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Discover-sc TM WTA Kit Vazyme Biotech Co., Ltd 网站 /Web: 咨询热线 /Tel: 400-600-9335 销售 /Sales: sales@vazyme.com 技术支持 /Support: support@vazyme.com 技术服务 /Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 5.1

目录 Catalog 产品概述产品组成储存方式适用范围用户自备仪器及试剂使用方案

1/ 产品概述 基于二代测序的大规模序列分析技术极大的推进了快速的基因组和转录组序列分析 转录组的测序因为不需要对整个转录组预先设计探针并且可以检测未知转录本, 已经逐渐取代传统的基因表达谱芯片成为首选的转录组分析方案 但是转录组测序需要大量的 RNA 做为起始模板, 这就限制了使用二代测序技术在单细胞和其它微量样本转录组序列分析上的应用 单细胞或者微量样本首先需要进行转录组的扩增才能得到可以进行序列分析的大量起始模板 基于大量起始 RNA 的转录组测序通常要先将核糖体 RNA 从总 RNA 中去除, 以避免大量的核糖体 RNA 对测序的影响 去除了核糖体的 RNA 再使用随机引物进行逆转录 cdna, 这样既消除了核糖体 RNA 的影响又保证了全长 cdna 的产出 但是基于单细胞的转录组测序由于起始总 RNA 量极少, 传统的核糖体 RNA 去除会造成样品的损失, 导致转录组测序不完全. Discover-sc WTA Kit 在不去除核糖体 RNA 的情况下使用 oligo dt 做为逆转录引物来避免核糖体 RNA 的影响并最大程度上保证样品序列的完整性 为了保证得到大量的全长的 cdna,discover-sc WTA Kit 应用逆转录酶的 template-switching 活性在逆转录的全长 cdna3 末端 ( 即相应的 mrna 的 5 末端 ) 加上一段接头序列, 这段接头序列可用于全长 cdna 的扩增进而得到整个 mrna 的序列, 从而有效避免了 3 偏好 本试剂盒利用优化的反应体系实现单细胞转录组和微量 RNA 的高覆盖度的扩增并可得到足够的可用于二代测序的双链 DNA 低质量的样品会影响最终的 cdna 产量和完整度, 应尽量避免使用已发生 RNA 降解的样品作为起始样本 正常情况下 Discover-sc WTA Kit 根据使用模板不同一个反应可以产生 2-20 ng 高覆盖度的转录组 cdna Discover-sc WTA Kit-Box 2 组分 Lysis Buffer RNase Inhibitor Oligo dt Primer dntp Mix DTT 5 FS Buffer Discover-sc Reverse Transcriptase 2 Discover-sc PCR Mix Discover-sc WTA PCR Primer Elution Buffer Nuclease-free H 2 O 3/ 储存方式 50 μl 10 μl 20 μl 6 μl 6 μl 150 μl 6 μl 100 μl 20 μl 40μl 300 μl 200 μl 40 μl 80 μl 96 μl 600 μl 2 2 400 μl 80 μl 96 μl 160 μl 192 μl 1.2 ml 2 2 Box 1 收到后于 -70 储存,Box 2 中 Lysis Buffer-20 储存, 溶解之后 4 储存, 其它成分 -20 储存 4/ 使用范围 N701-01 N701-02 N701-03 N701-04 (12 rxn) (24 rxn) (48 rxn) (96 rxn) 本产品仅用于分子生物学及其它科学研究目的, 不能应用于临床诊断和治疗 2/ 产品组成 Discover-sc WTA Kit-Box 1 组分 Discover-sc TS Oligo Control RNA (1 μg/μl) N701-01 N701-02 N701-03 N701-04 (12 rxn) (24 rxn) (48 rxn) (96 rxn) 96 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5/ 用户自备仪器及试剂 PCR 仪 80% 乙醇无核酸酶 PCR 管低吸附 EP 管 (Eppendorf #022431021) 磁力架 VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411) 或其他等效性 DNA 纯化产品 01/ 02

