安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 561 基础医学研究 Gardiquimod 对 HepG2 细胞中 VEGF 和 TIMP1 表达的影响 程丰伟, 李磊, 王芳, 金锐, 罗欣, 张胜权 摘要目的研究 Tol 样受体 7(TLR7) 的配体 Gardiquimod 对 HepG2 细胞中血管内皮生长因子 (VEGF) 和基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP1)mRNA 表达的影响, 并分析其激活的信号通路 方法 HepG2 细胞经不同时间的 Gardiquimod(2 μg/ml) 处理后, 提取细胞总 RNA 和总蛋白,RT PCR 分析 VEGF 和 TIMP1 转录水平的变化 ;Westernblot 分析丝裂原蛋白激活激酶 - 胞外信号调节激酶 (MAPKs ERK1/2) 信号通路, 并通过 MAPKs ERK1/2 特异性阻断剂 PD98059 阻断相应的信号途径, 进而分析两者的相关性 结果 HepG2 细胞中表达 TLR7, 但较外周血单个核细胞 (PBMC) 较少 Gardiquimod 刺激 HepG210min 后下调细胞中 VEGFmRNA 的表达, 而刺激细胞 30min 后 TIMP1mRNA 的表达有明显的上调 ;Westernblot 结果显示, 细胞中的 ERK1/2 的磷酸化水平明显降低 ; 并且 ERK1/2 的特异性抑制剂 (PD98059) 能有效抑制 HepG2 细胞中 ERK1/2 磷酸化作用 结论 TLR7 激活能够下调 HepG2 细胞中 VEGF 的表达, 并与 ERK1/2 信号通路相关 ; 同时 TLR7 激活上调 TIMP1 的表达, 但与 ERK1/2 信号通路无相关性 关键词 中图分类号 TLR7;VEGF;TIMP1;HepG2;Gardiquimod R34 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2014)05-0561-04 Tol 样受体 (Tol likereceptors,tlrs) 是一类重要模式识别受体 (paternrecognitionreceptors,prr), 不仅参与先天性免疫, 而且在获得性免疫中也发挥重要作用 TLR7 能识别某些天然小分子抗病毒化合物和病毒单链 RNA (single strandedrna, sr NA), 激活髓系分化因子 88(myeloiddiferentiation factor88,myd88) 依赖的信号通路, 介导抗病毒免疫反应 [1] 并且,TLR7 亦可识别一些人工合成的咪唑喹啉类或鸟苷酸衍生物类的小分子化合物, 如 [2] R848 和 Gardiquimod 等 近年来研究显示 TLR7 2014-01-05 接收基金项目 : 国家自然科学基金 ( 编号 :81271748) 作者单位 : 安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室, 合肥 230032 作者简介 : 程丰伟, 男, 硕士研究生 ; 张胜权, 男, 教授, 硕士生导师, 责任作者,E mail:sqz36@ yahoo.com 不仅仅表达于免疫细胞, 而且在部分癌细胞中也有表达, 特别在血液肿瘤以及皮肤肿瘤中关于 TLR7 的研究常见报道, 具体作用尚不明确, 但 TLR7 与肿 [3] 瘤的发生 迁移等密切相关 研究显示 TLR7 激活后具有促某些抗肿瘤的细胞因子表达, 并对某些肿瘤的侵袭 转移有一定抑制作用 临床上将 TLR7 激动剂咪喹莫特作为治疗血液系统肿瘤的方法, 明显减轻了慢性淋巴细胞白血病患者肿瘤的皮肤浸润 ;TLR7 配体咪喹莫特作用于原发性皮肤肿瘤后能激活核因子 κb(nf κb) 信号途径并且诱导促炎症因子以及相关细胞因子的表达 [4] 但 TLR7 对肝癌细胞中一些相关炎症因子表达的影响尚不清楚, 该研究以 HepG2 细胞为模式细胞, 观察 TLR7 激活后细胞中血管内皮生长因子 (vascularendothelial growthfactor,vegf) 和基质金属蛋白酶抑制剂 1 (matrixmetalo proteinaseinhibitor1,timp1) 表达的变化, 并分析其相关的信号途径 1 材料与方法 1.1 细胞与试剂 HepG2 细胞株由本实验室冻存 ; 外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclear cel,pbmc) 细胞提取于新鲜血液 Gardiquimod PD98059 购于美国 Sigma 公司 ;TLR7 及 β actin 抗体购于美国 SantaCruz 公司 ;ERK1/2 及 p ERK1/2 抗体购于美国 Celsignaling 公司 ;RT PCR 试剂购于日本 TaKaRa 公司 ; 逆转录试剂购于加拿大 Fer mentas 公司 ; 新生小牛血清 DMEM 培养基购于美国 Gibco 公司 ; 引物合成由上海生工生物工程有限公司完成 1.2 引物登陆 NCBI 网站检索 GAPDH VEGF TIMP1 基因序列 (Human),PrimerPremier5.0 软件设计 3 对引物, 见表 1 1.3 细胞培养将冻存的 HepG2 细胞复苏并接种于 25ml 的培养瓶中, 加入 5ml 含 10% 小牛血清并加入双抗 ( 青霉素与链霉素 ) 的 DMEM 培养液, 置 5%CO 2 37 细胞培养箱中培养 细胞传代 2~3 次后, 状态较佳时, 使用胰酶消化细胞并将之接种于
562 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 24 孔细胞培养板, 浓度约为 5 10 4 / 孔 ; 待细胞全部贴壁后换无血清的 DMEM 培养并加入 Gardiquimod (2μg/ml) 刺激, 时间分别为 10 30min,1 3 6 12 24 36h, 并设置空白对照 表 1 荧光定量 PCR 引物序列基因引物序列 (5 3 ) GAPDH F:AGATCATCAGCAATGCCTCCTG R:ATGGCATGGACTGTGGTCATG VEGF F:CTCTACCTCCACCATGCCAAGT R:TCGATTGGATGGCAGTAGCTG TIMP1 F:TCTGCAATTCCGACCTCGTC R:CTGTTCCAGGGAGCCACAAA 1.4 RT PCR 分析 VEGFmRNA 和 TIMP1mR NA 水平的变化提取 24 孔细胞板中加药刺激后细胞的总 RNA, 逆转录 PCR( 步骤遵循试剂盒说明书 ) 合成 cdna 模板以备下步使用 配制 RT PCR 体系如下 : 每份加入 SYBRPremixExTaqⅡ(2 )10 μl, 上游引物 0 4μl, 下游引物 0 4μl,RoxRefer encedyeⅡ(50 )0 4μl, 上一步保存的 cdna 模板 2μl,ddH 2 O6.8μl, 总共 20μl 体系, 以 GAPDH 为内参, 上机 (7500 型荧光定量 PCR 仪 ) 检测 1.5 Westernblot 分析提取 24 孔细胞板中加药刺激后细胞总蛋白,-20 储存备用 配制 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶, 每孔上样 10μl, 设置 60V 电压进行 Tris 甘氨酸电泳缓冲液电泳, 至溴酚蓝超出分离胶后将电压调至 120V, 待溴酚蓝泳至凝胶底部, 结束电泳 设置 150mA, 湿转法将蛋白质冰上转移至 PVDF 膜上, 时间为 3h 将 PVDF 膜置于 5% 脱脂牛奶中室温封闭 2h, 置于相应的一抗中, 4 结合过夜, 取出 PVDF 膜,TBST 洗膜 3 次, 每次 10min, 置于相应的二抗中室温结合 2h;TBST 洗膜 3 次, 加入 ECL 发光剂, 显影压片 抗体浓度如下, 抗 β actin: 一抗 1 5000, 二抗 1 5000; 抗 p ERK: 一抗 1 1000, 二抗 1 10000; 抗 TLR7: 一抗 1 500, 二抗 1 5000 1.6 统计学处理采用 SPSS19.0 软件进行统计分析, 数据以 x±s 珋表示, 不同时间点之间的比较采用方差分析, 组间比较采用 t 检验 2 结果 2.1 TLR7 在 HepG2 细胞的表达提取 HepG2 细胞的总蛋白,Westernblot 检测细胞中 TLR7 蛋白的 表达, 设置 PBMC 作为对照组 结果显示 TLR7 在 HepG2 细胞中表达, 但表达量较 PBMC 略少, 见图 1 PBMC HepG2 TLR7 β-actin 图 1 Westernblot 分析 TLR7 蛋白在 HepG2 细胞以及 PBMC 中的表达 2.2 不同时间的 Gardiquimod 对 HepG2 细胞 VEGF 和 TIMP1 的 mrna 表达的影响 TLR7 配体 Gardiquimod 刺激 HepG2 细胞后 RT PCR 分析 VEGFmRNA 和 TIMP1mRNA 表达水平的变化 检测结果显示,TIMP1mRNA 水平在 36h 内较空白对照组明显上调, 并且在 6h 达到峰值 ;VEGFmRNA 水平在 36h 内较空白组显著降低, 在 6h 表达水平又有一个短暂的回升, 并在 1h 时降至最低, 见图 2 mrna 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 VEGF TIMP1 * * * * * 10 min 30 min 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36 h 图 2 Gardiquimod(2μg/ml) 对 HepG2 细胞中 VEGF TIMP1mRNA 表达量的影响 与空白对照组比较 : P<0.05 2.3 Westernblot p ERK1/2 的表达量较空白组显著降低,6h 内呈时间依赖性, 并在 6h 表达最弱, 见图 3 10 min 30 min 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36 h 图 3 Westernblot 分析 p ERK1/2 蛋白表达 * * * * * β-actin p-erk 2.4 Gardiquimod 与 PD98059 协同刺激 HepG2 细胞后对细胞中 VEGFmRNA 和 TIMP1mRNA 表达的影响 RT PCR 检测显示 :1 PD98059 刺激 * *
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 563 HepG2 细胞后, 细胞中 VEGFmRNA 的表达量较空白对照组有下降的趋势, 见图 4, 而 Gardiquimod 刺激细胞后也下调 VEGFmRNA 的表达量 ( 图 2), 并且磷酸化的 ERK1/2 的表达量有明显的下调趋势 ( 图 3), 由此推断,Gardiquimod 刺激细胞的过程可能与 ERK1/2 信号途径相关 2 PD98059 下调 TIMP1mRNA 的表达 ( 图 4), 但是 Gardiquimod 刺激细胞后下调 ERK1/2 的磷酸化并上调 TIMP1mR NA 的表达 ( 图 2 3), 提示 Gardiquimod 上调 TIMP1 的表达与 ERK1/2 信号途径可能无相关性 mrna 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 VEGF TIMP1 * * * * * 1 2 3 4 图 4 PD98059 和 Gardiquimod 协同刺激后 HepG2 细胞中 VEGFmRNA 和 TIMP1mRNA 的相对表达量 1: 空白对照组 ( 同等培养条件未加入 Gardiquimod 以及 PD98059);2:PD98059(100μmol/L) 作用 1h;3:PD98059(100μmol/ L) 作用 1h 后加入 Gardiquimod(2μg/ml) 刺激 6h;4:Gardiquimod(2 μg/ml) 作用 6h; 与空白对照组比较 : P<0.05 2.5 特异性抑制剂对细胞中信号通路的影响 Westernblot 检测结果表明,p ERK1/2 的特异性抑制剂 PD98059(100μmol/L) 能有效抑制 HepG2 细胞中 ERK1/2 磷酸化作用, 见图 5 1 2 3 4 * ERK1/2 p-erk1/2 图 5 特异性抑制剂对 HepG2 细胞中 ERK1/2 磷酸化的影响 1: 空白对照组 ;2:PD98059;3:PD98059+Gardiquimod[ 加药顺序为先加入 PD980591h 后再加入 Gardiquimod(2μg/ml) 作用 3h]; 4:Gardiquimod 3 讨论 [5] 近年来研究表明肝癌细胞中高表达 VEGF, 后者在肿瘤组织中促进血管生成, 对于肿瘤细胞的 增殖 迁移均不可或缺 基质金属蛋白酶家族 (MMPs) 及基质金属蛋白酶抑制剂家族 (TIMPs) 作为一对相辅相成的细胞因子, 与肿瘤增殖 侵袭和迁移密不可分 [6] 细胞外基质(ECM) 是肿瘤侵袭和转移的重要组织屏障,MMPs 则是突破这个屏障最有效的裂解酶 TIMPs 家族在 ECM 中可以抑制 MMPs 的活性, 主要方式是通过与 MMPs 结合成紧密的非共价键复合物, 从而调节 MMPs 的表达 [7-8] 丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 是真核生物信号传递中最重要的途径之一,MAPK 接收胞外信号后活化, 进入细胞核中激活相应的靶基因, 参与基因表达调控 细胞质功能活动等 MAPK 可促进血管内皮细胞的增殖以及新血管生成, 是肿瘤发生和转移中的重要因素 [9] ERK1/2 是 MAPK4 个最主要的亚族 [10-11] 之一 有研究表明 ERK1/2 在肝癌以及前列腺癌等多种肿瘤组织中均出现活性增强或者表达异 [12] 常, 而且, 有研究表明 ERK1/2 抑制剂可以将乳腺癌 卵巢癌和骨肉瘤等肿瘤细胞阻断在 S 期, 抑制肿瘤细胞增殖和生长 ; 胃癌组织中 ERK1/2 和 VEGF 表达呈正相关, 两者在胃癌的发生 发展中共同促进了肿瘤的浸润和转移 [13] 因此,ERK1/2 表达调控异常与肿瘤的发生有着密切关系 本研究提示 2μg/ml 的 Garquimod 刺激 HepG2 细胞 VEGFmRNA 水平显著下降, 并在 1h 时达到最低 ; 并且细胞中 TIMP1mRNA 水平显著上升, 并在 6h 时达到峰值 磷酸化 ERK1/2 的表达量呈逐渐下降的趋势, 一定周期内具有时间依赖性, 在 6h 时达到最低 以上结果提示 TLR7 激活可能对 HepG2 细胞的增殖 迁移和侵袭有着一定程度的抑制作用 ; 抑制剂研究结果提示,Gardiquimod 下调细胞中 VEGF 的表达可能与 ERK1/2 的磷酸化相关, 下调 p ERK 可能是 Gardiquimod 抑制 HepG2 细胞 VEGF 表达的一个重要途径 Gurdquimod 上调 TIMP1 的表达这一效应具体是通过哪些信号途径, 有待进一步研究 并且,Gardiquimod 对 HepG2 细胞的凋亡 迁移是否能发挥一定的生物学作用, 还有待进一步的探讨 参考文献 [1] LundJ,AlexopoulouL,SatoA,etal.Recognitionofsingle strandedrnavirusesbytol likereceptor7[j].procnatlacad SciUSA,2004,101(15):5598-603. [2] HuangB,ZhaoJ,LiH,etal.Tol likereceptorsontumorcels facilitateevasionofimmunesurveilance[j].cancerres,2005,
