半枝莲中总生物碱的提取和纯化条件研究 王桂玲, 房建强, 赵雪梅, 孙凡森, 孙亮亮 ( 泰山医学院, 山东泰安 271000) 摘要 : 目的确定最佳的提取 纯化条件, 为半枝莲中总生物碱的开发和利用提供科学的理论依据 方法采用 L 9 (3 4 ) 正交试验, 超声提取, 考察酸浓度 料液比 温度 提取次数 4 个因素对半枝莲中总生物碱得率的影响 然后结合静态和动态吸附实验, 分别比较了 6 种不同型号的大孔树脂对半枝莲总生物碱的吸附和解吸性能, 并以比吸附量 比洗脱量为考察指标, 对大孔树脂纯化总生物碱的条件进行了筛选 以盐酸小檗碱为对照品, 甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶解, 采用紫外分光光度法测定半枝莲总生物碱的含量 结果半枝莲中总生物碱的最佳提取工艺条件为 12 倍量 1% 的硫酸水超声提取 3 次, 每次 1 h, 温度为 70 通过对 6 种不同型号的大孔树脂的比较, 表明 HPD100 型树脂具有最佳的吸附及洗脱参数, 其最佳纯化条件为 : 上样液总生物碱质量浓度为 1.015 7 mg ml 1,pH 在 3.0~4.0 之间, 先以 3.7 倍柱体积的水洗去杂质, 再以 3.5 倍柱体积 45% 乙醇洗脱, 得总生物碱量是纯化前总生物碱量 60% 左右 结论该提取 纯化条件简单 可行, 具有良好的应用前景 关键词 : 半枝莲 ; 总生物碱 ; 提取 ; 纯化中图分类号 :R284.2 文献标志码 :B 文章编号 :1007-7693(2011)05-0399-05 Study on Extraction and Purification of the Total Alkaloids from Scutellaria Barbata D.Don WANG Guiling, FANG Jianqiang, ZHAO Xuemei, SUN Fansen, SUN Liangliang(Taishan Medical University, Taian 271000, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To provide a theoretical basis for development and ulitization of the total alkaloids of Scutellaria barbata D.Don by optimizing the best extraction and purification process. METHODS The concentration of extracting solvent, ratio of solid-to-liquid, temperature, extraction times were investigated and the L 9 (3 4 ) orthogonal test was adopted to optimize the process. By the static and dynamic adsorption experiments, six types of macroporous adsorption resins(d101, HPD100, HPD400, HPD500, HPD600, AB-8) were evaluated to find the optimum one in purificating efficiency with measuring the adsorption and eluting ratio of the total alkaloids as indexes and used berberine hydrochloride as a comparison, methanol-hydrochloride(100 1) for the reagent to determine the content of the total alkaloids of Scutellaria barbata D.Don. RESULTS The results showed that 1% sulfuric acid solution as extracting solvent, ratio of solid-to-liquid was 1 12, temperature was 70 and extracting three times and 1 hour every time