2009 年 8 月 王 泽等 大鼠肝窦内皮细胞的分离 鉴定及纯度 活性分析 洗液即含窦内皮细胞[9] 取少许细胞进行台盼蓝染色 镜检细胞形态和细胞活性 当细胞收率和活性 90 % 红细胞数量 0 1 %时 视为合格样品 最后 将本组 6 只大鼠中所得的合格细胞悬液混合备用 2 2

27 8 2009 8 1004-3918 2009 08-0930-05 HENAN SCIENCE Vol27 No8 Aug 2009 1 2 1 2 1 2 2 1 2 2009-06-12 1 453007 2-453007 Higgins 2/3 parital hepatectomy PH 60 % Percoll hepatic sinusoidal endothelial cell SEC 14 cluster of differentiation 14 CD14-1 endothelin-1 ET-1 regenerating liver RL RT-PCR CD14 ET-1 mrna CD14 ET-1 CD14 ET-1 95 % PH CD14 ET-1 mrna Q 2-33 A [1] Higgins [2] 2/3 44 %~ 60 % 2 %~3 % [3] [4] CD40 CD54 CD80 CD86 MHCI MHCII [5] T mrna [6] 60 % [7] Percoll RT-PCR 1 2/3 RT-PCR [8] 4 PBS 3 1 10 8 /ml 10 ml 4 ml 60 % Percoll 6 ml 4 200 g 5 min PBS 4 400 g 2 2 min 1 10 8 /ml 10 μl 31 cluster of differentiation 31 CD31 PE 4 15 min ml 10 μl PE 4 15 min - 4 PBS 2 4 PBS 081100910700 1985-1958-

2009 年 8 月 王 泽等 大鼠肝窦内皮细胞的分离 鉴定及纯度 活性分析 - 931 - 洗液即含窦内皮细胞[9] 取少许细胞进行台盼蓝染色 镜检细胞形态和细胞活性 当细胞收率和活性 90 % 红细胞数量 0 1 %时 视为合格样品 最后 将本组 6 只大鼠中所得的合格细胞悬液混合备用 2 2 1 结果 大鼠肝再生中窦内皮细胞的形态结构变化 与肝板密切接触 细胞质呈阳性 细胞核显 研究表明 对照组 CD14 和 ET 1 阳性细胞贴于整个肝窦壁上 阴性 图 1 a1 阳性细胞界限清楚 形态不规则 细胞呈扁平状 核为长梭形 核仁不明显 阳性细胞数约占肝 脏细胞总数的 2 4 % 图 1 a2 a3 分离纯化的窦内皮细胞背景干净 细胞圆整 核呈偏心状 核异染色质浓 密 单个分散 折光性强 96 %以上细胞的胞质区显示 CD14 和 ET 1 阳性 且阳性着色较深 图 1 a4 a5 大 鼠 2/3 肝切除后 6 h 残肝的 CD14 和 ET 1 阳性细胞数目和分布类似于对照组 图 1 b1 阳性细胞数约占肝 脏细胞总数的 2 4 % 图 1 b2 b3 分离纯化的窦内皮细胞单个分散 背景干净 呈卵圆形或星型 折光性 强 核小而圆位于细胞一侧 仁不清晰 95 %以上细胞的胞质区显示 CD14 和 ET 1 阳性 图 1 b4 b5 大 鼠 2/3 肝切除后 12 h 残肝的 CD14 和 ET 1 阳性细胞数目增多 均匀贴于整个肝窦壁上 在肝窦间隙中可见 少量阳性细胞 图 1 c1 阳性细胞约占细胞总数的 2 7 % 图 1 c2 c3 分离纯化的细胞背景干净 细 胞单个分散 细胞外观呈轻度异形状 细胞胞质着色较浅 胞质内异染色质较多 有部分细胞呈细长形或不规 则形 少量细胞有伪足 折光性强 97 %以上细胞的胞质区显示 CD14 和 ET 1 阳性 图 1 c4 c5 大鼠 2/3 肝切除后 36 h 再生肝的 CD14 和 ET 1 阳性细胞均匀贴于整个肝窦壁上 肝窦间隙中阳性细胞数量增多 部分 肝索上有阳性细胞出现 图 1 d1 其细胞膜呈伪足状突 起插入到肝细胞膜内陷的囊 袋 中 阳 性 细 胞 约 占 细 胞 总 数的 3 7 % 图 1 d2 d3 分离的窦内皮细胞大小不一 胞质清亮 细胞器异染色质少 细胞外观己趋于卵圆形 96 % 以上细胞的胞质区显示CD14 和 ET 1 阳性 不过阳性染色较 浅 图 1 d4 d5 大 鼠 2/3 肝切除后 72 h 再生肝的 CD14 和 ET 1 阳性细胞贴于 整个肝窦壁上 细胞数量开始 减少 图 1 e1 细胞轮廓明显 核仁清晰 阳性细胞约占细胞 总数的 2 7 % 图 1 e2 e3 分离纯化的窦内皮细胞胞质清 亮 细胞器异染色质少 细胞 a1 a2 a3 a4 a5 b1 b2 b3 b4 b5 c1 c2 c3 c4 c5 d1 d2 d3 d4 d5 e1 e2 e3 e4 e5 f1 f2 f3 f4 f5 外观己趋于卵圆形 其中 95 % 以上细胞的胞质区显示染色较 浅的 CD14 和 ET 1 阳性 图 1 e4 e5 大鼠 2/3 肝切除 后 168 h 再生肝的 CD14 和 ET 1 阳性细胞数量分布类似 于对照组 图 1 f1 f2 f3 分离纯化的细胞基本与对照 组相同 图 1 f4 f5 a f 大鼠 2/3 肝切除后恢复 0 6 12 36 72 和 168 h 的再生肝 1 肝组织 HE 染色 2 3 肝组织的 CD14 和 ET 1 免疫组织化学显色 4 5 窦内皮细胞的 CD14 和 ET 1 疫细胞化学显色 图 1 再生肝组织及窦内皮细胞的 CD14 和 ET 1 阳性细胞 40x Fig 1 The CD14 and ET 1 positive cell of regenerative liver tissue and sinusoidal endothelial cells 40x