564 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 65(12):5009-14. [3] MeyerT,StockflethE.ClinicalinvestigationsofTol-likerecep torsagonists[j].expertopininvestigdrugs,2008,17(7):1051-65. [4] Sch nm P,Sch nm.tlr7andtlr8astargetsincancerthera py[j].oncogene,2008,27(2):190-9. [5] 刘尧, 王长振, 刘明华, 等.VEGF/VEGFR 信号转导通路在肝癌靶向治疗中的研究进展 [J]. 中国免疫学杂志,2013,29 (1):97-101. [6] 宋仕茂, 何晓文.MMP 9 及 TIMP 1 在非小细胞肺癌中的表达和意义 [J]. 现代肿瘤医学,2013,21(9):1978-81. [7] SehgalG,HuaJ,BernhardEJ,etal.Requirementformatrix metaloprteinase 9(galatinaseB)expresioninmetastasisbymu rineprotatecarcinoma[j].amjpatho,1998,152(2):591-6. [8] 李莉, 张声, 林华, 等. 基质金属蛋白酶和组织金属蛋白酶抑制剂表达失衡与胃癌浸润转移的关系 [J]. 癌症,2002, 21(3):305-10. [9] HamonB,HamonP,Bovier LapiereM,etal.Achildwithresist ancetothyroidhormonewithoutthyroidhormonereceptorgene mutation:a20 yearfolowup[j].thyroid,2008,18(1):35-44. [10] BrancaM,CiotiM,SantiniD,etal.ActivationoftheERK/ MAPkinasepathwayincervicalintraepithelialneoplasiaisrelated togradeofthelesionbutnottohigh riskhumanpapilomavirus, virusclearance,orprognosisincervicalcancer[j].am JClin Pathol,2004,122(6):902-11. [11]AlbanelJ,Codony ServatJ,RojoF,etal.Activatedextracelu larsignal regulatedkinases:asociationwithepidermalgrowth factorreceptor/transforminggrowthfactoralphaexpresioninhead andnecksquamouscarcinomaandinhibitionbyanti epidermal growthfactorreceptortreatments[j].cancerres,2001,61 (17):6500-10. [12] 吴凤娟,DiwaKoirala, 刘斯婕, 等. 新型噻唑并三嗪类化合物 R001 抑制 ERK1/2 磷酸化的抗肿瘤作用 [J]. 现代生物医学进展,2012,29(12):5638-42. [13] 王琦, 梁涛, 张更棉, 等. 胃癌中 ERK 1 VEGF 的表达及相关性分析 [J]. 西部医学,2013,25(2):230-4. EfectsofGarquimodontheexpresionof VEGFandTIMP1inHepG2cels ChengFengwei,LiLei,WangFang,etal (DeptofBiochemistryandMolecularBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032) Abstract Objective ToinvestigatetheefectofTol likereceptor7(tlr7)ligandgardiquimodonvascularen dothelialgrowthfactor(vegf)mrnaandmatrixmetalo proteinaseinhibitor1(timp1)mrnainhepg2cels, andtoanalyzetheiractiviatedsignaltransductionpathways.methods ExtractedtotalRNAandtotalproteinofcul turedhepg2cels,whichweretreatedwithgardiquimod(2μg/ml)fordiferenttime.themrnaexpresionof VEGFandTIMP1wasmeasuredbyReal timepcr,andanalyzedtheerk1/2signaltransductionpathwaybyu singwesternblot.andtousethespecificinhibitoroferk1/2(pd98059)toblockcorespondingsignalingpath ways,thenthecorelationwasanalyzed.results TLR7wasexpresedinHepG2cels,butlesthanthatinpe ripheralbloodmononuclearcels(pbmc).afterthehepg2celsweretreatedwithgardiquimodfor10min,the mrnaofvegfinthecelswasobviouslyreduced.however,whenthecelsweretreatedwithgardiquimodfor30 min,themrnaoftimp1inhepg2celswasobviouslyincreased.westernblotresultsindicatedthatthephospho rylationoferk1/2inthecelswasobviouslydownregulated.what smore,thespecificinhibitoroferk1/2 (PD98059)couldefectivelysuppresthephosphorylationofERK1/2inHepG2cels.Conclusion TLR7activa tiondownregulatestheexpresionofvegfinhepg2cels,andasociateswitherk1/2signalpathway;tlr7ac tivationraisestheexpresionoftimp1atthesametime,whichisnotrelatedwitherk1/2signalpathway. Keywords TLR7;VEGF;TIMP1;HepG2;Gardiquimod
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 565 卡波肉瘤相关疱疹病毒 ORFK12 蛋白初步研究 汪小五, 曾宪聪, 陈伟, 张莹, 吴悦, 杜爱能, 刘璐璐, 王林定 摘要目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒 (KSHV)ORFK12 基因在大肠杆菌的表达及表达的蛋白在普通人群中检测 KSHV 的感染情况 方法设计一对特异性引物, 以 BCBL 1 细胞总 DNA 为模板, 采用 PCR 方法扩增 KSHVORFK12 基因 构建含目的基因的重组质粒命名为 PQE 80L K12 和诱导蛋白表达 采用 ELISA 法和 Westernblot 法筛查临床收集的血清标本中感染 KSHV 的情况 结果异丙基 β D 硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 诱导后的 PQE 80L K12 重组菌经十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) 显示有一个约 10ku 的融合表达蛋白为 ORFK12 蛋白 采用 ELISA 法和 Westernblot 法检测显示 ORFK12 蛋白能与 KSHV 阳性血清反应 结论 KSHVORFK12 基因在大肠杆菌中表达, 表达的 ORFK12 蛋白在实验室检测感染 KSHV 有一定的辅助作用 关键词白 卡波肉瘤相关疱疹病毒 ;ORFK12 基因 ;ORFK12 蛋 中图分类号 R373.4 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2014)05-0565-04 卡波肉瘤相关疱疹病毒 (Kaposi ssarcoma aso ciatedherpesvirus,kshv) 是由美国哥伦比亚大学华裔病理学家 Chang 等于 1994 年对卡波肉瘤 (Kaposi ssarcoma,ks) 组织中特异 DNA 进行检测时发现的, 是双链 DNA 病毒 [1-2] [3] 经研究显示 KSHV 是 KS 原发渗液性淋巴瘤 (primaryefusionlymphoma, PEL) 多中心卡斯特慢病 (multicentriccastleman disease,mcd) 的病原体 K12 基因编码的蛋白被称为卡波济蛋白, 它是 KSHV 感染潜伏期所特有的蛋白 [4], 几乎在所有的 KS 纺锤样细胞和潜伏感染的原发渗液性淋巴瘤细胞中表达 [5] 笔者通过对 KSHVK12 基因进行基因扩增, 诱导其表达, 表达蛋白检测与血清的反应情况, 为研究 KSHV 的致病机 2013-11-25 接收基金项目 : 国家自然科学基金 ( 编号 :81271837); 安徽省教育厅自然科学基金 ( 编号 :KJ2012A161); 安徽医科大学博士科研经费资助项目 ( 编号 :XJ200914) 作者单位 : 安徽医科大学微生物学教研室, 合肥 230032 作者简介 : 汪小五, 女, 硕士研究生 ; 王林定, 男, 教授, 硕士生导师, 责任作者,E mail:wan glinding@ahmu.edu.cn 制提供实验依据 1 材料与方法 1.1 材料来源细胞系 BCBL 1 表达载体 PQE 80L 质粒 宿主大肠杆菌 DH5a BL21(DE3) 为本实验室保存 ;peasy T1simplecloningkit 购自北京全式金生物技术有限公司 ;Ni NTA 购自美国 GE 公司 1.2 工具酶和试剂 BamH Ⅰ SalⅠ 购自美国 Fermentas 公司 ; 质粒小抽提取试剂盒购自美国 Axy gen 有限公司 ;PVDF 膜购自美国 Bio Rad 公司 ; 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记山羊抗人 IgG 抗体 碱性磷酸酶 (ALP) 标记的山羊抗人 IgG 购自武汉博士德生物工程有限公司 1.3 重组 T 质粒的构建和重组质粒 PQE80 L K12 的构建及表达与纯化 1.3.1 PCR 引物的设计与合成参照 NCBI 上的 K12 序列设计引物如下, 上游引物 :5 TTG GATCCATGGATAGAGGCTTAACG 3 ; 下游引物 :5 TTGTCGACTTAGTGCGCGCCCGTTGC 3 ( 下划线部分分别为 BamHⅠ SalⅠ 的酶切位点 ), 以 BCBL 1 细胞总 DNA 为模板, 按照设计好的 K12 序列的上 下游引物送至上海生工生物公司合成 PCR 反应条件 :95 变性 5min, 然后 94 1min,50 30 s,72 1min 热循环 35 次, 最后 72 延伸 10 min PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 大小正确, 用胶回收试剂盒切胶回收 PCR 产物 1.3.2 重组 T 质粒的构建切胶回收的 PCR 产物 PCR K12 与 peasy T1 载体用 T4 连接酶 16 连接过夜, 连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞, 铺板于氨苄 (Amp) 抗性的 LB 培养基平板上 ( 铺板前在 LB 培养基平板上均匀涂布 8μl 的 500mmol/L IPTG 和 40μl 的 20mg/ml 半乳糖苷酶 (X gal) 混合液, 用于蓝白斑筛选 ), 置于 37 恒温培养箱倒置培养过夜 次日挑取白斑单菌落转接于 3ml 含 Amp 的 LB 培养基上 37 恒温摇床 200r/min 培养过夜后提取质粒, 用 BamHⅠ SalⅠ 做双酶切鉴定 酶切正确的重组 T 质粒做基因测序进一步鉴定