were optimal. The HPD100 macroporous adsorption resin provided the optimal adsorption and elution parameters. The best adsorption capacity was achieved with the following condition the concentration of extract liquid was 1.015 7 g ml 1, ph 3.0 4.0,then the resin was washed by 3.7 BV water to remove impurity and alkaloids were desorbed by 3.5 BV 45% ethanol. CONCLUSION The process is simple, feasible and has a good prospect. KEY WORDS: Scutellaria barbata D.Don; total alkaloids; extraction; purification 半枝莲为唇形科植物半枝莲的干燥全草 主要产于浙江 江苏 安徽 河南 四川 广东 福建 陕西等省 [1], 异名并头草 通经草 紫连草 韩信草 牙刷草等, 具有清热解毒 化瘀利尿 活血祛疲 消肿止痛 抗癌之功效 [2], 是一种常用的中药 其化学成分主要有生物碱 黄酮类 有机酸 多糖 酚类 甾醇等 主要用于癌症 肝炎 肝硬化 跌打损伤 毒蛇咬伤 痢疾等疾病的治疗 [3] 由于半枝莲用量较大, 而药性平和无毒 副作用, 所以被广泛应用 目前大量文献报道的 [4] 都是有关半枝莲中黄酮类 多糖类成分提取 分离及含量测定, 而对半枝莲中生物碱类成分的研究很少 本研究确定了半枝莲总生物碱的最佳提取 纯化条件, 为半枝莲中生物碱类成分的开发和利用提供了科学的理论依据, 同时也为半枝莲的进一步开发和利用提供参考 1 仪器与试剂 1.1 仪器 基金项目 :2009 年校级课题 (2009ZRQNO63) 作者简介 : 王桂玲, 女, 硕士, 讲师 Tel: 15092858942 E-mail: Wgl20050711@sina.com 中国现代应用药学 2011 年 5 月第 28 卷第 5 期 Chin JMAP, 2011 May, Vol.28 No.5 399
Spectrumlab54 紫外可见分光光度计 ( 上海棱光技术有限公司 );FC-104 电子分析天平 ( 上海恒平科学仪器有限公司 );HH.SY11-Ni2C 电热恒温水浴锅 ( 北京市长风仪器仪表公司 );RE-52A 型旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 );KQ-500E 医用超声波清洗器 ( 江苏姜堰市康健医疗器具厂 ) 1.2 试药半枝莲 ( 山东菏泽泰山中药饮片有限公司, 批号 :080823); 盐酸小檗碱对照品 ( 上海同田生化技术有限公司, 纯度 >98%, 批号 :09030522);AB-8 型大孔吸附树脂 ( 天津市巴斯化工有限公司 );D101 型大孔吸附树脂 ( 山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂 );HPD100 HPD400 HPD500 HPD600 型大孔吸附树脂 ( 河北沧州宝恩化工有限公司 ); 水为蒸馏水, 其他试剂均为分析纯 2 半枝莲中总生物碱提取条件研究 2.1 正交试验设计 本研究考察了酸浓度 料液比 温度 提取次数对半枝莲总生物碱得率的影响, 按照正交 L 9 (3 4 ) 表进行试验, 各因素 水平见表 1 表 1 L 9 (3 4 ) 正交试验因素 水平表 Tab 1 Factors and levels of L 9 (3 4 ) orthogonal test 水平 因素 A( 酸浓度 /%) B( 料液比 ) C( 温度 / ) D( 提取次数 / 次 ) 1 1 1 8 40 1 2 1.5 1 10 55 2 3 2 1 12 70 3 2.2 对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品 0.8 mg, 用甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶液溶解, 定容到 10 ml 量瓶中, 摇匀, 配成浓度为 0.08 mg ml 1 的盐酸小檗碱对照品溶液 