一 摘要 Malassezia 為一種親脂性酵母菌, 在人或犬貓的皮膚角質層或毛囊為正常菌株, 通常分布於油脂分泌旺盛的部位 Malassezia 常被視為一些皮膚病的條件致病性真菌, 例如頭皮屑 汗斑 脂漏性皮膚炎與某些異位性皮膚炎等 由於 Malassezia 為親脂性酵母菌, 因此 lipas

一 摘要 Malassezia 為一種親脂性酵母菌, 在人或犬貓的皮膚角質層或毛囊為正常菌株, 通常分布於油脂分泌旺盛的部位 Malassezia 常被視為一些皮膚病的條件致病性真菌, 例如頭皮屑 汗斑 脂漏性皮膚炎與某些異位性皮膚炎等 由於 Malassezia 為親脂性酵母菌, 因此 lipase 是此菌種賴以維生的重要外泌型酵素, 且 lipase 作用之後的產物被認為是一種過敏原, 此種過敏原可能是引起宿主皮膚產生病變的原因之一, 因此認為抑制此菌種的 lipase 將有助於改善相關疾病症狀 本研究目的即在於測試中草藥對病原菌 Malassezia 的抑菌作用與對 lipase 之抑制效果 本實驗利用敏感性試驗, 篩選中草藥的精油對 Malassezia 的抑菌效果, 分析效果最顯著的精油的組成成分, 並確認其主成分 -citral, 在 250 mg/ml 的確有明顯的抑菌作用 另一方面建立 lipase 抑制物活性篩選帄台, 利用 M. globosa 的菌體 lipase 粗萃取液, 在 1 mm pnpp 受質下的微量分析方法, 有最佳判讀依據, 同時分析 citral 對 lipase 活性之影響, 發現對 lipase 活性的抑制效果遠不及抑菌作用, 顯示 citral 有其他的抑制機制, 有待進一步釐清 二 背景介紹中草藥富含許多活性成分, 近年來應用於天然保養品中佔有廣大的消費市場, 在本草綱目記載中也不乏許多天然植物可作為治療皮膚病, 防止皮膚龜裂 紫外線傷害 增強皮膚健康 預防色素沈澱 皺紋產生以及美白的效果等 Malassezia 菌屬是唯一在正常人體表皮共生的親脂性酵母

菌 (2), 其 lipase 之作用產物被認為可引起多種的皮膚病變, 如汗斑 (pityriasis versicolor) 毛囊炎(folliculitis) 異位性皮膚炎 (atopic dermatitis) 脂漏性皮膚炎(seborrhoeic dermatitis) 頭皮屑 (dandruff) 乾癬(psoriasis) 等 若污染人工導管, 亦會導致系統性的疾病, 產生腹膜炎或菌血症 ; 同時也會造成許多寵物的皮膚炎 (1,3) 在 Malassezia 菌屬中, 只有 M. pachydermatis 不需外來油脂才能生長 (4), 這種油脂依賴性乃是菌體無法合成 myristic acid, 而導致無法和成長鏈脂肪酸 因此參與油脂代謝的酵素對於 Malassezia 菌之生長與致病力是必須的, 所以此類酵素可視為是 Malassezia 菌重要致病因子 (virulence factors)(5) Lipases (EC 3.1.1.3) 可水解三酸甘油酯的酯鍵, 而釋出游離的脂肪酸, 而 Malassezia 菌屬需要外來的油脂才能存活, 所以 lipase 的活性是這類微生物存活的關鍵, 目前有 M. furfur (6) 以及 M. pachydermatis (7) 的 lipase 基因被選殖出來 為了利用外來的油脂, Malassezia 菌屬的基因組中含有高量的分泌型的 lipases ( 有 13 種 ) 與 phospholipases ( 有 9 種 ) 基因存在 ; 從 RT-PCR 與 proteomics 的實驗結果發現, 在頭皮上有數種 lipase 與 phospholipase 基因之表現 (8) 因此我們針對 Malassezia 菌種賴以維生的重要酵素作抑制測試, 從中草藥精油中篩選可能抑制 lipase 的活性物質, 了解其對病原菌 Malassezia 的抑菌作用與對 lipase 之抑制效果 三 實驗方法 1. 敏感性試驗 (Susceptibility testing)