566 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 1.3.3 重组质粒 PQE 80L K12 的构建 PQE 80L 表达载体和测序正确重组 T 质粒用 BamHⅠ SalⅠ 同时做双酶切, 回收双酶切后的 PQE 80L 的载体和目的基因 ORFK12 用 T4 连接酶连接 连接产物转化大肠杆菌 BL21 感受态细胞, 其后的构建过程如构建重组 T 质粒过程一样, 同样提取质粒做双酶切和测序鉴定 1.3.4 目的蛋白诱导表达及表达蛋白纯化经鉴定的重组 PQE 80L K12 转化菌接种于 3ml 含有 Amp 青霉素的 LB 液体培养基中, 置于 37 恒温摇床 200r/min 培养过夜后 将过夜培养物取 60μl 转入 3ml 含 Amp 青霉素的 LB 液体培养基中 ( 转种比例 1 50), 培养 3h 后, 取出 1ml 培养物作为诱导前样品后, 按 1 1000 比例加入 IPTG 诱导剂, 其终浓度为 1mmol/L 37 200r/min 摇床继续培养 8h, 再取 1ml 培养物作为诱导后的样品 诱导前样本和诱导后样本 SDS PAGE 电泳分析蛋白表达情况, 确认蛋白已表达后, 次日扩大培养 (500mlLB 培养液 ) 表达蛋白制备 : 收集扩大培养的表达菌体 (500 mllb 培养液 ), 在 4 7000r/min 离心 15min, 弃上清液, 用 100ml 裂解缓冲液 ( 非变性 ) 裂解沉淀, 蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度为 1mmol/ml, 加入溶菌酶至终浓度 1mg/ml 冰上放置 40min 用超声波细胞破碎仪破碎细胞, 功率 300W, 超声 3s 间隔 10s, 破碎 3 次 于 4 以 8000r/min 离心 15min 之后, 用灭菌的移液枪将上清液移至 50ml 的离心管里, 再用 0.45μm 的滤膜过滤即为上清粗蛋白, 留下的沉淀加 50ml 变性的裂解缓冲液室温溶解, 8000r/min 离心 15min 后取上清液并且用 0 45 μm 的滤膜过滤后即为包涵体粗蛋白 10μl 的上清粗蛋白和 10μl 的包涵体粗蛋白样品经 SDS PAGE 电泳确定目的蛋白的表达位置 用 10 倍柱体积的超纯水清洗柱子, 将已预处理好的 Ni NTA 悬浮液混匀填装柱子, 体积约 1.5ml 将包涵体蛋白样品或者上清蛋白样品经过 Ni NTA 柱进行纯化 依次用 5 倍柱体积的裂解缓冲液,5 倍柱体积的洗脱缓冲液过柱, 洗脱杂蛋白 最后用 5 倍柱体积的洗脱液缓冲液洗脱吸附在 Ni 柱中的目的蛋白, 分管收集样品 纯化的蛋白经 SDS PAGE 电泳鉴定 1.4 ELISA 法筛查临床血清标本包被 : 上述纯化的含目的蛋白样品用 ph9 6 的包被缓冲液稀释 到 1ng/μl, 将其作为抗原, 在 96 孔酶标板中加入 50 μl,4 包被过夜 ; 洗板 :PBS T 洗板 5 次 ; 封闭 : 每孔加入 250μl 含 5% 脱脂奶粉和 1% 山羊血清的 PBS 溶液,37 孵育 1h; 洗板 :PBS T 洗板 5 次 ; 第一抗体结合 : 利用本实验室制备的 KSVHORF65 ORF73 和 ORFK8.1 蛋白作为抗原从蚌埠地区普通人群血清中筛选的 KSHV 阳性, 阴性血清 ( 包括 32 份阳性和 32 份阴性 ) 作为一抗, 其血清按 1 100 比例稀释, 每孔加入 50μl,37 孵育 1h; 洗板 :PBS T 洗板 5 次 ; 第二抗体结合 : 采用 AP 标记的山羊抗人的抗体作为二抗, 按 1 2000 比例每孔加入 50μl,37 孵育 1h; 洗板 :PBS T 洗板 5 次 ; 显色 : 以 p NPP 作为显色剂, 用显色缓冲液稀释到 1mg/ml 后每孔加入 50μl,37 孵育 15min, 加入 3mol/LNaOH 溶液终止反应, 用酶标仪测 405nm 处的吸光度 (opti caldensity,od) 值 每份样本重复 3 次 分析纯化的目的蛋白与血清里的相应抗体的反应情况 结果判定 : 以阴性样品 OD 值平均值加上 5 倍标准差 (standarddeviation,std) 为 Cut Of 值 样品 OD 值高于 Cut Of 值则认为该血清与 ORFK12 基因表达的蛋白有反应 有反应的阳性血清和无反应的阴性血清用于 Westernblot 实验进一步确认其与血清的反应情况 1.5 Westernblot 法鉴定 ORFK12 蛋白与血清的反应性纯化了的目的蛋白经 SDS PAGE 分离后转移至 PVDF 膜上,PVDF 膜放在封闭液中封闭 2h, 与 1 100 稀释的从以上利用 ELISA 法筛选出的 10 份有反应的阳性血清和无反应的阴性血清随机各取 3 份作为一抗 4 孵育过夜 再与 HRP 标记的山羊抗人 IgG 抗体 (1 20000) 室温孵育 1h, 将化学发光底物试剂加至 PVDF 膜上 把 X 线片覆盖在膜上压紧曝光, 拍照观察结果 2 结果 2.1 KSHV ORFK12 基因 PCR 扩增 PCR 扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶上出现了约 183bp 大小的条带, 与预期的 183bp 扩增片段大小一致 见图 1A 2.2 重组 T 质粒酶切和测序鉴定重组转化菌经 LB 液体培养基过夜培养后提取质粒 质粒用 BamHⅠ SalⅠ 做双酶切后经 1% 琼脂糖凝胶电泳, 在琼脂糖凝胶上出现两条特异性条带, 其中一条约为 5100bp, 还有一条约为 183bp, 证明 KSHVOR FK12 基因已经与 T 载体连接成功 酶切有目的条
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 567 带的重组 T 质粒拿到公司进行测序, 测序结果正确 见图 1B 2.3 重组 PQE 80L K12 质粒酶切和测序鉴定提取重组质粒, 同样用 BamHⅠ SalⅠ 做双酶切后经琼脂糖凝胶电泳验证, 结果出现其中一条约为 5000bp, 还有一条约为 183bp, 证明 KSHV OR FK12 基因已经 PQE 80L 表达载体连接成功 酶切有目的条带的重组质粒拿到公司进行测序, 测序结果正确 见图 1C 值 2.6 Westernblot 鉴定 ORFK12 蛋白与血清的反应性纯化的目的蛋白经 SDS PAGE 分离后转移至 PVDF 膜上, 进行 Westernblot 鉴定, 纯化的蛋白与 KSHV 阳性血清有反应印迹, 与 KSHV 阴性血清没有反应印迹, 初步证明 KSHVORFK12 基因表达蛋白与血清中相应抗体有反应性 见图 3 图 1 ORFK12 目的基因 PCR 扩增和重组质粒双酶切鉴定 A:ORFK12 基因 PCR 扩增图 ;B: 重组 T 质粒双酶切鉴定图 ;C: 重组 PQE 80L K12 质粒双酶切鉴定图 ;M:Marker;1:PCR 产物 183 bp;2: 重组 T 质粒 ;3: 重组 T 质粒双酶切 ;4: 重组 PQE 80L K12 质粒 ;5: 重组 PQE 80L K12 质粒双酶切 2.4 转化 诱导及纯化含目的基因 KSHVOR FK12 基因的表达质粒转化到 BL21 受体菌中, 经终浓度 1mmol/LIPTG 诱导后,SDS PAGE 电泳鉴定, 重组蛋白以包涵体形式表达 包涵体经 0 45μm 的滤膜滤过后的包涵体粗蛋白经过 Ni 亲和层析填料纯化后得到了约 10ku 的蛋白, 箭头处指的是表达的目的蛋白 ORFK12 蛋白 见图 2 图 2 KSHVORFK12 蛋白的表达与纯化 M:Marker;1: 重组菌诱导前 ;2: 重组菌诱导后 8h;3: 破碎后上清 ;4: 破碎后包涵体 ;5~7:Ni NTA 填料纯化后包涵体蛋白 2.5 ELISA 法筛查临床血清情况以纯化的蛋白作为抗原, 采用 ELISA 法检测 64 份血清样本中 KSHV 感染情况的检测, 结果发现 32 份阳性血清中有 10 份检测后 OD 值高于临界值 (Cut Of 值为 0 705),32 份阴性血清经检测后 OD 值低于 Cut Of 图 3 Westernblot 检测 ORFK12 蛋白与 KSHV+ 和 KSHV 血清 1~3:ORFK12 蛋白与临床感染 KSHV 的 3 份血清和未感染 KSHV 的 3 份血清 3 讨论 KSHV 又称人类疱疹病毒 8 型病毒, 属于 γ 疱疹病毒亚科, 是双链 DNA 病毒 [6] KSHV 在部分非洲和欧洲尤其是意大利和南部地中海国家比较常见 目前我国对 KSHV 的研究才开始不久, 有研 [7] 究表明新疆地区经典型 KS 的发病率较高, 而其他地区和民族的 KS 病例则比较罕见 KS 是一种在感染 AIDS 患者中常见的肿瘤, 致病机制很复杂 [4] KSHV 的研究已经有不少报道如 ORFK8.1 基因 ORFK73 基因 [1,8 10] 针对于 KSHV 编码的蛋白可以分为潜伏感染相关蛋白和裂解感染相关蛋白 [11] 笔者通过 PCR 技术 ELISA 法和 Werstenblot [1] 法构建含有目的基因的 T 载体和 PQE 80L 表达载体并检测了重组蛋白与血清抗体反应情况 利用 KSHVORF65 ORF73 和 ORFK8.1 蛋白为抗原从蚌埠地区普通人群血清中筛查出阳性血清和阴性血清各 32 份 以 ORFK12 蛋白为抗原, 用 ELISA 法筛查此 64 份血清, 待测样品 OD 值高于 Cut Of 值则判定为阳性, 结果在 32 份经 KSHVORF65 ORF73 和 ORFK8.1 蛋白为抗原筛查出的阳性血清中有 10 份的阳性血清 OD 值高于 Cut Of 值即有反应, 其中有 22 份没有反应, 即用 ORFK12 基因表达的蛋白从普
568 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 通人群中筛选出 KSHV 阳性血清明显有漏检情况 [7], 说明 ORFK12 蛋白为抗原 ELISA 法筛查普通人群 KSHV 感染的灵敏度低 而经 KSHVORF65 ORF73 和 ORFK8.1 蛋白为抗原筛查出的 32 份阴性血清 OD 值都低于 Cut Of 值, 这说明 ORFK12 蛋白为抗原的 ELISA 法筛查普通人群感染 KSHV 特异性很强 ORFK12 蛋白虽然用于流行病调查存在一定的局限性, 不足以用于 KSHV 的检测, 但可以作为辅助检查, 因为其 ELISA 的特异性良好 ORFK12 [12] 基因编码的蛋白是潜伏期感染相关蛋白, 有研究 表明 ORFK12 基因是诱导肿瘤形成的基因, 卡波齐蛋白在 90% 艾滋病患者的 KS 中都表达,KSHVK12 的表达对于 KS 发病具有较强的特异性 该研究通过验证 ORFK12 基因能够成功表达 ORFK12 蛋白, 而且确定该蛋白与血清相应抗体有反应, 为 KSHV 致病机制的研究提供了一定依据 参考文献 [1] OuyangXX,FuB,LiB,etal.EstablishmentofanELISAto detectkaposi ssarcoma asociatedherpesvirususingrecombinant ORF73[J].VirolSin,2010,25(3):168-76. [2] FahadAS.Prevalenceofhumanherpesvirus 8(HHV 8)inun treatedpatientswithearlystagemycosisfungoides(aretrospective study)[j].intjhealthsci(qasim),2010,4(2):128-38. [3] WenK W,DamaniaB.Kaposisarcoma asociatedherpesvirus (KSHV):molecularbiologyandoncogenesis[J].CancerLet, 2010,289(2):140-50. [4] MuralidharS,PumferyAM,HasaniM,etal.Identificationof kaposin(openreadingframek12)asahumanherpesvirus8(ka posi ssarcoma asociatedherpesvirus)transforminggene[j].j Virol,1998,72(6):4980-8. [5] 南玉龙, 谭晓华, 杨磊.KSHV 潜伏和裂解感染机制的研究进展 [J]. 中国医学创新,2012,9(3):151-4. [6] CaratalàJ,MontejoM,Pérez RomeroP.Infectionscausedby herpesvirusesotherthancytomegalovirusinsolidorgantransplant recipients[j].enferminfeccmicrobiolclin,2012,30suppl2: 63-9. [7] 张莹, 曾宪聪, 汪小五, 等. 安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的血清阳性率研究 [J]. 安徽医科大学学报,2013, 48(5):493-5. [8] FuB,LiB,OuyangXX,etal.ExpresionofKaposi ssarcoma asociatedherpesvirusorfk8.1anditspreliminarydiagnosticap plication[j].virolsin,2009,24(3):202-8. [9] RaduO,PantanowitzL.Kaposisarcoma[J].Archivesofpatholo gy&laboratorymedicine,2013,137(2):289-94. [10] WolzMM,ScialisGF,PitelkowMR.Humanherpesviruses6, 7,and8from adermatologicperspective[j].mayoclinicproc, 2012,87(10):1004-14. [11] 周晓斐, 杨磊, 曾妍. 人类 8 型疱疹病毒的研究进展 [J]. 中国生物工程杂志,2007,27(3):110-4. [12] 唐桂霞, 卢春, 曾怡. 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 K12 基因诱导裸鼠体内肿瘤的形成 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2005,25(6):507-13. PreliminarystudyofKaposi ssarcoma asociated herpesvirusorfk12protein WangXiaowu,ZengXiancong,ChenWei,etal (DeptofMicrobiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei 230032) Abstract Objective TostudytheexpresionofORFK12geneofKSHVinE.coliandobtainKSHVseropreva lenceinthegeneralpopulationinusingtheexpresedprotein.methods Apairofprimerswasdesignedtoamplify ORFK12genebyPCR,usingthetotalDNAofBCBL 1celsastemplate.Recombinantplasmidwiththetarget genewasnamedpqe 80L K12andinducedtoexpres.Inthisstudy,antibodiestooneproteinofKSHV (ORFK12)weretestedbyindirectELISAandWesternblot.Results AfterusingIPTGtoinduceexpres,PQE 80L K12recombinantbacteriahadafusionof10KuproteinbySDS PAGEelectrophoresis.10specimenswere tested.conclusion ItispreliminarilyprovedthatKSHVORFK12genecanexpresinE.coli,andORFK12pro teininfectionkshvplayscertainsupplementaryroleinlaboratorytests. Keywords Kaposi ssarcoma asociatedherpesvirus;orfk12gene;orfk12protein