2.3 样品溶液的制备准确称取半枝莲 9 份, 每份 5 g, 分别按正交试验 ( 表 1) 的工艺条件进行超声提取, 过滤, 合并滤液, 滤液首先用氯仿萃取 2 次, 合并氯仿层 1, 酸水层加氨水调节 ph 为 9~10 再用氯仿萃取 2 次, 合并氯仿层 2, 碱水层加氨水调节 ph>12, 再用正丁醇萃取 2 次, 合并正丁醇层 3, 碱水层沉淀 4, 然后将 1 2 3 4 分别蒸干, 合并, 即得总生物碱粗品 每份称取总生物碱粗品约 20 mg, 加甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶液超声溶解, 过滤, 滤液定容到 50 ml 量瓶, 摇匀, 备用 2.4 最大吸收波长的确定精密吸取盐酸小檗碱对照溶液 0.5 ml, 置于 10 ml 比色管中, 加甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶液至 4 ml, 摇匀, 在紫外分光光度仪上 200~800 nm 区间扫描, 确定最大吸收波长为 348 nm 2.5 标准曲线的绘制精密吸取 2.2 项下盐酸小檗碱对照品溶液 0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 ml, 置于 10 ml 比色管中, 分别加甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶液至 4 ml, 摇匀, 以甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶液作空白, 在 348 nm 处测定吸光度, 为减少操作误差平行测定 3 次, 求平均值 得回归方程 :A=54.357C+0.026 7, r=0.995 0, 表明盐酸小檗碱浓度在 0.004~0.016 mg ml 1 内线性关系良好 2.6 样品含量测定取 2.3 项下配制的总生物碱溶液, 每份 4 ml, 置于 10 ml 比色管中, 摇匀, 在 348 nm 处测定吸光度, 以标准曲线计算总生物碱含量, 结果见表 2~4 综合以上结果分析, 确定了半枝莲总生物碱的最佳提取工艺条件为 A 1 B 3 C 3 D 3, 即加 12 倍量 1% 的硫酸水溶液超声提取, 温度为 70, 提取次数为 3 次, 每次 1 h 从极差 方差分析的结果可看出, 提取次数对半枝莲中总生物碱的得率有显著的影响, 其次为温度 料液比和酸浓度 3 半枝莲中总生物碱的纯化条件研究 3.1 上样液的制备准确称取半枝莲 30 g, 以最佳条件提取, 按 2.3 项下方法处理样品, 然后称取总生物碱粗粉 2.090 g, 加水定容至 1 000 ml, 超声溶解 15 min, 抽滤, 滤液即为上样溶液, 移取 2 ml 蒸干, 用甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶解至 4 ml, 在 348 nm 处测定吸光度, 以 2.5 项得到的标准曲线计算总生物碱含量 3.2 静态吸附实验称取各型号经预处理的树脂 1.5 g( 湿重 ) 置于 100 ml 锥形瓶中, 各加入 3.1 项上样液 40 ml, 持续振摇 30 min, 静置 48 h 后, 抽滤, 得吸附后的滤液, 将吸附后的各型号树脂抽滤后分别另置 100 ml 锥形瓶中, 分别加入 45% 乙醇 40 ml, 其余操作同上, 得解吸后的滤液 测定各吸附后滤液及解吸液的浓度 按下式计算每一种树脂对半 400 Chin JMAP, 2011 May, Vol.28 No.5 中国现代应用药学 2011 年 5 月第 28 卷第 5 期
表 2 正交试验结果 Tab 2 Results of orthogonal test 序号 A B C D 总生物碱量 /g 盐酸小檗碱量 /mg 1 1 1 8 40 1 0.118 9 3.050 2 1 1 10 55 2 0.210 7 7.253 3 1 1 12 70 3 0.416 2 11.82 4 1.5 1 8 55 3 0.266 0 10.23 5 1.5 1 10 70 1 0.149 7 2.552 6 1.5 1 12 40 2 0.234 8 6.988 7 2 1 8 70 2 0.324 4 9.450 8 2 1 10 40 3 0.267 0 7.048 9 2 1 12 55 1 0.152 6 3.869 K 1 4.805 3.783 3.437 