标题

2015 年 4 月 Vol.33 No.4 April 2015 Chinese Journal of Chromatography 397 ~ 402 研究论文 DOI: 10.3724 / SP.J.1123.2014.12004 超高效合相色谱 质谱法快速分析食用植物油中常见脂肪酸 林春花, 谢贤清, 范乃立, 涂媛鸿, 陈彦, 廖维林 ( 江西师范大学, 国家单糖化学合成工程技术研究中心, 江西南昌 330027) 摘要 : 建立了超高效合相色谱 质谱 (UPC 2 MS) 快速分析 6 种食用植物油 ( 玉米油 葵花籽油 大豆油 茶油 菜籽 油 花生油 ) 中棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸 亚麻酸等 5 种常见脂肪酸的方法, 并比较了这 6 种食用油中上述 5 种 脂肪酸的含量差异 采用皂化反应对植物油进行前处理, 以 ACQUITY UPC 2 BEH 2 EP 色谱柱 ( 100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) 为分析柱, 以超临界 CO 2 甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) 为流动相进行梯度洗脱, 流速为 0 8 ml / min 在电 喷雾负离子模式下进行检测, 外标法定量 结果表明 :5 种脂肪酸标准物质在 0 5~ 100 mg / L 范围内呈现良好的线 性关系, 相关系数为 0 998 5~ 0 999 8, 定量限 (S / N 10) 为 0 15~ 0 50 mg / L; 在 3 个添加水平下, 样品的加标回收 率为 89 61% ~ 108 50%; 方法重复性的相对标准偏差 (RSD) 为 0 69% ~ 3 01% 该方法简单 快速 分离效果好, 无 需对脂肪酸样品进行衍生化, 已成功地用于玉米油 葵花籽油 橄榄油 茶油 大豆油和花生油等 6 种食用油中常见 脂肪酸含量的测定 关键词 : 超高效合相色谱 质谱法 ; 脂肪酸 ; 食用植物油 ; 未衍生化 中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 :1000 8713(2015)04 0397 06 Fast analysis of common fatty acids in edible vegetable oils by ultra performance convergence chromatography mass spectrometry LIN Chunhua, XIE Xianqing, FAN Naili, TU Yuanhong, CHEN Yan, LIAO Weilin (National Research Center of Monosaccharide Chemical Synthesis Engineering, Jiangxi Normal University, Nanchang 330027, China) Abstract: A fast analytical method for five common fatty acids in six edible vegetable oils was developed by ultra performance convergence chromatography mass spectrometry ( UPC 2 MS). The five fatty acids are palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid and linolenic acid. Their contents in the corn oil, sunflower oil, soybean oil, tea oil, rapeseed oil and peanut oil were compared. The chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPC 2 BEH 2 EP column (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) using the mobile phases of carbon dioxide and metha nol / acetonitrile (1 1, v / v) with gradient elution. The separated compounds were detected by negative electrospray ionization ESI - MS. The results showed that the reasonable linearities were achieved for all the analytes over the range of 0 5-100 mg / L with the correlation coeffi cients (R 2 ) of 0 998 5-0 999 8. The limits of quantification( S / N 10) of the five fatty acids were 0 15-0 50 mg / L. The recoveries of the five fatty acids at three spiked levels were in the range of 89 61% - 108 50% with relative standard deviations of 0 69% - 