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 569 缺血预处理对大鼠肢体缺血再灌注损伤保护效应的实验研究 司小毛 1,2, 仇鹏 1, 朱化刚 1, 余康敏 1, 查斌山 1, 谢文涛 1 1, 李俊 摘要目的探讨缺血预处理不同时间方案对肢体缺血再灌注损伤保护作用的差异性, 选择合理的缺血预处理时间 方法 40 只 SPF 级 SD 大鼠随机分成 5 组 : 假手术组 (A 组, 仅行开腹, 分离腹主动脉不阻断 ); 缺血再灌注组 (B 组, 夹闭腹主动脉缺血 2h 后再灌注 2h);C D E 组 : 分别阻断腹主动脉 1 5 和 10min, 再灌注 1 5 和 10min, 重复 3 个循环后进行 2h 缺血 2h 再灌注 测定血清超氧化物歧化酶 (SOD) 丙二醛 (MDA) 白细胞介素 6(IL 6) 肿瘤坏死因子 α(tnf α) 白细胞介素 10(IL 10) 水平, 观察各组氧化 / 抗氧化指标及炎症因子表达的差异性 结果 D 组 SOD 活性升高 MDA 含量下降, 与 B 组比较差异有统计学意义 (P<0 05); E 组改变更明显, 和 D 组比较差异有统计学意义 (P< 0 05) 与 B 组比较,C D E 组的 IL 6 TNF α 明显升高, 差异均有统计学意义 (P<0 05);E 组的各炎症因子水平最高, 与 C 组比较差异均有统计学意义 (P<0 05) 结论预缺血时间与氧化损伤的保护作用在一定时间窗内呈平行关系, 预缺血并无明显抗炎作用, 过长时间预缺血甚至能导致全身性炎症反应 ;5min/3 个循环缺血预处理方案较为适宜 关键词 中图分类号 大鼠 ; 肢体 ; 缺血再灌注 ; 缺血预处理 ; 保护机制 R364.12;R364.5;R543.5 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2014)05-0569-03 缺血预处理 (ischemiapreconditioning,iprc) 是指在长时间缺血前对组织器官实施多次短暂的缺血来提高组织缺血耐受性 延缓或减轻随后再灌注引起损伤的方法 自 Muryetal [1] 提出此概念以来, 有关 IprC 时间和保护效应之间关系的研究甚少 该研究拟观察不同时间策略 IprC 后血清超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase,sod) 丙二醛 (malon aldehyde,mda) 白细胞介素 6(interleukin 6,IL 6) 肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactor α,tnf α) 白细胞介素 10(interleukin 10,IL 10) 等水平的变化, 从抗氧化损伤和炎症反应角度研究不同 IprC 时间下保护作用的差异性, 探讨相对合理的 IprC 时间, 2014-02-17 接收基金项目 : 安徽省卫生厅医学科研项目 ( 编号 :2010B17) 作者单位 : 1 安徽医科大学第一附属医院血管外科, 合肥 230022 2 安徽省南陵县中医院普外科, 南陵 241300 作者简介 : 司小毛, 男, 医师, 硕士研究生 ; 朱化刚, 男, 教授, 主任医师, 硕士生导师, 责任作者,E mail:huagzhu@yeah.net 为临床开展 IprC 提供理论依据 1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 40 只成年健康 SPF 级 SD 大鼠, 购自安徽医科大学实验动物中心, 体重 220~ 250g, 雌雄不限, 随机均分成 5 组, 正常对照组 (A 组 ): 仅行开腹, 分离腹主动脉不夹闭 ; 缺血再灌注组 (B 组 ): 夹闭腹主动脉缺血 2h 后再灌注 2h;1 min/3 个循环预处理组 (C 组 ):1min 阻断 1min 灌注交替共 3 个循环, 然后正式阻断 2h 再灌注 2h;5 min/3 个循环预处理组 (D 组 ) 和 10min/3 个循环预处理组 (E 组 ), 方法均同 C 组, 间隔时间改为 5 min 和 10min 1.2 主要试剂 SOD MDA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所 ;IL 6 TNF α IL 10ELISA 检测试剂盒购自武汉新启迪生物科技有限公司 1.3 动物模型制备术前禁食 12h, 禁水 2h 腹腔 10% 水合氯醛麻醉后经尾静脉留置套管针 开腹分离腹主动脉, 在肠系膜下动脉与双髂分岔间用管夹阻断腹主动脉 2h, 复通 2h 为缺血再灌注损伤模型 实验过程关闭腹腔, 以微量输液泵经尾静脉持续补液 (8ml/kg) 1.4 动物处理及标本采集各组均在最终恢复血循环后经下腔静脉采血 4~5ml, 血标本放入普通冰箱冷藏静置 30min 后 3000r/min 离心 15min, 取上清液, 装入 EP 管并标记,-80 保存待测 1.5 指标检测 1.5.1 血清 SOD MDA 检测采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法测定 MDA 浓度, 黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 活性, 实验操作严格参照试剂盒说明书进行 1.5.2 血清 IL 6 TNF α IL 10 浓度检测使用双抗体一步夹心酶联免疫吸附试验法 (ELISA), 用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度 (OD) 值, 通过标准曲线计算各标本的 IL 6 TNF α IL 10 浓度 实验操作严格参照试剂盒说明书进行 1.6 统计学处理采用 SPSS19 0 统计软件进行分析, 计量资料以 x±s 珋表示, 所有分组均进行 K S 检验 方差齐性检验, 组间两两比较采用 LSD 法单因素方差分析
570 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 2 结果 2.1 各组血清 SOD 和 MDA 的比较与 A 组比较,B 组的 SOD 活力下降,MDA 含量升高, 差异有统计学意义 (P<0 05); 与 B 组比较,C D E 组的 SOD 活力升高,MDA 含量下降, 其中 C 组差异无统计学意义 (P>0 05),D E 组差异有统计学意义 (P <0 05);C D E 组进行组间比较,E 组的 SOD 活力最高 MDA 含量最低, 各组差异有统计学意义 (P< 0 05), 见表 1 表 1 各组血清 SOD 和 MDA 比较 (n=8, x±s) 珋 组别 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) A 105.14±11.89 2.79±0.21 B 56.02±7.87 # 4.32±0.22 # C 60.27±9.16 # 4.16±0.22 # D 71.92±10.33 # 3.77±0.15 # E 74.99±12.62 # 3.62±0.13 # 与 A 组比较 : # P<0.05; 与 B 组比较 : P<0.05; 与 C 组比 较 : P<0.05; 与 D 组比较 : P<0.05 2.2 各组 IL 6 TNF α IL 10 的比较与 A 组比较,B 组的 IL 6 TNF α IL 10 水平升高, 差异均有统计学意义 (P<0 05); 与 B 组比较,C D E 组的 IL 6 TNF α 明显升高, 差异均有统计学意义 (P< 0 05);C D E 进行组间比较, 各数值均呈递增趋势,IL 6 水平 D 组和 C 组比较 E 组和 D 组比较差异均无统计学意义 (P>0 05) D 组和 C 组 TNF α 水平比较, 差异无统计学意义 (P>0 05),E 组和 D 组比较, 差异有统计学意义 (P<0 05) IL 10 水平各组间差异均有统计学意义 (P<0 05), 见表 2 表 2 各组血清 IL 6 TNF α IL 10 水平比较 (n=8,ng/l, x±s) 珋 组别 IL 6 TNF α IL 10 A 66.66±9.79 113.66±10.20 94.57±11.91 B 94.31±8.40 # 170.32±10.87 # 121.45±12.31 # C 108.05±11.80 # 185.67±15.38 # 127.93±13.82 # D 113.90±7.02 # 191.50±11.86 # 140.68±10.82 # E 118.59±9.20 # 204.48±10.74 # 156.24±11.56 # 与 A 组比较 : # P<0.05; 与 B 组比较 : P<0.05; 与 C 组比较 : P<0 05; 与 D 组比较 : P<0.05 3 讨论在心血管外科领域中, 如腹主动脉及髂动脉瘤人工血管置换 建立体外循环的心脏手术, 动脉栓塞取栓 动脉闭塞性疾病行旁路手术等众多情况, 机体 都将不可避免的要遭受缺血再灌注损伤 (ischemia reperfusioninjury,iri), 若控制不良还会带来全身炎症反应综合征 (systemicinflammatoryresponsesyn drome,sirs) 及多器官功能障碍综合征 (multipleor gansdysfunctionsyndrome,mods) 等后果 缺血再灌注过程中产生大量活性氧 (reactiveoxygenspe cies,ros) 攻击生物膜导致脂质过氧化, 其产物 MDA 水平的高低间接反映了 ROS 对细胞的损伤程度 生理状态下的 ROS 能被以 SOD 为主的抗氧化系统所清除, 当 ROS 超过机体的清除能力后即出现脂质过氧化增强 抗氧化能力减弱的失衡状态, 监测 MDA 和 SOD 判断机体的氧化与抗氧化状态 此外, 缺血会释放多种炎症细胞因子, 其中 IL 6 和 TNF α 是早期释放的重要致炎因子, 而 IL 10 是有代表性的抑炎因子 [2] [3-5] 有研究显示 IprC 是减轻缺血再灌注损伤的有效措施, 众多学者探索其保护机制, 认为和减轻脂质过氧化 抑制细胞凋亡 增加内源性腺苷释放 激活蛋白激酶 C 调控细胞凋亡 开放线粒体 K ATP 通道 维持靶缺血肌肉组织的糖原储备 增加缺氧状态下的无氧酵解等因素有关 现行下肢 IprC 的方法主要有腹主动脉下端预阻断 髂动脉预阻断 股动脉预阻断 下肢无创止血带预阻断等, 阻断策略不一, 缺乏统一标准 IprC 的保护效应有早期保护和延迟保护两个时间窗, 早期保护持续时间在预缺血的 1~2h 内, 起主要作用 延迟保护在 24~72h, 又称 第二窗口保护期, 两个时相保护机制有所不同 [6], 也间接表明长时间的 IprC 可能无益 本研究显示,5min/3 个循环 IprC 能明显增强 SOD 活性, 并降低 MDA 水平, 发挥了很好的清除氧自由基 抗氧化作用,10min/3 个循环时更明显, 由此观察预缺血时间对下肢氧化损伤的保护作用呈递增趋势, 但炎症因子在 10min/3 个循环 IprC 时最高, 过长时间的预缺血导致了炎症因子的蓄积, 这可 [7] 能抵消了 IprC 的预期保护效果 戚炜认为短时间 (5~15min/3 个循环 ) 的 IprC 可一定程度降低氧自由基水平, 减轻缺血再灌注损伤, 而 20min/3 个循环以上的 IprC 则无此作用 也有学者提出 IprC 可能通过降低机体的炎症反应途径达到心肌细胞保护的效果 [8], 这与 IprC 促进了 IL 10 的释放发挥了一定的抑制炎症作用有关, 和本研究结果不矛盾 提示小于 5min/3 个循环的 IprC 可能有一定程度的抗炎作用, 长时间 IprC 后 IL 10 的升高不足以抑制 IL 6 TNF α 等致炎因子的过度表达, 抗炎作用并不
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 571 明显 IprC 虽已被认为能减轻机体缺血再灌注损伤, 但 IprC 的过程中会潜在的伴随着炎症反应和其他损害的发生, 过长时间的 IprC 会增加负面效应 本研究阐释的 IprC 保护机制主要来自其抗氧化清除氧自由基的作用, 虽有一定程度抑制性炎症因子的释放, 但不足以减轻术后的炎症反应 IprC 时间长短直接影响了保护效应, 本研究中的 1min/3 个循环抗氧化作用甚微,5min/3 个循环的 IprC 发挥了显著抗氧化保护效应,10min/3 个循环虽然作用更优, 但是长时间的 IprC 导致机体 IL 6 TNF α 等致炎因子大量蓄积, 加重了炎症反应, 增加了术后发生 SIRS 的风险 本研究不足之处在于未能进行组织病理学分析,IprC 作为一项新兴的预保护措施需更多的研究来证实其可靠性, 临床应全面权衡缺血预处理保护作用及其潜在的负面影响而进行合理运用 参考文献 [1] MuryCE,JenningsRB,ReimerKA.Preconditioningwithis chemia:adelayoflethalcelinjuryinischemicmyocardium[j]. Circulation,1986,74(5):1124-36. [2] SaxenaP,AggarwalS,MisoNL,etal.Remoteischaemicpre conditioningdown regulateskininreceptorexpresioninneutro philsofpatientsundergoingheartsurgery[j].interactcardiovasc ThoracSurg,2013,17(4):653-8. [3] OlgunerCG,KocaU,AltekinE,etal.Ischemicpreconditioning atenuateslipidperoxidationandapoptosisinthececalligationand puncturemodelofsepsis[j].expthermed,2013,5(6):1581-8. [4] MosesM A,AddisonPD,NeliganPC,etal.Mitochondrial KATPchannelsinhindlimbremoteischemicpreconditioningof skeletalmuscleagainstinfarction[j].am JPhysiolHeartCirc Physiol,2005,288(2):H559-67. [5] LintzJA,DalioM B,JovilianoEE,etal.Ischemicpreand postconditioninginskeletalmuscleinjuryproducedbyischemia andreperfusioninrats[j].actacirbras,2013,28(6):441-6. [6] HausenloyDJ,YelonDM.Thesecondwindowofprecondition ing(swop)wherearewenow?