Template-switching 介导的全长 cdna 合成示意图 样品要求总 RNA 本试剂盒可用低至 10 pg 的总 RNA 作为起始模板 但是如果有更多的样本, 我们推荐使用更多的总 RNA 作为起始模板 总 RNA 的完整性影响 cdna 文库的平均大小及多样性, 请勿使用已发生降解的 RNA 细胞本试剂盒可以以单个细胞为起始模板构建 cdna 文库, 冷冻保存过的细胞会降低 cdna 文库的产量, 建议使用新鲜的细胞进行实验 本试剂盒不适用于固定过的细胞样品 6/ 使用方案第一链合成 1) 准备 1 Sample Buffer Lysis Buffer RNase Inhibitor 19 µl 20 µl 2) 在 RNase-free 的 PCR 管中加入以下成分 : 1 Sample Buffer Oligo dt primer dntp Mix 2 µl 4 µl 3) 将分离的细胞样品或者纯化的 RNA 加入到上述 PCR 管中 震荡混匀并短离心收集后立即置于冰上 注 : 请尽量降低样品体积以减少对体系的影响, 推荐样品体积小于 0.5 μl 4) 将 PCR 管中的反应体系置于预热的 PCR 仪中进行以下反应程序 72 4 3 min forever 5) PCR 仪程序达到 4 之后取出 PCR 管并置于冰上 03/ 04

6) 按顺序配置以下反应混合液 扩增循环数参考 FS Buffer 2 µl 总 RNA 作为起始 细胞作为起始 参考循环数 DTT 0.5 µl 10 ng 1000 cells 9 RNase inhibitor Discover-sc TS Oligo Discover-sc Reverse Transcriptase Nuclease-free H 2 O 0.25 µl 0.5 µl 1.25 µl 5.5 µl 1 ng 100 pg 10 pg 100 cells 10 cells 1 cell 注 : 细胞样品可根据细胞大小增加 ( 含较少 RNA 的小的细胞 ) 或者减少 ( 含较多 RNA 的大的细胞 ) 扩增循环数 12 15 18 7) 将以上反应反应混合液加入到第 5 步的含样品的 PCR 管中 使用移液器小心混匀并短暂离心收集 8) 在 PCR 仪中按以下程序进行反应 42 90 min 70 15 min 4 forever cdna 扩增 1) 按顺序配置以下 PCR 反应混合液成分体积 2 Discover-sc PCR Mix 12.5 µl Discover-sc WTA PCR primer 0.5 µl Nuclease-free H 2 O 2 µl 15 µl 2) 将 15 μl PCR 反应混合液加到第 8 步的 10 μl 第一链合成产物中, 混匀并短暂离心收集 PCR 产物纯化本步用于纯 PCR 产物, 并从最终文库中去掉引物聚体 注 : 使用前请将 VAHTS DNA Clean Beads 震荡混匀并置于室温至少 30 分钟 1) 加 25 μl VAHTS DNA Clean Beads 到上述 PCR 反应体系中, 使用移液器混匀 10 次以上保证整个体系均匀 2) 室温孵育 8 分钟 3) 将 PCR 管置于磁力架上 5 分钟以上以保证 VAHTS DNA Clean Beads 完全吸附 4) 保持 PCR 管在磁力架上, 小心弃去上清, 注意不要扰动到 VAHTS DNA Clean Beads 5) 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇, 注意加入乙醇时不要扰动 VAHTS DNA Clean Beads, 孵育 30 秒并弃掉上清 6) 重复步骤 5 一次 7) 短暂离心收集液体, 将 PCR 管置于磁力架上 30 秒, 弃去所有残留的乙醇 8) 开盖, 空气中干燥 3 分钟 9) 加入 17 μl Elution Buffer 到 PCR 管中覆盖 VAHTS DNA Clean Beads, 将 PCR 管从磁力架上取下并重悬 VAHTS DNA Clean Beads 10) 室温孵育 2 分钟 11) 短暂离心收集液体到管底, 并将 PCR 管置于磁力架上保持 1 分钟以上以保证溶液澄清 12) 将含 cdna 文库的上清转移到新的 EP 管中,-20 保存 98 1 min 72 98 65 72 10 s 15 s 6 min 5 min x cycles 文库验证取 1 μl 扩增的 cdna 文库使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 和 High Sensitivity DNA Chip 验证 正常情况下, 无模板阴性对照无产物, 成功的反应根据使用的起始模板不同产出 2-20 ng 分布于 400-10000 bp 的 cdna 文库, 文库的 peak 位于 2000 bp 左右 05/ 06

Agilent 2100 Bioanalyzer 检测从单个 293T 细胞中扩增的 cdna 文库 将 cdna 制备成适用于 illumina 平台的测序文库推荐使用 1 ng cdna 通过 TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD503) 或者 Nextera XT DNA Library Preparation Kit(Illumina #FC-131-1024) 制备测序文库 操作过程请参考试剂盒说明书 07