3 01%. The developed method showed high performance, good resolution and fast analysis for the underivatized fatty acids. It has been successfully used to detect the five fatty acids from corn oil, sunflower oil, soybean oil, tea oil, rapeseed oil and peanut oil. Key words: ultra performance convergence chromatography mass spectrometry ( UPC 2 MS); fatty acids; edible vegetable oils; underivatization 通讯联系人.E mail:jxnuqiu@ 163.com. 基金项目 : 国家科技支撑计划课题 (2014BAE13B02,2012BAE07B00). 收稿日期 :2014 12 02

398 色谱第 33 卷 植物油是人类膳食的重要组成部分, 是由脂肪 酸和甘油化合而成的天然高分子化合物 ( 甘油三 酯 ), 广泛分布于自然界中 植物油中的脂肪酸种 类及含量对人体健康有重要影响, 不同的脂肪酸具 有不同的营养价值 [1] 研究表明, 植物油以 16 碳和 18 碳脂肪酸为主, 其余脂肪酸含量较少,16 碳脂肪 酸主要为棕榈酸, 而 18 碳脂肪酸主要为硬脂酸 油 酸 亚油酸和亚麻酸 [2] 因此建立一种快速 准确 的分析不同种类植物油中上述 5 种脂肪酸组成和含 量的方法, 对于评价油脂的品质具有重要的意义 对植物油中的脂肪酸成分进行分析时, 一般先 要进行皂化反应, 使甘油三酯转化为脂肪酸 目前 主要有两种测定方法, 一种是对脂肪酸进行直接测 定 ; 另一种是对脂肪酸进行衍生化反应, 使脂肪酸转 化为沸点较低的脂肪酸甲酯再间接测定 GC GC MS [3-9] 全二维气相色谱 ( GC GC ) [10] 快速 GC [11] LC [12] 和超临界流体色谱 (SFC) [13,14] 等在脂 肪酸或脂肪酸甲酯分离领域中均发挥着重要的作 用 其中,GC 法间接分析衍生化后的脂肪酸是最 常用的检测手段 [11,15] ; 而 SFC 法兼有 GC 和 LC 的 特点, 既可分析 GC 不适用的高沸点样品, 又比 HPLC 有更快的分析速度, 同时适合分离和检测结 构类似物 同分异构体等样品, 因此是最具应用前景 [16,17] 的分析手段之一 超高效合相色谱 (UPC 2 ) 是 Waters 公司新推出 的基于超临界流体色谱的技术体系 [18] 它结合了 成熟的 UPLC 以及 Waters 公司的专业技术和创新, 实现了 SFC 的设备化 本研究建立了玉米油 葵花 籽油 大豆油 茶油 菜籽油和花生油等 6 种食用油 中 5 种未衍生化脂肪酸的超高效合相色谱 质谱测 定方法, 为快速 准确分析食用油的脂肪酸含量提供 了新的技术手段, 同时也为评价油脂的品质以及建 议人们合理用油提供了数据参考 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 超高效合相色谱仪 ( ACQUITY UPC 2 ): 包括合 相色谱管理器 样品管理器 柱温箱管理器 二元溶 剂管理器和 SQD 2 质谱检测器 ;515 溶剂补偿泵 ( 美 国 Waters 公司 ) ACQUITY UPC 2 BEH 2 EP 色谱 柱 (100 mm 2 1 mm, 1 7 μm) ACQUITY UPC 2 BEH 色谱柱 (100 mm 3 mm, 1 7 μm) ACQUITY UPC 2 HSS C18 SB 色谱柱 (100 mm 2 1 mm, 1. 8 μm) 和 ACQUITY UPC 2 CSH TM Fluoro Phenyl Col umn 色谱柱 ( 100 mm 3 mm, 1 7 μm ) ( 美国 Waters 公司 ) METTLER TOLEDO AL204 型电子天平 ( 瑞士 METTLER 公司 ) PURELAB Ultra MK 2 型超纯水仪 ( 英国 ELGA 公司 ) 5 种脂肪酸标准品棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸和亚麻酸均购自 Sigma Aldrich 公司, 纯度大于 99% 正己烷 甲醇和乙腈为色谱纯 ( 德国 Merck 公司 ) 实验用水为超纯水 玉米油 葵花籽油 大豆油 菜籽油均购于正规超市, 茶油和花生油为农家自榨油 1.2 混合标准溶液的配制分别准确称取 0 05 g( 精确至 0 001 g) 各种脂肪酸标准样品, 用正己烷溶解并分别定容于 50 ml 容量瓶中, 制备成 1 g / L 的单一标准品储备液 然后用正己烷制备成 100 mg / L 混合标准溶液, 再稀释成系列标准工作溶液 1.3 样品的制备分别称取 5 g 上述 6 种食用油置于 100 ml 烧瓶中, 加入 10 g 250 g / L 的 KOH 溶液进行皂化反应, 加冷凝管于 100 油浴中回流 8 h, 停止加热 冷却后加入 10 ml 2 mol / L 的 H 2 SO 4 溶液进行酸化, 卸下烧瓶, 转入分液漏斗, 静置分层 上层用蒸馏水洗涤至中性, 加入无水 Na 2 SO 4 干燥后得到各种植物油相对应的脂肪酸样品 再分别称取约 0 01 g 该脂肪酸样品于 100 ml 容量瓶中, 用正己烷定容, 溶液经有机膜过滤后直接进行 UPC 2 分析 1.4 仪器条件 1.4.1 色谱条件色谱柱 :ACQUITY