- 932-27 8 22 PH 0 2 6 12 24 30 36 72 120 168 h 10 4584 % 1313 % 1335 % 1859 % 1863 % 1902 % 2173 % 3689 % 4077 % 4614 % 2 a 523 10 8 625 10 8 716 10 8 934 10 8 475 10 8 64 10 8 90 10 8 1795 10 8 2077 10 8 30 10 8 / 2 b1 9660 % 9604 % 9628 % 9514 % 9092 % 9422 % 9553 % 9505 % 9632 % 9704 % 2 c 123 10 6 139 10 6 176 10 6 253 10 6 118 10 6 192 10 6 333 10 6 491 10 6 587 10 6 780 10 6 / 2 b2 9563 % 9496 % 9493 % 9526 % 9483 % 9526 % 9494 % 9539 % 9523 % 9485 % 2 c ET-1 CD14 227 % 214 % 236 % 261 % 237 % 288 % 356 % 264 % 271 % 251 % 224 % 212 % 234 % 260 % 237 % 290 % 354 % 263 % 272 % 248 % 2 d1 ET-1 CD14 9643 % 9650 % 9633 % 9635 % 9543 % 9616 % 9619 % 9655 % 9582 % 9663 % 9533 % 9541 % 9503 % 9573 % 9511 % 9655 % 9548 % 9604 % 9622 % 9528 % 2 d2 Fig2 2 Isolation and purification results of sinusoidal endothelial cells 23 CD14 ET-1 mrna 2/3 0 2 6 12 24 30 36 72 120 168 h 10 CD14 ET-1 β-actin CD14 ET-1 β-actin 3 RT-PCR CD14 ET-1 mrna CD14 ET-1 mrna 4

2009 8-933 - Fig3 3 CD14 ET-1 β-actin The content changes of CD14 ET-1 and β-actin in isolated sinusoidal endothelial cells Fig4 4 ET-1 CD14 mrna The content changes of CD14 and ET-1 mrna in isolated sinusoidal endothelial cells 3 60 % Percoll 94 % 95 % 90 % [10] Disse Salzer CD31 ET-1 Scoazec [11] CD14 CD14 ET-1 CD31 1 Fry J Preparation of mammalian hepatocytes J Methods Enzymology l981 77 2 130-139 2 Higgins G M Anderson R M Experimental pathology of the liver restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal J Arch Pathol 1931 12 186-202 3 Arai M Peng X X Currin R T et al Protection of sinusoidal endothelial cells against storage/reperfusion injury by prostaglandin E2 derived from Kupffer cells J Transplantation 1999 68 440-445 4 Stolz D B Ross M A Salem H M et al Cationic colloidal silica membrane perturbation as a means of examining changes at the sinusoidal surface during liver regeneration J Am J Pathol 1999 155 1487-1498

- 934-27 8 5 Onoe T Ohdan H Tokita D Liver sinusoidal endothelial cells have a capacity for inducing nonresponsiveness of T cells across major histocompatibility complex barriers J Transpl Int 2005 18 206-214 6 Ferry N Retroviral-mediated gene transfer into hepatocytes in vivo J PNAS USA 1991 8 1 8377-8381 7 J 2003 2 5 318-321 8 J 2008 26 12 1492-1498 9 Tsutsumi M Takada A Takase S Characterization of desmin-positive rat liver sinusoidal cells J Hepatol 1987 7 277-284 10 J 2008 13 79-80 11 J 2004 3 350-354 Isolation Purification and Identification of Sinusoidal Endothelial Cells in Rat Liver Wang Ze 1 2 Wang Lei 1 2 Xie Laifeng 1 2 Fan Jinyu 2 Xu Cunshuan 1 2 1 College of Life Sciences Henan Normal University Xinxiang 453007 Henan China 2 Key Laboratory for the Research of Cell Differentiation and Regulation Xinxiang 453007 Henan China Abstract Rat 2/3 hepatectomy PH model was made following Higgins et al hepatic cells were scattered by two-step perfusion and sinusoidal endothelial cells were isolated by density gradient centrifugation with 60 % percol1 and immuno-magnetic beads Immunocytochemistry method was used to qualitify and localize cluster of differentiation 14 CD14 and endothelin-1 ET-1 in liver tissue the isolated hepatic cells and the purified sinusoidal endothelial cells The expressions of CD14 and ET-1 were quantified using RT-PCR The results showed that CD14 and ET-1 postive sinusoidal endothelial cells account up more than 95 % of the total sinusoidal endothelial cells mrna levels of CD14 and ET-1 in the isolated sinusoidal endothelial cells were stable in rat regenerating liver RL and also was the content of the corresponding proteins indicating the modified method for sinusoidal endothelial cell isolation in this study has the advantage of high sinusoidal endothelial cell harvest high purification and survival rate Key words rat cell isolation and identification sinusoidal endothelial cells SEC immuno-magnetic bead marker protein