Malassezia 菌種於 30 C,modified Dixon agar ( 含 1.0% Tween 40, 0.2% glycerol, 2.0 % desiccated oxbile 0.6% peptone,0.2% oleic acid,3.6 % malt extract broth and 1.2% bacto agar) 上培養 取單一菌落培養於 30,modified Dixon broth 中 48hr, 以 DMSO 稀釋各種中草藥精油, 將菌液 1/100 稀釋後, 再加入 1/100 反應體積的各種中草藥精油, 使精油最終稀釋 1000 倍,DMSO 最終稀釋 100 倍, 並培養於 96 well 盤中 48hr 後, 取 50μl 培養於 modified Dixon agar 上,30 培養 48hr 2. Lipase 酵素活性測定法以 p-nitrophenyl palmitate (pnpp) 法測定 lipase 酵素之活性, 於 37 進行反應, 並以分光光度計監測 405 nm 波長之吸光變化 將菌種於 modified Dixon broth 培養, 離心分別收集菌體與上清液 取菌體與 3 ml 緩衝液 (MES 10mM,1% Triton X-100; ph 5.5) 使之破菌, 取上清液即為酵素粗萃取液 取適當濃度之酵素粗萃取液, 加入不同濃度的篩選物後, 與 100 μl 反應緩衝液 (MES 10mM, 1% Triton X-100, 2 mm pnpp; ph 5.5) 混合, 於 37 反應 1 小時, 測量 405 nm 波長之吸光變化 四 實驗結果 1. 抑菌作用藉由敏感性試驗, 經過多種精油的篩選之後, 發現精油中有一種較為明顯, 進而分析其主成分為 citral, 因此進一步分析

citral 對 M. furfur 的抑菌作用 結果顯示 citral 大概在 239μg/ml 與 265 μg/ml 濃度間有明顯的抑菌作用 ( 圖一 ), 藉此推測其最低抑菌濃度約為 250μg/ml, 且 citral 對 M. furfur 的抑菌與殺菌濃度範圍似乎相當狹窄, 在 295μg/ml 時可見到菌落所剩無幾 DMSO (control) Citral 239μg/ml Citral 265μg/ml Citral 295μg/ml 圖一 citral 對 M. furfur 的抑菌作用 2. Malassezia lipase 抑制物活性篩選為建立 Malassezia lipase 活性測試帄台, 乃先選擇 M. globosa M. furfur 與 M. pachydermatis 測試其 lipase 活性 ; Malassezia 培養於 modified Dixon broth 至混濁後 (5-10 天 ), 分別收下菌體 (pellet) 與上清液 (supernatant), 以 2 mm 之 pnpp 進行活性測試, 結果以 M. globosa 的菌體 lipase 活性最容易偵測 ( 圖二 ), 考量到實驗準備難易度, 因此決定利用 M. globosa 的菌體

lipase 進行抑制物活性篩選 圖二 各菌株 lipase 活性測試 以 2 mm pnpp, 加入不同量的粗. 萃取酵素液 (50μl,100μl,200μl) 進行活性測試 Blank 未加酵 素粗萃取液, 以作為濁度對照組 為建立 Malassezia lipase 抑制物活性篩選帄台, 首先以 2 mm pnpp 進行活性篩選, 篩選物為各種精油, 發現加入 1/100 反應體積的精油後, 整個反應液呈現混濁現象, 而干擾吸光值的偵測, 推測酵素受質 -pnpp 與精油皆為疏水性物質, 雖然反應緩衝液中含有 1% Triton X-100, 但溶解度仍低, 因此降低酵素受質 -pnpp 的濃度, 改以 1 mm pnpp 進行 lipase 抑制物活性篩選, 結果發現精油 1-3 對 lipase 活性, 似乎有一點抑制效果 ( 圖二 ) 雖然溶解度問題有所改善, 但發現許多精油帶有顏色, 在最終稀釋濃度為 100 倍下, 仍有明顯的顏色會干擾吸光值判讀, 因此進一步再降低精油的濃度, 重新篩選 先將精油利用 DMSO 稀釋 10 倍, 再加入 1/100 反應體積的精油, 使精油最終稀釋濃度為 1000 倍, 而 DMSO 最終稀釋濃度為 100