UPC 2 BEH 2 EP; 流动相 : 超临界 CO 2 ( A) 和甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) ( B) 洗脱梯度 :0 ~ 2 min, 2% B ~ 4% B; 2 ~ 3 min, 4% B; 3 ~ 4 min, 4% B ~ 10% B; 4 ~ 5min, 10% B ~ 2% B 柱温 : 50 ; 样品室温度 :10 ; 背压 :1 38 10 7 Pa; 流速 : 0 8 ml / min; 进样体积 :1 μl 1.4.2 质谱条件离子源 :ESI - ; 毛细管电压 :2 0 kv; 锥孔电压 : 40 V; 源温度 :150 ; 脱溶剂气温度 :500 ; 脱溶剂气体流速 :850 L / h; 锥孔气体流速 :40 L / h; 补偿溶剂 : 含 1% ( v / v ) 水的甲醇溶液, 流速为 0 2 ml / min 在选择离子监测模式下, 棕榈酸 硬脂酸 油酸 亚油酸和亚麻酸的 m / z 分别为 255 42 283 48 281 46 279 45 277 43, 提取离子色谱图如图 1 所示 2 结果与讨论 2.1 色谱柱的选择 UPC 2 系统所使用的亚 2 μm 色谱柱, 涵盖了正

第 4 期林春花, 等 : 超高效合相色谱 质谱法快速分析食用植物油中常见脂肪酸 399 图 2 不同色谱柱对 5 种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 2 Effect of chromatographic columns on the separation of the five fatty acids 图 1 5 种脂肪酸标准品在 ESI - 模式下的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the five fatty acid standards in ESI - mode 相和反相 LC 的色谱柱类别, 本实验首先考察了 4 种不同填料的 ACQUITY UPC 2 色谱柱对脂肪酸分 离的影响, 结果如图 2 所示 色谱柱选择性的大小 依次为 :BEH 2 EP>HSS C18 SB>BEH>CSH TM Flu oro Phenyl, 其中,BEH 2 EP 色谱柱的固定相是在 亚乙基桥杂化颗粒表面键合了 2 乙基吡啶, 对具有 极性官能团的化合物具有较好的选择性,5 种脂肪 酸获得了有效分离 因此选用 BEH 2 EP 色谱柱 2.2 改性剂的选择 改性剂会改变流动相的极性, 对 UPC 2 的分离 有一定的影响 考察了 3 种改性剂甲醇 乙腈 甲 醇 / 乙腈 (1 1, v / v) 对 5 种脂肪酸分离的影响, 结果 如图 3 所示 3 种改性剂对脂肪酸的洗脱能力为甲 醇>甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) >乙腈 ;3 种改性剂的选择性存在差异, 其中甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) 和乙腈的分离效果相当, 但使用乙腈时保留时间相对较长 因此, 选择甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) 作为流动相中的改性剂, 此时对样品的洗脱能力和分离效果较好 2.3 柱温的选择柱温的改变会在一定程度上影响 UPC 2 的分离效果, 所以实验中以混合标准品为对象, 在改性剂为甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) 流速 0 8 ml / min 和背压 1 38 10 7 Pa 的条件下, 考察了不同柱温 ( 40 ~ 60 ) 对分离效果的影响 结果如图 4 所示, 随着柱温的升高, 化合物的保留增强, 与常规液相色谱中柱温对保留时间的影响不同 这是因为升高温度会降低超临界 CO 2 的密度, 从而减弱其洗脱能力, 导致化合物的保留值增大 当柱温为 50 时, 样品的分离和保留效果较好 2.4 背压的选择背压的改变也会在一定程度上影响 UPC 2 的分离效果, 所以在改性剂为甲醇 / 乙腈 (1 1, v / v) 流

400 色谱第 33 卷 图 3 不同改性剂对 5 种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 3 Effect of organic modifiers on the separation of the five fatty acids. 图 4 温度对 5 种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 4 Effect of temperature on the separation of the five fatty acids 速 0 8 ml / min 和柱温 50 的条件下, 考察了不同 系统背压 (1 24 10 7 ~ 1 51 10 7 Pa) 对分离效果的 影响 结果如图 5 所示, 背压升高造成 CO 2 的密度 和黏度增加, 进而导致流动相的溶剂化能力和洗脱 图 5 背压对 5 种脂肪酸分离效果的影响 Fig. 5 Effect of back pressure on the separation of the five fatty acids leic acid; 5. linolenic acid 能力提高, 使得化合物的保留时间缩短 背压为 1 38 10 7 Pa 时的分离效果与分析效率较好 2.5 MS 中补偿溶剂的选择 在 MS 