2.974 K 2 4.569 4.181 3.814 4.526 K 3 3.963 5.373 6.085 5.837 R 0.842 1.590 2.648 2.863 K 1 7.375 7.540 5.695 3.157 K 2 6.554 5.618 7.081 7.897 K 3 6.789 7.559 7.941 9.663 R 0.821 1.941 2.246 6.506 表 3 总生物碱得率的方差分析结果 Tab 3 Results of variance analysis of the total alkaloids 方差来源 偏差平方和 自由度 方差 显著性 (A) 酸浓度 0.002 2 1.000 (B) 料液比 0.005 2 2.500 (C) 温度 0.016 2 8.000 (D) 提取次数 0.048 2 24.000 P<0.05 误差 0.000 2 表 4 盐酸小檗碱得率的方差分析结果 Tab 4 Results of variance analysis of berberine hydrochloride 方差来源 偏差平方和 自由度 方差 显著性 (A) 酸浓度 1.072 2 1.000 (B) 料液比 7.406 2 6.965 (C) 温度 7.701 2 7.184 (D) 提取次数 67.906 2 63.345 P<0.05 误差 1.07 2 枝莲中总生物碱的静态比吸附量 比洗脱量及解 吸率, 结果见表 5 比吸附量 =( 吸附前溶液浓度 吸附后溶液浓度 ) 溶液体积 / 干树脂质量 ; 比洗脱 量 =( 洗脱液的平衡浓度 洗脱液体积 )/ 干树脂质 量 ; 解吸率 =( 洗脱液的平衡浓度 洗脱液体积 )/( 吸 附前溶液浓度 吸附后溶液浓度 ) 溶液体积 100% 表 5 6 种大孔吸附树脂静态饱和吸附量及洗脱量 解吸率测定结果 Tab 5 Adsorption and eluting ratio of 6 types of macroporous adsorption resins 盐酸小檗碱盐酸小檗碱比总生物碱树脂类型比吸附量 /mg g 1 洗脱量 /mg g 1 洗脱量 /mg g 1 解吸率 /% D101 0.377 6 0.264 0 37.56 69.92 HPD100 0.425 7 0.298 0 37.69 70.02 HPD400 0.384 2 0.229 9 33.74 59.84 HPD500 0.415 1 0.296 5 37.65 71.43 HPD600 0.443 4 0.293 0 36.48 66.08 AB-8 0.319 2 0.287 3 32.70 90.00 由表 5 可见,HPD100 HPD500 HPD600 型 3 种树脂的比吸附量 比洗脱量及解吸率与其他树脂相比均较好, 但综合考虑吸附及解吸两方面因素, 初步确定选用 HPD100 型树脂纯化总生物碱 3.3 动态吸附实验准确称取 HPD100 型树脂适量, 经预处理合格后湿法装柱 (17 mm 180 mm), 准确吸取上样液 90 ml, 以流速 1 ml min 1 上柱, 预吸附 12 h 收集过柱液, 先以水洗脱至无色, 再以 45% 乙醇洗脱至近无色, 分别收集各段洗脱液, 经浓缩干燥后得干燥物, 并按 2.6 项下操作测定总生物碱 中国现代应用药学 2011 年 5 月第 28 卷第 5 期 Chin JMAP, 2011 May, Vol.28 No.5 401
浓度 计算各洗脱部分的总生物碱含量 按下式分别计算比吸附量 比洗脱量 比吸附量 = (A B C)/Q, 比洗脱量 =D/Q(Q 为干树脂质量,A 为上样液中成分的质量,B 为过柱流出液中成分的质量,C 为水洗脱下来的成分的质量,D 为 45% 乙醇洗脱下来的成分的质量 ), 结果上柱量为 91.33 mg 时, 过柱残余量为 22.19 mg, 水洗脱量为 5.51 mg,45% 乙醇洗脱量为 63.61 mg, 吸附量为 37.45 mg, 洗脱量为 34.46 mg 结果表明 HPD100 型树脂具有较好的纯化效果 3.4 HPD100 型树脂纯化总生物碱的条件研究 3.4.1 上样液 ph 值的考察准确称取处理好的 HPD100 型树脂 3 份, 每份树脂 5 g( 湿重 ), 准确移取已调节 ph 值在 3.0~4.0 5.0~6.0 7.0~8.0 之间的上样液各 65 ml, 以流速 1 ml min 1 上柱, 预吸附 1 h 后, 先以水洗脱至无色, 然后用 45% 乙醇 35 ml 