倍 在此情況下, 認為精油顏色的吸光干擾有變小的現象 ( 圖三 ), 因此以此為篩選帄台, 進行後續的 lipase 抑制物活性分析 圖三 lipase 抑制物活性篩選 以 1 mm pnpp,50 l 酵素粗萃. 取液, 分別加入各種精油, 使最終稀釋 100x. 圖四 lipase 抑制物活性篩選 以 1 mm pnpp,50 l 酵素粗萃取 液, 分別加入各種精油, 使最終稀釋 1000x

3. Citral 對 lipase 活性之影響藉由敏感性試驗篩選, 發現 Citral 對 M. furfur 有明顯的抑菌效果, 因此進一步分析其對 lipase 活性之影響 ; 結果發現, 當 Citral 的濃度提高至 4.5 mg/ml 時, 對於 lipase 的確有抑制作用 ( 圖四 ). 圖五 Citral 對 lipase 活性之影響 以 1 mm pnpp,50 l 酵素粗 萃取液, 加入不同濃度 citral 五 討論由於 Malassezia 菌屬的生長速度不一, 因此本研究中主要以 Malassezia furfur 及 Malassezia globosa 為主要的研究菌株 在本次研究中, 篩選出中草藥之精油內有一活性物質, 即為 Citral, 對於 Malassezia 菌屬有抑菌的效果, 在較高濃度下, 對於 lipase 也有抑制其活性的效果, 但 citral 對 lipase 活性的抑制效果遠不及抑菌作用, 顯示 citral 有其他的抑制機制, 有待進一步釐清 Malassezia 菌屬對於 Citral 有一定的感受性, 可作為之後的研究方向, 了解 Citral 對 Malassezia 菌屬的抑菌機制為何, 進而瞭解

Malassezia 菌屬的致病機制, 希望可以作為治療此類皮膚病變的新 途徑 六 參考資料 1. M. J. CRESPO,* M. L. ABARCA, AND F. J. CABAN ES.1999, Isolation of Malassezia furfur from a Cat,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,, p. 1573 1574 2. Ashbee, H. R., and E. G. Evans. 2002. Immunology of diseases associated withmalassezia species. Clin Microbiol Rev 15:21-57. 3. Gupta, A. K., R. Batra, R. Bluhm, T. Boekhout, and T. L. Dawson, Jr. 2004. Skin diseases associated with Malassezia species. J Am Acad Dermatol 51:785-98. 4. Guillot, J., S. Hadina, and E. Gueho. 2008. The genus Malassezia: old facts and new concepts. Parassitologia 50:77-9. 5. Batra, R., T. Boekhout, E. Gueho, F. J. Cabanes, T. L. Dawson, Jr., and A. K. Gupta. 2005. Malassezia Baillon, emerging clinical yeasts. FEMS Yeast Res 5:1101-13. 6. Brunke, S., and B. Hube. 2006. MfLIP1, a gene encoding an extracellular lipase of the lipid-dependent fungus Malassezia furfur. Microbiology 152:547-54. 7. Shibata, N., N. Okanuma, K. Hirai, K. Arikawa, M. Kimura, and Y. Okawa. 2006. Isolation, characterization and molecular cloning of a lipolytic enzyme secreted from Malassezia pachydermatis. FEMS Microbiol Lett 256:137-44. 8. Dawson, T. L., Jr. 2007. Malassezia globosa and restricta: breakthrough understanding of the etiology and treatment of dandruff and seborrheic dermatitis through whole-genome analysis. J Investig Dermatol Symp Proc 12:15-9.