方法开发中, 不同的补偿溶剂对目标物 的离子化效率也会产生一定的影响 实验考察了分 别含 1% (v / v) 水 0 1% (v / v) 甲酸铵 0 1% ( v / v) 醋酸铵的甲醇作为补偿溶剂和不同的流速 ( 0 1 0 2 0 3 ml / min) 对 5 种脂肪酸的分离影响 在相 同的梯度洗脱条件下, 甲醇 1% (v / v) 水作为补偿溶 剂且流速为 0 2 ml / min 时, 目标物离子化效果最 好, 色谱峰尖锐 对称, 响应灵敏度高,5 种脂肪酸分 离效果好 2.6 线性范围 相关系数及检出限 配制不同质量浓度的混合标准工作液, 在优化 的条件下进行测定, 外标法定量, 通过 Masslynx 4 1 软件得到化合物响应面积 ( Y) 和质量浓度 ( X, mg / L) 的线性关系 ( 见表 1), 5 种脂肪酸的线性范 围为 0 5 ~ 100 mg / L, 相关系数均大于 0 998 5, 表 明线性关系良好 以信噪比大于 10 时的质量浓度 确定定量限 (LOQ), 为 0 15 ~ 0 50 mg / L 2.7 回收率及精密度 取已经测定脂肪酸含量的菜籽油作为基质样 品, 再设置 5 种脂肪酸低 中 高 3 个加标水平进行 方法学考察, 按优化条件分析, 每个加标水平平行测

第 4 期林春花, 等 : 超高效合相色谱 质谱法快速分析食用植物油中常见脂肪酸 401 定 6 次 如表 2 所示, 方法的回收率为 89 61% ~ 108 50%, RSD 为 0 69% ~ 3 01%, 可满足食用油中 脂肪酸的测定 表 1 5 种脂肪酸的线性关系 相关系数 (R 2 ) 及定量限 Table 1 Linear relationships, correlation coefficients Fatty acid (R 2 ) and LOQs of the five fatty acids Linear range / Linear equation R 2 LOQ / Palmitic acid 0.5-100 Y = 1.323 10 4 X+1.932 10 2 0.9997 0.20 Stearic acid 0.5-100 Y = 8.083 10 3 X+5.477 10 3 0.9990 0.50 Oleic acid 0.5-100 Y = 1.615 10 4 X+1.351 10 3 0.9997 0.26 Linoleic acid 0.5-100 Y = 1.804 10 4 X+5.047 10 3 0.9998 0.22 Linolenic acid 0.5-100 Y = 2.177 10 4 X-7.898 10 3 0.9985 0.15 Y: peak area; X: mass concentration, mg / L. 品的色谱图如图 6 所示 Sample Table 3 表 3 实际样品的分析结果 Analytical results of real samples Palmitic Stearic Oleic Linoleic Linolenic Corn oil 12.28 1.52 29.90 54.63 0.68 Sunflower oil 6.11 3.64 25.03 63.12 - Soybean oil 10.3 4.08 24.12 52.86 5.94 Tea oil 8.03 1.86 79.93 8.77 0.71 Rapeseed oil 4.16 2.00 59.90 19.53 7.63 Peanut oil 12.05 3.49 44.84 34.00 - -: not detected. 表 2 加标样品中 5 种脂肪酸的回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 2 Recoveries and relative standard deviations ( RSDs ) of the five fatty acids in spiked samples (n = 6) Fatty acid Background / Added / Found / Recovery / % RSD / % Palmitic 4.16 1.50 5.58 94.67 2.67 acid 4.16 4.20 8.28 98.09 1.90 4.16 12.50 16.68 100.16 2.31 Stearic 2.00 2.00 4.17 108.50 2.93 acid 2.00 5.00 7.21 104.20 1.81 2.00 20.00 22.21 101.11 2.70 Oleic 59.90 6.00 65.82 98.67 1.75 acid 59.90 12.00 71.91 100.33 0.69 59.90 24.00 83.68 99.08 2.21 Linoleic 19.53 6.50 25.90 98.01 1.82 acid 19.53 19.50 38.92 99.44 0.89 19.53 58.50 78.51 100.82 1.78 Linolenic 7.63 2.50 9.87 89.61 3.01 acid 7.63 7.60 14.93 96.07 2.25 7.63 22.90 30.14 98.30 2.61 2.8 实际样品的测定本研究选取玉米油 葵花籽油 大豆油 茶油 菜籽油和花生油等 6 种食用植物油, 测定了 5 种主要脂肪酸的含量, 结果见表 3 上述 6 种食用油中油酸 亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸总含量分别为 85 21% 88 15% 82 92% 89 