCR 管中加入以下试剂 : 试剂名称 10 End Repair Reaction Buffer End Prep Enzyme Mix fragmented DNA RNase-free Water 体积 6.5 μl 2 μl X(5 ng-1 μg) Up to 65 μl 2. 用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀, 短暂离心, 使所有组分收集到管底 3. 将上述 PCR 管置于 PCR 仪中, 热盖打开, 反应程序如下 : 15 min @ 12 15 min @ 37 20 min @ 72 Hold on 4 Adaptor 连接建议使用康为 adaptor 进行连接, 也可选择使用 NEB illumina 公司的 adaptor, 具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书 以下为使用康为 adaptor 进行连接的操作步骤 : 2
1. 向上述已完成 DNA 末端修复的反应液中直接加入以下试剂 : 试剂名称 T4 DNA ligase buffer for illumina T4 DNA ligase Adaptor 体积 14 μl 2 μl 2.5 μl 此时管中溶液总体积为 83.5 μl 注意 : 若起始样本量少于 100 ng, 请将 adaptor 用去离子水稀释 10 倍至 1.5 μm 后使用 2. 用枪头将上述试剂吹吸混匀, 短暂离心, 使溶液收集到管底 3.20 温浴 15 分钟 注意 : 若此操作使用 pcr 仪, 请将热盖关闭 DNA 片段的选择性回收建议使用康为世纪磁珠法 DNA 纯化回收试剂盒 (CW2508) 进行 DNA 片段选择性回收 注意 :DNA 片段选择性回收是可选步骤, 若起始样本量低于 50ng, 不建议进行 DNA 片段选择性回收, 可参考说明书第 4 页, 直接进行 DNA 片段的纯化 另外构建不同大小的 DNA 文库时,DNA 片段选择性回收的磁珠使用量不同, 具体磁珠用量可参照附表 1( 若使用除康为以外厂家的磁珠, 需自行摸索最佳磁珠用量 ) 以下操作步骤中, 可选择回收 DNA 片段长度峰值为 320bp( 插入片段长度 200bp), 反应起始体积为 100 μl 1. 涡旋振荡 CMPure20 秒, 使其彻底混匀为均一溶液 2. 向连接反应液中加入 16.5 µl 去离子水, 使 adaptor 连接反应缓冲液体积至 100μl 注意 : 若使用 NEB adaptor, 只需要加入 13.5μl 去离子水 3. 将上述 adaptor 反应缓冲液转移至一新的 1.5ml 离心管中 4. 加入 70 µl 混合均匀的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后, 室温静置 5 分钟 5. 短暂离心, 将离心管置于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 小心地将上清溶液转移至新的 1.5 ml 离心管中, 并弃去磁珠 注意 : 不要弃除上清 6. 向上清中加入 25 µl 混合均匀的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后室温放置 5 分钟 7. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 小心吸取上清并弃除, 期间避免接触已结合目标 DNA 的磁珠 注意 : 不要弃除磁珠 8. 继续保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入 250 µl 新配置的 80% 乙醇, 室温放置 30 秒, 待悬起的磁珠完全吸附后, 小心弃除上清 3
9. 重复步骤 8 10. 保持离心管固定于磁力架上, 室温静置 10 分钟, 使磁珠在空气中干燥 11. 将离心管从磁力架上取下, 加入 28 µl 10 mm Tris-HCl(pH 8.0) 或去离子水 ( 自备 ), 涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中, 室温静置 5 分钟 12. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 将 23 μl 洗脱液转移至一个新的 PCR 管中 ; 注意 : 一定不要转移磁珠, 微量磁珠污染可影响后续 PCR 反应的正常进行 另一种方案 : DNA 片段的纯化 1. 涡旋振荡 CMPure20 秒, 使其彻底混匀为均一溶液 2. 将 adaptor 连接反应液转移至一新的 1.5 ml 离心管中 3. 加入 1 倍样品体积的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后, 室温静置 5 分钟 4. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 小心吸取上清并弃除, 期间避免接触已结合目标 DNA 的磁珠 注意 : 不要弃除磁珠 5. 