[j].cardiovascdrugsther, 2010,24(3):235-54. [7] 戚炜. 缺血预处理时间对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用的影响 [J]. 中国修复重建外科杂志,2005,19(4):274-7. [8] 唐白云, 陈光献, 刘喜利, 等. 缺血预处理通过抑制炎症反应保护心肌细胞的研究 [J]. 中华实验外科杂志,2008,25 (12):1618-20. Asociationbetweenischemicpreconditioningtimeandtheprotective efectsofhindlimbischemia/reperfusioninjuryinrats SiXiaomao 1,2,QiuPeng 1,ZhuHuagang 1,etal ( 1 DeptofVascularSurgery,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity, Hefei 230022; 2 TheTCM HospitalofNanlingCountyWuhuCity,Nanling 241300) Abstract Objective Toinvestigatetherelationshipbetweendiferentischemicpreconditioningprotocolsandthe protectiveefectsofhindlimbischemia/reperfusioninjuryinratsinpurposeofchoosinganoptimalischemicpre conditioningscheme.methods Anexperimentalstudywasdesignedusing40SDratsdividedinfivegroups(n= 8).GroupA:thesham group,laparotomyandseparatingtheabdominalaortawithoutclampingfor240minutes (min).groupb:ischemia/reperfusion,ratssubmitedtoischemiafor120minandreperfusionfor120min.group C,DandE:animalssubmitedtothreecyclesofclampingandreleasingtheaortafor1,5and10minrespectively beforebeingsubmitedtotheischemia/reperfusionprocedure;theoxidativedamage,inflammatoryandprotective efectsamongfivegroupswereevaluatedbymeasuringserumlevelsofsod,mda,il 6,TNF α,il 10.Results ComparedwithgroupB,SODactivitiesweresignificantlyhigheringroupD(P<0 05),SODactivitiesweresig nificantlyhigheringroupecomparedwithgroupd(p<0 05).ComparedwithgroupB,thelevelofIL 6,TNF αincreasedobviouslyingroupc,d,e(p<0 05).IL 6,TNF α,il 10wasthehighestingroupEamongfive groups(p<0 05).Conclusion Therelationshipbetweenischemiapreconditioningtimeandanti oxidationin hindlimbischemia/reperfusioninjuryseemsparaleled.theinflammatoryresponseaccompaniedwiththeischemia preconditioningbecomesseriouswithischemiatimeprolonging.preconditioningdoesn tshowanti inflammatory efect.fivemin/threecirculationischemiapreconditioningschemeisanoptimalprotocol. Keywords rats;hindlimb;ischemia/reperfusion;ischemicpreconditioning;protectivemechanism
572 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 骨髓间充质干细胞对大鼠肺气肿模型治疗机制的探讨 王丽雁, 吴 倩, 王叶芳, 汪伟民 摘要目的通过研究骨髓间充质干细胞 (BMSC) 对大鼠肺气肿模型血清和肺泡灌洗液 (BALF) 中白介素 17(IL 17) 白介素 6(IL 6) 的影响以及肺组织病理学变化, 探讨 BMSC 对慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 的干预机制 方法 30 只健康雄性 SD 大鼠, 随机分成 3 组 : 正常对照组 肺气肿模型组 BMSC 治疗组 通过气管内注射猪胰蛋白酶诱导建立肺气肿模型后, 经大鼠尾静脉注射 BMSC 进行治疗 两周后处死大鼠, 观察肺组织病理学变化及血清和 BALF 中白细胞总数 中性粒细胞和淋巴细胞百分比 使用 ELISA 方法检测血清和 BALF 中 IL 17 IL 6 水平 结果与正常对照组相比, 肺气肿模型组和 BMSC 治疗组 BALF 中白细胞总数 中性粒细胞和淋巴细胞的百分比升高 (P<0 05),BMSC 治疗组较肺气肿模型组显著降低 (P<0 05);ELISA 法结果显示肺气肿模型组和 BMSC 治疗组血清和 BALF 中 IL 17 IL 6 水平较正常对照组显著升高,BMSC 治疗组明显低于肺气肿模型组 (P<0 05); 病理观察肺气肿模型组和 BMSC 治疗组都可看到气肿样改变,BMSC 治疗组与肺气肿模型组比较肺组织平均内衬间隔 (MLI) 降低, 单位面积平均肺泡数 (MAN) 增加 (P<0 05) 结论 BMSC 可能通过调节炎细胞的增殖及趋化来干预 IL 17 IL 6 表达, 以及促进受损肺组织的修复, 来发挥对 COPD 的干预作用 关键词慢性阻塞性肺疾病 ; 骨髓间充质干细胞 ; 白介素 17; 白介素 6 中图分类号 R563.3;R392.4;R392.114 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2014)05-0572-05 慢性阻塞性肺疾病 (chronicobstructivepulmona rydisease,copd) 的发病与气道慢性炎症及自身免疫异常有关, 患者体内及气道局部存在大量炎细胞和炎性介质, 如白介素 (interleukin,il) 17 IL 6 IL 17 诱导多种趋化因子的分泌, 引起气道和肺组织的损伤 IL 6 促进中性粒细胞氧化和诱导淋巴细胞分泌抗体, 延迟炎细胞凋亡, 加重气道炎症反应 研 [1] 究表明, 骨髓间充质干细胞 (bonemesenchymal stemcels,bmsc) 可以通过全骨髓贴壁法获得, 且经 2014-03-25 接收基金项目 : 安徽省教育厅自然科学基金 ( 编号 :KJ2009A118) 作者单位 : 安徽医科大学第一附属医院老年呼吸内科, 合肥 230022 作者简介 : 王丽雁, 女, 硕士研究生 ; 汪伟民, 男, 主任医师, 硕士生导师, 责任作者,E mail: wangwm7@tom.com 此方法获得的细胞稳定性和活力佳, 分化潜能与安全性良好 该实验通过将 BMSC 经尾静脉注入大鼠肺气肿模型体内, 观察 BMSC 对肺气肿模型肺组织的修复以及对炎症因子 IL 17 IL 6 的调节作用, 初步探讨 BMSC 对 COPD 的干预机制 1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂 SPF 级健康雄性 SD 大鼠 33 只, 含 3 只体重 80~100g 的幼鼠, 余大鼠体重 180~220g, 由安徽医科大学实验动物中心提供 ; 猪胰蛋白酶 (porcinepancreaticelastase,ppe) 购自美国罗氏公司 ; 胰酶 胎牛血清 L DMEM 培养基购自美国 HyClone 公司 ; 大鼠 IL 6 IL 17 酶联免疫吸附法 (ELISA) 试剂盒购自美国 R&D 公司 1.2 BMSC 的采集 分离与培养选择 3 只 4 周体重 80~100g 的雄性 SD 大鼠, 脱臼处死后,75% 乙醇溶液浸泡 10min 后, 于超净工作台无菌分离双侧股骨, 剪去包括骺板在内的两侧骺端, 用 DMEM 液反复冲洗骨髓腔, 收集骨髓 将获得的骨髓细胞悬浮液移入离心管,2000r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液 (10%FBS, 100U/ml 青霉素,100U/ml 链霉素 ) 重悬, 接种于 25cm 2 的塑料培养瓶, 置于 37 5% CO 2 培养箱内培养 48h 半量换液一次, 去除未贴壁细胞, 倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态特征 以后每 3d 换液一次 当细胞铺满瓶底约 80% 时, 用 0 25% 胰蛋白酶 37 消化 3min, 待细胞形态由梭形变为圆形后, 停止消化, 按 1 2 传代培养 1.3 大鼠肺气肿模型的制备 实验分组及处理 30 只雄性健康 SD 大鼠适应性饲养 1 周后, 随机分为 3 组 : 正常对照组 肺气肿模型组 BMSC 治疗组, 每组各 10 只 将肺气肿模型组和 BMSC 治疗组大鼠分别称体重后, 用体积分数为 10% 的水合氯醛 (300 mg/kg) 腹腔内注射麻醉后, 将大鼠固定于操作台上, 常规消毒, 纵向切开颈部皮肤, 钝性分离皮下组织及胸骨舌骨肌, 暴露气管,4 号针头刺入气管内一次性滴入配制的 PPE 生理盐水溶液 1U/g, 并注入少量空气保证试剂或生理盐水全部进入气管, 缝合皮肤, 切口消毒, 然后直立旋转大鼠, 并按摩双侧胸
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 573 部, 使试剂均匀分布于双侧肺 正常对照组依同样方法注入等体重比量的磷酸盐缓冲液 (phosphate buferedsaline,pbs) 将鼠放入独立盒中, 注意保温, 等清醒后放入原盒中, 以普通饲料喂养 12 周后 待大鼠肺气肿模型成功后,BMSC 治疗组大鼠经尾静脉注入浓度为 1 10 6 个 /ml 的第 3 代 BMSC1 ml, 正常对照组及肺气肿模型组给予等量 PBS 处理, 各组继续饲养 2 周后处死所有大鼠 1.4 肺泡灌洗液 (bronchoalveolarlavagefluid, BALF) 细胞计数及 IL 17 IL 6 水平检测大鼠称重 腹腔麻醉后固定, 无菌条件腹主动脉取血, 标本室温下静止 2h 后,3000r/min 离心 5min, 收集血清, 分装储存于 -80 备用 暴露气管和肺门, 于右主支管处结扎右肺, 生理盐水 2ml 3 次行左肺肺泡灌洗, 回收的 BALF 存入硅塑管内, 以 1500r/ min 离心 10min, 取上清液冻存 -80 备用 同时收集细胞并计算中性粒细胞和淋巴细胞百分率 按 ELISA 试剂盒说明书检测血清和 BALF 中 IL 17 IL 6 的浓度 1.5 肺组织标本的留取肺泡灌洗完毕后弃左肺, 切取右侧肺组织, 置于 4 PBS 中洗去血液 所有大鼠取右肺组织浸入 10% 福尔马林液中固定 24h, 制备蜡块 1.6 肺组织病理学观察各组大鼠肺组织切片行 HE 染色作常规病理学检查 每例标本选 2 张切片, 每切片随机取上 下 左 右 中 5 个视野, 测量时尽量避开支气管及大 中血管 观察肺平均内衬间隔 (meanlinearintercept,mli) 和单位面积平均肺泡数 (meanalveolarnumbers,man) 每只大鼠检测 10 个区域 1.7 统计学处理采用 SPSS13 0 统计软件分析, 数据以 x±s 珋表示, 组间比较采用方差分析及 SNK 检验 2 结果 2.1 BMSC 的培养原代培养 24h 后, 可见少量贴壁细胞, 细胞大小及形态不均一, 呈圆形或内皮细胞样 ; 培养 48h 半量换液, 去除未贴壁的细胞, 此时细胞开始融合, 在集落中心密集, 且集落间出现重叠, 见图 1A; 约 7d 细胞融合达 80% 以上, 传代后细胞呈均匀分布的长梭形生长, 平行或螺旋状排列, 见图 1B 本实验通过全骨髓贴壁法获得 BMSC 2.2 血清和 BALF 细胞计数肺气肿模型组 BM SC 治疗组血清和 BALF 中白细胞总数 中性粒细胞 图 1 体外培养 BMSC 的形态学观察 200 A: 原代细胞 ;B: 第 3 代细胞 和淋巴细胞百分比显著高于正常对照组 (P< 0 01) BMSC 治疗组大鼠 BALF 中白细胞总数 中性粒细胞和淋巴细胞百分比均低于肺气肺模型组 (P<0 05), 见表 1 2.3 血清及 BALF 中 IL 17 IL 6 水平 ELISA 结果显示 : 肺气肿模型组与正常对照组比较,BALF 和血清中 IL 17 IL 6 水平均明显升高 (P<0 01); 且 BMSC 治疗组与肺气肿模型组比较,BALF 中 IL 17 IL 6 水平均下降 (P<0 05), 见表 2 表 1 3 组大鼠 BALF 中细胞计数及分类 (n=10, x±s) 珋白细胞总数中性粒细胞淋巴细胞组别 ( 10 9 /L) 百分比 (%) 百分比 (%) 正常对照 2.41±0.68 7.96±3.7 6.42±1.45 肺气肿模型 5.33±0.57 24.01±4.91 12.50±2.39 BMSC 治疗 3.73±0.77 Δ 15.32±2.27 Δ 8.23±1.54 Δ 与正常对照组比较 : P<0.01; 与肺气肿模型组比较 : Δ P< 0 05 表 2 3 组大鼠 BALF 和血清中的 IL 17 和 IL 6 水平 (ng/l,n=10, x±s) 珋血清 BALF 组别 IL 17 IL 6 IL 17 IL 6 正常对照 41.31±3.12 11.64±0.89 54.61±4.12 15.89±1.52 肺气肿模型 60.50±5.24 23.22±1.42 72.42±4.48 32.12±2.23 BMSC 治疗 50.60±3.62 Δ 17.24±3.04 Δ 60.83±3.76 Δ 24.14±3.42 Δ 与正常对照组比较 : P<0.01; 与肺气肿模型组比较 : Δ P<0.05 2.4 大鼠肺组织病理学结果正常对照组大鼠肺组织肉眼观表面光滑淡红色, 质地较软, 且富有弹性, 指压无痕, 镜下见肺组织均匀一致 肺气肿模型组大鼠肺脏肉眼见肺组织体积增大表面有囊泡状突起, 色泽苍白, 质地较硬且弹性差, 指压后见压痕, 切面可见肺组织形态大小不均一 HE 染色结果显示 : 除正常对照组以外, 肺气肿模型组和 BMSC 治疗组的肺组织均出现肺泡壁不同程度的变薄, 部分断裂, 肺泡腔扩大 BMSC 治疗组较肺气肿模型组肺