洗脱, 收集洗脱液, 浓缩, 干燥, 称重 按 2.6 项下操作测定 45% 乙醇中总生物碱浓度, 计算洗脱量, 结果上样液 ph 值在 3.0~4.0 5.0~6.0 7.0~8.0 时, 总生物碱的洗脱量分别为 48.50,44.08, 39.01 mg, 盐酸小檗碱的洗脱量分别为 0.265 4, 0.241 2,0.213 5 mg 结果表明,pH 值在 3.0~4.0 之间时, 盐酸小檗碱及总生物碱的洗脱量均最大 因此, 确定上样液的 ph 值在 3.0~4.0 之间 3.4.2 上样液浓度的考察准确称取处理好的 HPD100 型树脂 3 份, 每份树脂 5 g( 湿重 ), 准确移取已调节 ph 值在 3.0~4.0 之间, 总生物碱浓度分别为 2.031 4(32.5 ml),1.015 7(65 ml),0.507 8(130 ml) mg ml 1 的上柱液各 1 份, 以 1 ml min 1 的流速上柱 预吸附 1 h 后, 先以水洗脱至无色, 然后用 45% 乙醇 35 ml 洗脱, 收集洗脱液, 浓缩, 干燥, 称重 按 2.6 项下操作测定总生物碱浓度, 计算洗脱量 结果上样液总生物碱浓度为 2.031 4, 1.015 7,0.507 8 mg ml 1 时, 总生物碱的洗脱量分别为 41.90,49.12,39.22 mg, 盐酸小檗碱的洗脱量分别为 0.229 3,0.268 8,0.214 6 mg 结果表明, 总生物碱浓度为 1.015 7 mg ml 1, 盐酸小檗碱及总生物碱的洗脱量均最大 因此, 确定上柱液浓度分别为 1.015 7 mg ml 1 3.4.3 醇浓度的考察准确称取处理好的 HPD100 型树脂 3 份, 每份树脂 5 g( 湿重 ), 准确移取已调节 ph 值在 3.0~4.0 之间的样品液 65 ml, 以流速 1 ml min 1 上柱, 预吸附 1 h 后, 先以水洗 脱至无色, 然后分别选用 30%,45%,60% 的乙醇各 35 ml 进行洗脱, 收集洗脱液, 浓缩, 干燥, 称重 按 2.6 项下操作测定总生物碱浓度, 计算洗脱量 结果乙醇浓度为 30%,45%,60% 时, 总生物碱的洗脱量分别为 38.90,51.15,49.91 mg, 盐酸小檗碱的洗脱量分别为 0.212 7,0.274 5, 0.273 2 mg 结果表明,45% 乙醇洗脱时, 盐酸小檗碱及总生物碱的洗脱量均最大 因此, 确定为 45% 乙醇洗脱 3.4.4 洗脱用水体积的考察称取处理好的 HPD100 型树脂 3 份, 每份树脂 5 g( 湿重 ), 准确移取已调节 ph 值在 3.0~4.0 之间的上柱液 65 ml, 以 1 ml min 1 的流速上柱 预吸附 1 h 后, 分别以 30,40,50 ml 水洗脱 然后分别用 45% 乙醇 35 ml 洗脱, 收集洗脱液, 浓缩, 干燥, 称重 按 2.6 项下操作测定总生物碱浓度, 计算洗脱量 结果用水体积为 30,40,50 ml 时, 总生物碱的洗脱量分别为 51.01,45.68,45.44 mg, 盐酸小檗碱的洗脱量分别为 0.273 7,0.250 0,0.248 7 mg 结果表明, 当洗脱用水量增加时, 有些生物碱类成分被洗脱下来, 导致盐酸小檗碱及总生物碱的洗脱量减小, 通过比较, 确定洗脱用水量为 30 ml, 相当于 3.7 倍柱体积 3.4.5 45% 醇洗脱用量的考察称取处理好的 HPD100 型树脂 5 g( 湿重 ), 准确移取已调节 ph 值在 3.0~4.0 之间的上柱液 65 ml, 以 1 ml min 1 的流速上柱 预吸附 1 h 后, 先用 30 ml 水洗脱 然后用 45% 乙醇进行洗脱, 分别以 14.1,7,7,4, 4,4 ml 收集洗脱液, 分别浓缩, 干燥, 称重 按 2.6 项下操作测定总生物碱浓度, 计算洗脱量 结果洗脱量分别为 14.1,7,7,4,4,4 ml 时, 总生物碱的洗脱量分别为 34.23,7.91,6.13, 0.000 918,0.000 716,0.000 519 mg, 盐酸小檗碱的洗脱量分别为 0.187 3,0.043 29,0.033 55, 5.024 1 10 6,3.918 6 10 6,2.840 4 10 6 mg 结果表明,45% 乙醇用量为 28.1 ml, 相当于柱体积 3.5 倍, 已能将绝大部分的生物碱洗脱下来, 因此确定 45% 乙醇用量为 3.5 倍柱体积 4 讨论 [5] 本研究曾采用正交试验分别考察过醇提和酸水超声提取工艺, 并通过极差 方差分析确定最佳的提取条件, 但经比较发现醇提工艺所得总生物碱量低于采用酸水超声提取工艺, 而且醇提法提取的 402 Chin JMAP, 2011 May, Vol.28 No.5 中国现代应用药学 2011 年 5 月第 28 卷第 5 期