继续保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入 250 µl 新鲜配置的 80% 乙醇, 室温放置 30 秒, 待悬起的磁珠完全吸附后, 小心弃除上清 6. 重复步骤 5 7. 保持离心管固定于磁力架上, 室温静置 10 分钟, 使磁珠在空气中干燥 8. 将离心管从磁力架上取下, 加入 28 µl EB( 自备 ) 或去离子水, 涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中, 室温静置 5 分钟 9. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 将 23 μl 洗脱液转移至一个新的 PCR 管中 附表 1: 不同片段选择回收时磁珠建议用量 DNA 文库大小 磁珠用量 插入片段 150bp 200bp 250bp 300-400bp 400-500bp 500-700bp ( 插入片段 +adaptor) 270bp 320bp 400bp 400-500bp 500-600bp 600-800bp 第一次选择 85 70 55 50 45 35 第二次选择 25 25 20 20 20 15 4
PCR 扩增 1. 在 PCR 管中加入以下试剂并混匀 试剂名称 体积 连接 adaptor 后的 DNA 片段 23 μl 2 HiFidelity PCR Mix 25 μl Univesial primer 1 μl Index primer 1 μl 总体积 50 μl 2.PCR 反应条件 步骤 温度 时间 预变性 98 30 s 变性 98 10 s 退火 65 30 s 延伸 72 30 s 终延伸 72 5 min 6-16 个循环 注意 : 建议 1 μg 样本起始量时 PCR 循环数为 6 个循环,50 ng 时 10 个循环,5 ng 时 14-15 个循环,PCR 循环数也可根据实验需要进行优化 PCR 产物的纯化 1. 涡旋振荡 CMPure20 秒, 使其彻底混匀为均一溶液 2. 将 PCR 反应液转移至一新的 1.5 ml 离心管中 3. 加入 1 倍样品体积的 CMPure, 涡旋震荡 5 秒钟后室温静置 5 分钟 4. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上, 使磁珠和上清溶液分离, 直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ) 小心吸取上清并弃除, 期间避免接触已结合目标 DNA 的磁珠 注意 : 不要弃除磁珠 5. 继续保持离心管固定于磁力架上, 向离心管中加入 250 µl 新鲜配置的 80% 乙醇, 室温放置 30 秒, 待悬起的磁珠完全吸附后, 小心弃除上清 6. 重复步骤 5 7. 保持离心管固定于磁力架上, 室温静置 10 分钟, 使磁珠在空气中干燥 8. 将离心管从磁力架上取下, 加入 30 µl EB( 自备 ) 或去离子水, 涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中, 室温静置 5 分钟 9. 短暂离心, 将离心管放于磁力架上直至溶液澄清 ( 约需 5 分钟 ), 将洗脱液转移至一个新的 PCR 管中约 25 μl,dna 文库在 -20 保存 5
文库质量检测文库浓度为了得到高质量的测序结果, 需要对 DNA 文库进行精确定量, 首先推荐使用 Real-time PCR 方法对 DNA 文库进行绝对定量 此外, 还可使用荧光染料法, 如 Qubit 法或荧光染料 picogreen 法, 此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法 最终可使用以下近似公式换算 DNA 文库的摩尔浓度 文库平均总长度 近似转换公式 成簇反应 DNA 文库浓度 200 bp 1 ng/μl=7.5 nm 6-12 pm 300 bp 1 ng/μl=5.0 nm 6-12 pm 400 bp 1 ng/μl=3.8 nm 6-12 pm 500 bp 1 ng/μl=3.0 nm 6-12 pm 文库长度分布制备好的 DNA 文库可用琼脂糖凝胶电泳或 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测 DNA 文库中的片段长度分布范围 L S 图 1:Agilent 2100 Bioanalyzer 文库分析结果 L:DNA Ladder; S: 使用 200ng 人基因组 DNA 构建文库, 磁珠进行选择回收后结果 6
文库结构 5 -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC GATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNN NNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3 NNNNNN:index, 6bases 7 本产品仅供科研使用, 请勿用于临床诊断及其他用途 技术支持 :service@cwbiotech.com 网址 :www.cwbiotech.com