574 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 气肿明显减轻, 见图 2 单位面积内, 肺气肿模型组和 BMSC 治疗组的 MAN 小于正常对照组, 而 MLI 大于正常对照组 (P<0 05);BMSC 治疗组与肺气肿模型组相比,MAN 大于肺气肿模型组,MLI 小于肺气肿模型组 (P<0 05), 见表 3 图 2 大鼠肺组织病理学结果 200 A: 正常对照组 ;B: 肺气肿模型组 ;C:BMSC 治疗组 表 3 3 组大鼠肺组织病理学比较 (n=10, x±s) 珋 组别 MLI(μm) MAN( 个 /10 2 mm) 正常对照 40.38±3.14 4.73±1.01 肺气肿模型 50.88±2.34 2.28±0.89 BMSC 治疗 45.63±1.60 Δ 3.90±0.62 Δ 与正常对照组比较 : P<0.05; 与肺气肿模型组比较 : Δ P<0.05 3 讨论 COPD 的发病与机体肺组织接触有害气体和微小颗粒引起的异常炎症反应有关 吸烟是 COPD 主要的危险因素, 但也只有 20% ~30% 的吸烟者最终发展为 COPD [2], 这些人共同的特点是具有严重的气道炎性反应, 最重要的是在停止吸烟的情况下, 这种炎症反应不会因此停止 Agustietal [3] 首先提出 COPD 存在自身免疫应答假说 目前认为,COPD 是由 T 淋巴细胞参与的慢性炎症反应和自身免疫反应所引起的疾病 IL 17 是由 T 淋巴细胞及多种细胞分泌的一类 [4-5] 炎性介质 研究表明,COPD 患者呼吸道 IL 17A/F 的表达是上调的, 且 IL 17A 基因缺失将会降低香烟烟雾引起的炎症和肺泡 Ⅱ 型细胞凋亡 IL 17 诱导呼吸道上皮细胞分泌中性粒细胞趋化因子 IL 8, 增强 ICAM 1 表达促进炎细胞的活化及黏 附, 使支气管上皮细胞变性 坏死 脱落, 黏液分泌亢进, 纤毛运动减退, 炎症反复发作迁延不愈 另外, IL 17 诱导中性粒细和肺泡巨噬细胞释放弹性蛋白酶, 造成肺泡壁的断裂, 肺大泡形成 本实验中肺气肿模型组血清与 BALF 中 IL 17 浓度较正常对照组明显增高,BMSC 干预后 IL 17 水平的降低, 表明 IL 17 与 COPD 形成过程有着密切联系 IL 6 是由淋巴细胞 单核 / 巨噬细胞等多种细胞产生的炎性介质 IL 6 水平升高是 COPD 急性加重期的一个重要特征 [6-7], 与小气道的炎症严重程度有关, 且 IL 6 降低肺功能 [8] IL 6 促进 B 细胞的分化及分泌抗体, 使中性粒细胞氧化延缓凋亡, 增加炎细胞的黏附作用及细胞外蛋白酶的活性 本研究结果显示, 肺气肿模型组血清及 BALF 中 IL 6 的显著增高, 与以往的研究相同, 表明 IL 6 与 COPD 发生发展有相关性 [1] 研究表明通过全骨髓贴壁法可以获得 BM SC Weisetal [9] 对接受 BMSC 治疗的 COPD 患者进行为期 2 年的随访, 结果显示 BMSC 对 COPD 的治疗具有安全性 BMSC 分化为气道上皮细胞和肺泡 Ⅱ 型细胞修复受损的肺组织, 分泌各类生长因子诱导细胞增生, 增加肺小动脉的数量, 缓解肺动脉高压和减轻肺血管的重塑 [10] ;BMSC 作为免疫调节细胞, 减轻肺局部异常免疫反应, 从而为损伤肺组织的 [11-12] 修复提供有利环境 体外实验表明,BMSC 和 T 淋巴细胞共培养, 可抑制淋巴细胞 NK 细胞的增殖, 降低其分泌的炎性介质水平, 从而减轻局部的炎症反应 [13] 研究表明, 用熏烟和注射胰蛋白酶两种方法诱导的肺气肿模型病理学特点和血液中的 IL 17 无明显差异 本研究通过气管内注入 PPE 诱导 COPD 模型, 病理学观察肺气肿模型组和 BMSC 治疗组肺组织均出现肺泡壁变薄, 部分断裂, 肺泡腔扩大 肺气肿模型组 BALF 中白细胞总数 中性粒细胞和淋巴细胞百分比均有不同程度增高, 表明中性粒细胞和淋巴细胞在 COPD 患者气道及肺泡局部聚集 肺气肿模型组血液和 BALF 中的 IL 17 IL 6 较正常组对照组明显升高, 经 BMSC 干预后降低, 表明 BMSC 可能是通过抑制淋巴细胞和中性粒细胞等炎症细胞产生 IL 17 IL 6, 从而抑制 COPD 的慢性炎症反应 本研究显示,BMSC 干预后 MAN 较肺气肿模型组增大,MLI 减小, 表明 BMSC 对肺小叶有修复作用 但这种对肺小叶的修复机制是通过抑制局部炎性反应, 还是通过 BMSC 的定向分化为肺泡上皮产生, 亦
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 575 或两者的协同作用, 尚需进一步研究证实 而 BM SC 对 COPD 的进展发挥了明显的干预作用却是显而易见的 综上所述, 由于肺组织的特殊结构促使 BMSC 能够高比例的定植于受损的肺组织,BMSC 对 COPD 的治疗作用可能是通过抑制炎性细胞的增殖分化, 调节炎细胞和炎症介质水平来减少肺组织的损害 这将为临床探索治疗 COPD 的新方法提供重要参考 参考文献 [1] 宋小莲, 白冲. 骨髓间充质干细胞移植对慢性阻塞性肺病气道及肺实质损伤的修复作用 [D]. 上海 : 第二军医大学,2009. [2] KohansalR,SorianoJB,AgustiA.Investigatingthenaturalhistory oflungfunction:facts,pitfals,andopportunities[j].chest, 2009,135(5):1330-41. [3] AgustiA,MacneeW,DonaldsonK,etal.Hypothesis:doesCOPD haveanautoimmunecomponent?[j].thorax,2003,58(10):832-4. [4] ChangY,NadigelJ,BoulaisN,etal.CD8positiveTcelsexpres IL 17inpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease[J]. Respiratoryresearch,2011,12(1):43. [5] ChangY,Al AlwanL,AuduseauS.GeneticdeletionofIL 17Are ducescigaretesmoke inducedinflammationandalveolartype I celapoptosis[j].amjphysiollungcelmolphysiol,2014,306 (2):132-42. [6] AgustiA,EdwardsLD,RennardSI,etal.Persistentsystemicin flammationisasociatedwithpoorclinicaloutcomesincopd:a novelphenotype[j].plosone,2012,7(5):e37483. [7] RopckeS,HolzO,LauerG.Repeatabilityofandrelationshipbe tweenpotentialcopdbiomarkersinbronchoalveolarlavage,bron chialbiopsies,serum,andinducedsputum[j].plosone,2012,7 (10):e46207. [8] KherbeckN,TambyM C,BusoneG,etal.Theroleofinflamma tionandautoimmunityinthepathophysiologyofpulmonaryarterial hypertension[j].clinrevalergyimmunol,2011,44(1):31-8. [9] WeisDJ,CasaburiR,FlanneryR.APlacebo controledrandom izedtrialofmesenchymalstemcelsinchronicobstructivepulmo narydisease[j].chest,2013,143(6):1590-8. [10]HuhJW,KimSY,LeeJH,etal.Bonemarowcelsrepairciga retesmoke inducedemphysemainrats[j].am JPhysiolLung CelMolPhysiol,2011,301(3):255-66. [11] ProckopDJ.Stemnesdoesnotexplaintherepairofmanytisues bymesenchymalstem/multipotentstromalcels(mcss)[j].clin PharmacolTher,2007,82(3):241-3. [12] StaggJ.Immuneregulationbymesenchymalstemcels:twosides tothecoin[j].tisueantigens,2007,69(1):1-9. [13] 陈辉, 屈晓娜, 吴世满. 豚鼠肺气肿模型肺组织 Foxp3 RORrt 及 IL 17 的表及意义 [J]. 中国呼吸与危重监护杂志,2012,11 (3):223-6. Efectofbonemarrowmesenchymalstem celsoncytokines ofil 17,IL 6inratmodelofemphysema WangLiyan,WuQian,WangYefang,etal (DeptofGeriatricPulmonaryMedicine,TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230022) Abstract Objective ToexplorethemechanismofMSCtreatmentforCOPDbystudyingtheefectofbonemarow mesenchymalstemcelsonil 6andIL 17inBALFandserumofemphysemamodel,aswelaslungpathological changes.methods ThirtyhealthymaleSDratswererandomlydividedinto3groups,normalcontrolgroup,em physemamodelgroup,bmsctreatmentgroup.afterestablishingratmodelsofcopdthroughendotrachealinjection whichinducedinporcinetrypsin,biologicaltreatmentwasgivenbyinjectingbmscviaratcaudalvein.alrats wereexecutedtwoweekslater,observingthepathologicalchangesoflungtisuesandthetotalnumberofwhite bloodcels,thepercentageofneutrophilsandlymphocytesinbalfandserum.usingtheelisamethodtodetect thelevelofil 17andIL 6inserum andbalf.results Comparedwithnormalcontrolgroup,theWBCtotal number,percentageofneutrophilandlymphocyteincreasedinbalfofemphysemamodelgroupandbmsctreat mentgroup(p<0 05),andBMSCtreatmentgroupwassignificantlylowerthanthatinemphysemamodelgroup(P <0 05);ELISAresultsshowedthatthelevelofIL 17,IL 6inserumandBALFofemphysemamodelgroupand BMSCtreatmentgroupwassignificantlyhigherthannormalcontrolgroup,BMSCtreatmentgroupwaslowerthan thatinemphysemamodelgroup(p<0 05).Emphysema likechangescouldbeseeninemphysemamodelgroup andbmsctreatment,comparedwithemphysemamodelgrouptheaveragelungtisuelininginterval(mli)inbm SCtreatmentgroupwasdecreased,whilethemeanalveolarnumber(MAN)perunitareawasincreased,andthe