杂质较多, 因此本研究采用酸水超声提取 半枝莲中总生物碱的含量测定方法参照中国 [6] 药典中戊己丸中总生物碱的含量测定方法, 改用紫外分光光度法进行测定, 以甲醇 - 盐酸 (100 1) 溶解, 获得较为理想的结果 本研究曾参照大孔吸附树脂纯化生物碱的相关文献 [7-8], 按照极性由小到大的顺序选用 AB-8, D101,HPD100,HPD400,HPD500,HPD600 这 6 种树脂纯化半枝莲中总生物碱 半枝莲中总生物碱的最佳提取工艺条件为用 12 倍量 1% 的硫酸水超声提取 3 次, 每次 1 h, 温度为 70 通过对正交试验结果进行极差 方差分析, 表明提取次数对半枝莲中总生物碱的得率有显著影响, 其次为温度 料液比和酸浓度 通过对 6 种型号的大孔吸附树脂进行筛选, 最终确定 HPD100 型树脂具有较好吸附和解吸能力 通过动态吸附实验, 确定纯化半枝莲总生物碱的最佳条件为 : 上样液总生物碱质量浓度为 1.015 7 mg ml 1,pH 在 3.0~4.0 之间, 先以 3.7 倍柱体积的水洗去杂质, 再以 3.5 倍柱体积 45% 乙醇洗脱, 得总生物碱量是纯化前总生物碱量 60% 左右 REFERENCES [1] TAN Y H, WANG S H, LIANG R M. Research progress on Chinese medical Scutellaria barbata [J]. Med J Nat Defend Forc Southwest China( 西南国防医药 ), 2002, 12(2): 152-153. [2] XIAO H T, LI X. Research progress of chemical constituents and pharmacologic actions of Scutellaria barbata [J]. Res Inf Tradit Chin Med( 中药研究与信息 ), 2005, 7(4): 20-22. [3] PENG W W, WU H F, ZENG C Y. Research progress of pharmacologic action and clinical application of Scutellaria barbata [J]. Lishizhen Med Mater Med Res( 时珍国医国药 ), 2003, 14(7): 428-429. [4] XU Y M, GUO L W, CHEN J W. Isolation and physico-chemical properties of polysaccharide from the herb of Scutellaria barbata D.Don [J]. Nat Prod Res Develop( 天然产物研究与开发 ), 1992, 4(1): 1-5. [5] DI D L, LIU L C, LIU Y W, et al. Study on extraction process of Scutellaria barbata [J]. Chin Tradit Pat Med( 中成药 ), 2003, 25(7): 530-532. [6] Ch.P(2005)Vol I( 中国药典 2005 年版. 一部 )[S]. 2005: 214. [7] ZHAO Q C, GUO T, ZHANG P, et al. Study on separation and isolation of total alkaloids from Gelsemium Elegans Benth by macroporous resin [J]. J China Pharm( 中国药房 ), 2006, 17(13): 969-971. [8] XU P H, GAO Y, ZHANG X Q, et al. Study on separation and isolation of total alkaloids from Rhizoma Coptidis by macroporousresin [J]. Chin Tradit Pat Med( 中成药 ), 2009, 31(3): 390-393. 收稿日期 :2010-08-09