41% 87 06% 78 84%, 棕榈酸和硬脂酸等饱和脂肪酸总含量分别为 13 80% 9 75% 14 38% 9 89% 6 16% 15 54%, 不饱和脂肪酸远高于饱和脂肪酸且各成分含量差异显著 其中 : 茶油 菜籽油以油酸为主, 但茶油中的油酸含量远高于菜籽油 玉米油 葵花油和大豆油以亚油酸为主, 但葵花油中亚油酸最高, 玉米油和大豆油则差异不大 花生油中油酸含量略高于亚油酸, 两者含量差异没有其余 5 种食用油明显 6 种食用油除葵花籽油和花生油外均含有亚麻酸, 其中以菜籽油中的亚麻酸含量最高, 为 7 63% 6 种样 图 6 (a) 玉米油 (b) 葵花籽油 (c) 大豆油 (d) 茶油 (e) 菜籽油和 (f) 花生油中 5 种脂肪酸的色谱图 Fig. 6 Chromatograms of the five fatty acids in (a) corn oil, (b) sunflower oil, ( c) soybean oil, ( d) tea oil, (e) rapeseed oil and (f) peanut oil 3 结论 采用超高效合相色谱 质谱法对 6 种食用植物

402 色谱第 33 卷 油中 5 种未衍生化脂肪酸进行了快速分析 采用皂化反应对植物油进行前处理 ; 通过考察色谱柱 改性剂 柱温 背压 补偿溶剂等因素对分离的影响, 得到最佳的色谱 质谱分离条件 该方法为快速 准确分析食用油中的脂肪酸提供了一种新的技术手段, 也为评价油脂的品质以及建议人们合理用油提供了数据参考 参考文献 : [1] Jiang X Q, Liu L C, Zhao F Z, et al. Feed Review ( 蒋秀琴, 刘立成, 赵福忠, 等. 饲料博览 ), 2010(3): 227 [2] Zhou W H, Zheng S H, Jiang A M. Cereals & Oils ( 周文化, 郑仕宏, 蒋爱民. 粮食与油脂 ), 2011(3): 4 [3] Fu Y F, Zhang P P, Pan Z F, et al. Chinese Journal of Anal ysis Laboratory ( 傅宇飞, 张佩佩, 潘再法, 等. 分析试验室 ), 2013, 32(8): 103 [4] Lall R K, Proctor A, Jain V P. J Am Oil Chem Soc, 2009, 86: 309 [5] Gomes Reisa M, dos Reis M M, Leath S, et al. J Chroma togr A, 2011, 1218: 316 [6] Ghiaci M, Aghabarari B, Gil A. Fuel, 2011, 90(11): 3382 [7] Zeng J L, Du Z X, Chen Y F. Petroleum Processing and Pet rochemicals ( 曾建立, 杜泽学, 陈艳凤. 石油炼制与化工 ), 2012, 43(7): 104 [8] Li B, Qiu L Q, Song S F, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory ( 李斌, 裘立群, 宋少芳, 等. 分析试验室 ), 2014, 33(5): 528 [9] Liu B. The Food Industry ( 刘冰. 食品工业 ), 2014(4): 222 [10] Vaz Freire L T, da Silva M D R G, Freitas A M C. Anal Chim Acta, 2009, 633(2): 263 [11] Meng Z, Wen D W, Liao Y P, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 孟哲, 文大为, 廖一平, 等. 色谱 ), 2007, 25(2): 254 [12] Li K X, Chen L, Yan Z C, et al. Journal of Instrumental Analysis ( 李凯欣, 陈砺, 严宗诚, 等. 分析测试学报 ), 2010, 29(1): 39 [13] Señoráns F J, Ibañez E. Anal Chim Acta, 2002, 465: 131 [14] Francois I, Sandra P. J Chromatogr A, 2009, 1216: 4005 [15] Mei S L, Huang W M, Zhou T W, et al. Journal of Sichuan University of Science & Engineering: Natural Science Edi tion ( 梅树莲, 黄为民, 周统武, 等. 四川理工学院学报 : 自然科学版 ), 2005, 18(4): 75 [16] Li Z Y, Fu Q, Li K Y, et al. Chinese Journal of Chromatog raphy ( 李振宇, 傅青, 李奎永, 等. 色谱 ), 2014, 32( 5): 506 [17] Tang J, Ding Y C, Cao X Z, et al. Chinese Journal of Chro matography ( 汤娟, 丁友超, 曹锡忠, 等. 色谱 ), 2014, 32 (11): 1230 [18] Xu Y W, Sun Q L, Huang J, et al. Modern Instruments & Medical Treatment ( 徐永威, 孙庆龙, 黄静, 等. 现代仪器 ), 2012, 18(5): 45