576 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) tumstatin 基因修饰的 CD34 + 造血干细胞生成抗血管生成活性的血小板 李娟 1, 罗以勤 1, 丁邦胜 1, 贺学姣 1, 周明 2, 赵亮 1 1, 姚丽娟 摘要目的以慢病毒为基因载体, 将 tumstatincdna 导入 CD34 + 造血干细胞, 在体外诱导生成 tumstatin 基因修饰的巨核细胞 (MKs) 和血小板, 检测产生的血小板对血管内皮细胞管状结构形成的作用 方法构建 plvx tumstatin mcmv ZsGreen 重组载体后转染 293T 细胞进行病毒包装 用密度梯度离心法结合免疫磁珠分离法富集脐血中 CD34 + 造血干细胞 用慢病毒感染 CD34 + 造血干细胞, 在细胞因子组合培养液中诱导 MKs 生成, 流式细胞仪和形态学检测 MKs 的生成及产血小板情况 应用 RT PCR 法和 Westernblot 法检测 tumstatin 基因的表达, 通过人脐静脉血管内皮细胞管状结构形成抑制试验研究血小板内容物生物学活性 结果选择最佳感染复数 (MOI)30 1 感染干细胞时效率最高 ; 流式细胞术检测结果显示, 细胞在诱导过程中, 转染组与未转染组细胞都有 MKs 与血小板的生成, 且生长速度和分化趋势基本相同 在转染的 MKs 基因组里,RT PCR 法检测到 738 bptumstatin 基因片段 Westernblot 法检测到 tumstatin 在转基因细胞来源的血小板中稳定表达, 血小板可明显抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成 结论基因修饰的 CD34 + 造血干细胞在体外成功诱导分化为 MKs 和血小板并表达 tum statin 蛋白, 且这种血小板在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成 关键词 tumstatin; 慢病毒载体 ;CD34 + 造血干细胞 ; 血管内皮细胞 ; 巨核细胞 ; 血小板 中图分类号 R349.63;R331.2 文献标志码 A 文章编号 1000-1492(2014)05-0576-06 2013-12-10 接收基金项目 : 安徽省自然科学基金 ( 编号 :11040606M208); 安徽省高等学校省级自然科学研究项目 ( 编号 :KJ2011A163) 1 作者单位 : 安徽医科大学附属省立医院检验科 2 输血科, 合肥 230001 作者简介 : 李娟, 女, 硕士研究生 ; 罗以勤, 男, 副教授, 主任技师, 硕士生导师, 责任作者,E mail:luoyiqin2003@163.com 血小板中含有许多血管新生促进因子如血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowth factor, VEGF) 血小板衍生生长因子 (platelet derived growthfactor,pdgf) 等以及血管生成抑制因子如凝血酶敏感蛋白 1(thrombospondin 1,TSP 1) 等, 这些因子在血管生成中起到重要的调节作用 [1] 研 [2] 究显示, 尽管血管生成抑制因子和促进因子均存在于血小板 α 颗粒内, 但血小板在影响血管生成过程中, 总的趋势是促进血管生成 肿瘤细胞可释放血小板活化因子诱导循环中的血小板活化和聚集, 使其释放颗粒里的内容物, 为肿瘤血管生成提供了丰富的血管生成促进因子, 从而影响肿瘤的生长和转移 [3] [4] 研究显示 tumstatin 是一种内源性血管生成抑制剂, 大量来源于肾 肺 睾丸基底膜上的 Ⅳ 胶原 α3 链 tumstatin 通过功能性受体特异性地诱导血管内皮细胞凋亡 抑制血管内皮细胞增殖, 从而抑制肿瘤的生长 该研究以慢病毒为基因载体, 将 tumstatincdna 导入 CD34 + 造血干细胞, 进一步在体外诱导其大量生成 tumstatin 基因修饰的巨核细胞 (megakaryo cytes,mks) 和血小板, 并检测产生的血小板对血管内皮细胞管状结构形成的抑制作用 基因修饰的 MKs/ 血小板过表达血管生成抑制因子 tumstatin, 有可能改变血管生成过程中血小板促进因子作用持续地占主导的地位 这种过表达目的蛋白的 MKs/ 血小板, 或可称之 治疗性 MKs/ 血小板, 对肿瘤治疗以及化疗引起的血小板减低症治疗可能有着重要的价值 1 材料与方法 1.1 主要试剂模板质粒 tumstatin 由安徽医科大学附属省立医院检验科实验室保存 ;plvx mcmv diferencewasstatisticalysignificant(p<0 05).Conclusion Bonemarowmesenchymalstemcelsmayhavein terventionefectoncopd,byregulatinginflammationcelproliferationandchemotaxistointervenetheexpresion ofil 17andIL 6,aswelaspromotethethedamagedlungtisuetorepair. Keywords chronicobstructivepulmonarydisease;bonemarowderivedmesenchymalstemcel;il 17;IL 6
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 577 ZsGreen 载体质粒及包装试剂盒购自深圳百恩维生物科技有限公司 ; 脐血由安徽医科大学附属省立医院产科提供 ; 人重组 TPO IL 3 IL 6 SCF 购自英国 PeproTech 公司 ; 无血清培养液 Stem SpanTMSFEM 购自加拿大 Stem CelTechnologies 公司 ;CD34 + CD61 + 细胞分选试剂盒购自德国 MiltenyiBiotee GmbH 公司 ; 抗人 CD34 和 CD41a 单抗均购自美国 ebioscience 公司 ; 兔抗人 tumstatin 抗体购自英国 Abcam 公司 ; 人静脉内皮细胞购自上海吉凯公司 1.2 方法 1.2.1 plvx tumstatin mcmv ZsGreen 载体的构建及慢病毒包以 pmal tumstatin 质粒为模板, 用 PCR 法扩增 tumstatin, 在引物中分别引入 SpeⅠ 和 BamHⅠ 酶切位点, 上游引物序列 :5 CTAGAC TAGTGCCACCATGCCAGGTTTGAAAGGAAACGTGG AG 3, 下游引物序列 :5 CGCGGATCCTCAGTGTCT TTTCTTCATGCACACCTG 3, 划线部分为酶切位点 慢病毒载体 plvx mcmv ZsGreen 及 PCR 扩增产物 tumstatin 经 BamHⅠ 和 SpeⅠ 双酶切, 纯化后的产物在 T4DNA 连接酶作用下进行连接 然后将重组质粒转化感受态细菌进行扩增并抽提质粒, 同时做酶切鉴定并测序 重组表达质粒 plvx tumstatin mcmv ZsGreen 和空慢病毒载体与包装质粒共转染 293T 细胞进行重组慢病毒颗粒包装, 按试剂盒说明书进行, 收集上清液过滤后 -80 保存 HEK293 细胞进行滴度测定, 用荧光显微镜计数荧光细胞数量, 在最高稀梯度 10 m 的孔数出现 N(N<10) 个带荧光的细胞, 则病毒滴度为 N 10 m TU/μl 1.2.2 CD34 + 细胞的筛选及慢病毒感染复数 (mul tiplicityofinfection,moi) 初筛经产道分娩胎儿后, 收集脐血于 CPDA 无菌采血袋内,4 保存 采用密度梯度离心法将脐血按 4 1 比例加入羟乙基淀粉沉淀红细胞, 收集上层血浆, 缓慢加至 Ficol Hypaque 分离液上, 离心收集白膜层,PBS 洗涤 2 次得到人脐带血的单个核细胞, 按照 CD34 + 细胞免疫磁珠分选试剂盒说明书进行分选后, 将 CD34 + 细胞接种于含 50μg/L 细胞因子 TPO IL 3 IL 6 SCF 的完全培养基中预培养, 并留取 30μl 细胞液流式测定 CD34 + 细胞纯度 将预培养 72h 后的 5 10 4 个细胞转入 12 孔板, 将制备保存的慢病毒按感染复数 (MOI)0 1 1 10 1 30 1 50 1 感染细胞, 在 8 μg/ml 的 Polybrene 存在下, 于 30 800r/min 离心 1h 后, 种回至 12 孔板中, 每孔加细胞因子组合培养 液 1ml 继续培养过夜 12h 后换液, 此后每 2~3d 换液 1 次并用倒置荧光显微镜下观察细胞感染情况观察荧光表达情况, 培养 1~2 周后计算转染效率 以表达 ZsGreen 绿色荧光的细胞为转染阳性细胞, 统计同一视野下转染阳性细胞数和总细胞数 根据以下公式计算转染效率 : 转染效率 =ZsGreen 阳性细胞数 / 总细胞数 100% 转染效率 90% 以上的最低 MOI 值为最适 MOI 1.2.3 诱导 MKs 和血小板的生成及流式细胞术分析和细胞形态学分析将细胞分为 3 组 : 无病毒感染组 不含目的基因空病毒感染组和含目的基因病毒感染组, 将病毒液按照 MOI 初筛实验的最佳 MOI 值感染 CD34 + 细胞 观察细胞感染情况后, 在上述细胞因子组合培养液中继续培养 诱导分化, 适当传代换液 在第 3 7 14 天时, 取相应细胞,PBS 离心洗涤后分别加入抗 CD34 抗 CD41a 的单抗及同型对照抗体, 避光孵育 45min,PBS 离心并重悬到 1% 多聚甲醛溶液中, 进行流式分析鉴定 MKs 同时, 收集培养细胞上清, 先低速离心去除细胞和碎片, 再高速离心得血小板沉淀后, 分别加入同型对照抗体和抗 CD41a 的抗体, 避光孵育 45min,PBS 离心后重悬到 1% 多聚甲醛溶液中, 进行流式分析血小板 另取细胞进行瑞氏染色进行形态学分析 1.2.4 MKs 和血小板 tumstatin 的检测用 CD61 + 磁珠分离收集上述 3 组细胞来源的 MKs, 用 TRIzol 裂解细胞提取总 RNA, 经逆转录后用特异性 tumsta tin 引物 ( 同上 ) 进行 PCR 检测,25μl 总反应体系, 按 95 2min,95 30s 变性,58 30s 退火,72 1min 延伸, 共 30 个循环, 最后 72 反应 1min 后 4 停止 将各组 PCR 产物行凝胶电泳分析产物 同时收集 3 组细胞来源的血小板提取总蛋白, 用 Brandford 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度 蛋白样品行 SDS PAGE 电泳, 然后按正极滤纸 PVDF 膜 PAGE 凝胶 滤纸负极的顺序进行转膜, 结束后加入 5% 的脱脂奶粉封闭 最后将膜置于 tum statin 一抗中 4 过夜, 再置于辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗液中, 摇床上孵育 1h 参考 ThermoECL 产品说明书, 在化学发光成像系统显色拍照分析 1.2.5 转基因血小板内皮细胞管状结构形成抑制实验分别收集 2 组细胞来源的血小板 1 10 8 /ml, 以新分离的正常人血小板为对照, 利用液氮反复冻融 3 次裂解血小板, 释放蛋白 50μl 稀释的 ECMa
578 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) trix TM (CHEMICON) 加入 96 孔培养板,37 孵育 1 h 待 ECMatrix TM 凝固, 将 150μl 不含抗生素的 HU VECs( 脐静脉内皮细胞 ) 接种到上述包被 ECMa trixtm 的培养板中, 每孔含细胞数量为 5 10 3 ~1 10 4 个, 然后加入血小板裂解液 试验重复 3 次 细胞在 37 5%CO 2 条件下继续培养, 在 1 2 4 8 12h 时间点观察不同处理组之间内皮细胞管状排列情况 单位面积内管状结构数量和完整程度的差异 1.3 统计学处理采用 SPSS13 0 统计软件进行分析, 数据以 x±s 珋表示, 多组间均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用 LSD 法 2 结果 2.1 重组质粒酶切鉴定及慢病毒包装本研究用慢病毒质粒含双启动子, 分别促进目的蛋白 tumsta tin 和标记蛋白 ZsGreen 表达 ( 图 1A) 将构建抽提好的重组质粒用 SpeⅠ +BamHⅠ 进行双酶切, 经 1 5% 的琼脂糖凝胶电泳发现 738bp 的目的条带和载体质粒条带, 说明慢病毒载体上连入了 tumstatin 基因 ( 图 1B) 将重组质粒 plvx tumstatin mcmv ZsGreen 与包装质粒共转染 293T 细胞, 进行慢病毒的包装 转染 293T 细胞 48h 后, 荧光显微镜观察细胞被感染情况 ( 图 1C) 包装后得到的慢病毒 tumstatin 液进行 10 倍梯度稀释后感染 HEK293 细胞, 在 10 7 稀释梯度孔发现超过 10 个含荧光细胞, 而 10 8 稀释梯度孔发现 1 个含荧光细胞, 因此慢病毒 tumstatin 滴度为 1 0 10 8 TU/ml 2.2 CD34 + 细胞纯度鉴定及感染 MOI 值初筛 每袋脐血体积为 100~120ml, 含单个核细胞 (0 5~ 1) 10 8 个 台盼蓝染色显示细胞活力良好, 死细胞较少 CD34 + 免疫磁珠分选得 (0 5~1 5) 10 6 个 CD34 + 干细胞, 流式细胞术测得 CD34 + 干细胞的纯度达到约 98.5% 通过 MOI 初筛实验发现 MOI 30 1 转染 CD34 + 干细胞感染率较高且荧光持续较长, 而 50 1 的 MOI 值转染的细胞虽然荧光出现较早但细胞死亡较多,MOI10 1 比 1 1 的 CD34 + 干细胞感染率高但是较 MOI30 1 仍然较低 因此, 慢病毒感染 CD34 + 干细胞时, 选择 MOI30 1 为最佳值进行感染实验, 见图 2 以表达绿色荧光的细胞为转染阳性细胞, 荧光显微镜分析 计算细胞转染率为 90 3% 2.3 诱导分化的 MKs 及血小板检测流式细胞 图 1 重组慢病毒鉴定图 A: 慢病毒载体 ;B:pLVX tumstatin mcmv ZsGreen 酶切鉴定 :M: Trans1kplusMarker;1 2 3: 酶切得到的载体质粒条带和目的基因条带 ;C: 转染后 48h 绿色荧光蛋白 ZsGreen 表达 10 图 2 绿色荧光蛋白 ZsGreen 在转染细胞的表达 A: 换液后 72h 荧光显微镜下观察转染结果 10;B: 换液后 72h 白光 10 术鉴定结果 : 由于 CD34 主要是干细胞的标志, CD41a 是 MKs 和血小板的特异性抗体, 因此可检测 CD34 和 CD41a 分子在第 3( 转染前 ) 7 14 天的表达来观察 MKs 的分化情况以及 MKs 产血小板情况 结果显示 : 无病毒感染组 不含目的基因空病毒感染组及含目的基因病毒感染组细胞在相同的时间, 其细胞表面 CD34 和 CD41a 分子表达变化趋势基本相同, 说明空病毒感染及含目的基因的病毒感染基本
安徽医科大学学报 Ａｃ ｔ ａｕｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｔ ａ ｔ ｓｍｅ ｄ ｃ ｎ ａ ｌ ｓａｎ ｈ ｕ ２ ０ １ ４Ｍａ ｙ ４ ９ ５ ５７９ 图 ３ ＣＤ３ ４ 诱导分化 ＭＫｓ及血小板 Ａ 转染前细胞 ＣＤ３ ４和 ＣＤ４１ａ表达率 Ｂ Ｃ 分别为转染后细胞第 ７ １ ４天 ＣＤ３ ４和 ＣＤ４１ａ表达率 Ｄ 培养血小板同型对照 Ｅ ＣＤ４ １ａ标记 ０ 后的培养上清血小板 Ｆ Ｇ 典型的 ＭＫｓ和血小板 油镜 １００ 不影响细胞培养过程中的分化 同时 对不同天数 中 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ法检测结果表明 ３组细胞中来源于 细胞 ＣＤ３４和 ＣＤ４１ａ分 子 表 达 比 较 最 初 分 选 得 无病毒感染组和不含目的基因空病毒感染组血小板 裂解物无 ｔ ｕ ｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ蛋白条带 含目的基因病毒感染组 ＣＤ３４ 细胞阳性率变化不大 其中 ３ ７ ７ 的细胞同 血小板有 ｔ ｕ ｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ蛋白条带 图 ４Ｂ 表明通过慢病 １ａ分子 随着时间的增加 表达 ＣＤ３ ４分 时表达 ＣＤ４ ｔ ｕ ｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ基因转入 ＣＤ３ ４ 细胞 经诱导分化 毒介导 子细胞越来越少 第 １ ４天时 ＣＤ３４ 细胞不到 ２ 在 ＭＫｓ和血小板中得到表达 ＣＤ３４ 细胞 阳 性 率 约 为 ９ ８ ５ 经 ３ｄ培 养 之 后 而 ＣＤ４１ａ细胞却不断增加 但第 １４天之后 增加速 度缓慢 在进行血小板流式分析时 对培养细胞上 清中的沉淀加 ＣＤ４ １ａ分子标记 图 ３Ａ Ｂ Ｃ 同时 用全血中分离的血小板设门 结果显示 细胞培养第 ７天已有少量血小板分泌 在 １ ４ｄ和 ２ １ｄ时 血小 板有明显增多 图 ３Ｄ Ｅ 瑞氏染色进行形态学分 析表明经过 １４ｄ的培养后转基因细胞呈现出典型 的 ＭＫｓ形态 核多叶 并产有大量的血小板 图 ３Ｆ Ｇ 研究结果表明转基因表达并不影响 ＣＤ３４ 细 胞诱导分化为巨 ＭＫｓ和血小板 ２ ４ ＭＫｓｔ ｕｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ基 因 表 达 血 小 板 ｔ ｕｍｓ ｔ ａｔ ｎ 蛋白表达检测 ＣＤ６ １ 磁珠分离培养 １ ４ｄＭＫｓ ＲＴ ＰＣＲ法检测结果表明含目的基因慢病毒感染组有 ７ ３ ８ｂ ｐ的特异性扩增条带 而无病毒感染组和不含目 的基因空病毒感染组无特异性扩增条带 图 ４Ａ 说 图 ４ ＭＫｓｔ ｕｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ基因表达 血小板 ｔ ｕｍｓ ｔ ａｔ ｎ蛋白表达 Ａ ＲＴ ＰＣＲ法检测结果 Ｍ Ｔｒ ａ ｎ ｓ １ｋｐｌ ｕ ｓｍａ ｒ ｋｅ ｒ １ ２ 无病毒感 染组 ３ ４ 空病毒感染组 ５ ６ 含目的 基 因病 毒 感 染组 Ｂ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ 明ｔ ｕ ｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ基因成功导入 ＣＤ３ ４ 干细胞基因组中并 ｂ ｌ ｏ ｔ法鉴定结果 ７ 无病毒感染组 ８ 不含目的基因空病毒感染组 随着细胞分化为 ＭＫｓ ｔ ｕ ｍｓ ｔ ａ ｔ ｎ基因也存在于 ＭＫｓ ９ １ ０ 含目的基因病毒感染组
580 安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 2.5 基因修饰血小板血管内皮细胞管状结构形成抑制实验基因修饰的血小板具有抗新生血管生成的作用, 进行了内皮细胞管状结构形成抑制试验 当 HUVECs 在基质上培养时, 它们迅速排列形成中空管状结构, 与正常分离血小板和未转染血小板比较,tumstatin 基因修饰的显著抑制内皮细胞管状结构形成 研究结果显示未修饰的血小板血管分支数 (NBP)=82 12±13 1;tumstatin 基因修饰血小板 NBP=38 2±7 8; 而正常人分离血小板 NBP= 146 7±17 8,3 组间比较差异有统计学意义 (F= 114 51,P<0 05) 表明 tumstatin 基因修饰血小板与正常血小板和未转染血小板不同, 能显著抑制内皮细胞管状结构的形成, 进而推测在体内有可能抑制肿瘤新生血管形成 见图 5 图 5 内皮细胞管状结构形成试验图 A: 未修饰的血小板内皮细胞管状结构形成 10;B:tumstatin 基因修饰血小板管状结构形成 10;C: 正常血小板内皮管状结构形成 10;D: 各分枝数比较 ; 与未修饰的血小板比较 : P<0 05; 与正常人血小板比较 : # P<0 05 3 讨论 血小板被认为在止 凝血过程中发挥主要作用, [5] 但近些年研究显示血小板能够促进肿瘤生长和转移, 血小板数量增多与肿瘤生长和转移具有正相关性, 而降低血小板数量或者抑制其功能可以明显抑制肿瘤生长和转移 [6] 生理状态下肿瘤微环境中血小板释放血管生成调节因子参与调节血管生成, 但其血管生成促进因子的作用持续地占有主导 地位 [1,7] 本研究通过慢病毒介导基因修饰血小板前体细胞, 经过诱导 分化后在 MKs 和血小板中成功过表达血管生成物抑制因子 tumstatin, 与正常人血小板比较, 这种血小板内容物在体外显著抑制人脐静脉血管内皮细胞的管状结构形成 tumstatin 通过特异性抑制内皮细胞蛋白的合成来实现对肿瘤新生血管的抑制作用 tumstatin 与 αvβ3 整合素相互作用, 抑制局部粘着斑激酶 (FAK) 磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K) 蛋白激酶 B (PKB/Akt) 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mtor) 的活性, 从而降低了真核起始因子 4E 的磷酸化, 在翻译的过程中, 真核起始因子 4E 无法与 4E 结合蛋白 1 分离, 导致帽子依赖型蛋白的合成受到抑制 tumstatin 抗血管活性至少是血管抑素 endostatin 的 10 倍 [8] 因此, 考虑用 tumstatin 作为基因修饰血小板的抗血管生成因子 该研究慢病毒启动子为 CMV 启动子, 可启动基因在多种细胞表达, 无选择性, 转染的 CD34 + 细胞可向不同细胞系分化 因此,tumstatin 除了在 MKs 和血小板中表达外, 还会在红细胞系和粒细胞系表达 为了让基因只在 MKs 和血小板中表达, 可选择 MKs/ 血小板特异性启动子如 GpIba [9] 另外, 可通过优化培养液的细胞因子组合, 引导基因转染细胞主要分化为 MKs 和血小板 MKs 定义为 CD41a + CD61 + 细胞, 因此可用 CD61 磁珠分离获得向 MKs/ 血小板分化的较为单一的细胞 这种方法可除去其他细胞及碎片, 有利于 MKs 和血小板的产生 随着 CD34 + 在体外增殖分化为 MKs 和血小板技术日趋成熟, 为基因修饰血小板研究血小板相关蛋白功能和治疗遗传性血液病如血友病 巨血小板综合征提供了可能 [8] 血小板可与肿瘤细胞形成聚集, 黏附于血管内皮, 肿瘤细胞可激活血小板释放血小板内容物 [10], 因此, 通过慢病毒介导在血小板中过表达血管生成抑制因子 tumstatin, 产生 治疗性 血小板, 在肿瘤治疗中可能具有一定潜力 如肿瘤化疗时可输注 治疗性 血小板, 有可能解决化疗药物引起的血小板减少症 输注常规血小板引起的促进肿瘤新血管生长的问题 ; 并有可能使抗血管生成基因治疗联合化疗发挥更大的抗肿瘤效果, 这些推测有待于进一步研究证实 参考文献 [1] ItalianoJEJr,RichardsonJL,Patel HetS,etal.Angiogenesisis
安徽医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui 2014May;49(5) 581 regulatedbyanovelmechanism:pro andantiangiogenicproteins areorganizedintoseparateplateletagranulesanddiferentialyre leased[j].blood,2008,111(3):1227-33. [2] EtulainJ,FondevilaC,NegrotoS,etal.Platelet mediatedangio genesisisindependentofvegfandfulyinhibitedbyaspirin [J].BrJPharmacol,2013,170(2):255-65. [3] NierodzikM L,KarpatkinS.Thrombininducestumorgrowth,me tastasis,andangiogenesis:evidenceforathrombin regulateddor manttumorphenotype[j].cancercel,2006,10(5):355-62. [4] MaeshimaY,ColoradoPC,ToreA,etal.Distinctantitumorprop ertiesofatypeivcolagendomainderivedfrom basementmem brane[j].jbiolchem,2000,275(28):21340-8. [5] ChoM S,Botsford MilerJ,VasquezHG,etal.Plateletsincrease theproliferationofovariancancercels[j].blood,2012,120 (24):4869-72. [6] TroxlerM,DickinsonK,Homer VanniasinkamS.Plateletfunction andantiplatelettherapy[j].brjsurg,2007,94(6):674-82. [7] CaineGJ,HarisAL,ChristodoulosK,etal.Analysisofcombina tionanti angiogenesistherapyonmarkersofcoagulation,platelet activationandangiogenesisinpatientswithadvancedcancer[j]. CancerLet,2005,219(2):163-7. [8] MaeshimaY,ManfrediM,ReimerC,etal.Identificationofthean ti angiogenicsitewithinvascularbasementmembrane derivedtum statin[j].biol.chem,2001,276(18):15240-8. [9] KuetherEL,SchroederJA,FahsSA,etal.Lentivirus mediated plateletgenetherapyofmurinehemophiliaawithpre existinganti factorv Iimmunity[J].ThrombHaemost,2012,10(8):1570-80. [10] SarkarS,Alam M A,ShawJ,etal.Drugdeliveryusingplatelet cancercelinteraction[j].pharm Res,2013,30(11):2785-94. Tumstatingene modifiedcd34 + hematopoieticstem cels produceanti angiogenicplatelets LiJuan,LuoYiqin,DingBangsheng,etal (DeptofClinicalLaboratory,TheAfiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei 230001) Abstract Objective CD34 + hematopoieticstemcelstransfectedwithrecombinantlentivirusvectorcaryingtum statincdnawereinvitroinducedtoproducemegakaryocytes(mks)andplatelets.theinhibitoryefectofthe plateletsonthegrowthofcapilarytubestructuresofhuvecweredetected.methods ConstructedpLVX tumsta tin mcmv ZsGreenrecombinantvectorwastransfectedinto293Tcelsforviruspackaging.CordbloodCD34 + hematopoieticstemcelsenrichedbyimmunomagneticseparationweretransfectedwithrecombinantlentivirusand inducedtoproducemegakaryocytesintheculturemediumcombinationsofcytokines.flowcytometryandmorpho logicalobservationwereusedtodetectthegenerationofmegakaryocytesandplatelets.rt PCRandWesternblota nalysiswereappliedtoexaminetheexpresionoftumstatin.capilarytubestructuresasayofhuvecwasusedto evaluatetheinhibitoryefectoftheplateletsinvitro.results CD34 + hematopoieticstemcelstransfectedwithre combinantlentivirusatthebestmultiplicityofinfection(moi)being30 1,ZsGreenpositiverateofwhichwas highest.thetransfectedanduntransfectedcelsgeneratedmegakaryocyteandplatelets,thegrowthrateanddifer entiationtrendofwhichweresubstantialyidenticalbyflowcytometryanalysis.rt PCRdetecteda738bptumsta tincdna intransfectedmks.westernblotconfirmedtheexpresionoftumstatinproteiningene modified megakaryocyteandplatelets.tumstatingene modifiedplateletsinhibitedthecapilarytubestructuresofhuvec. Conclusion Gene modifiedcd34 + hematopoieticstemcelsnotonlysuccesfulydiferentiateintomegakaryocyte andplateletsbutalsoexprestumstatinprotein,andthistransgenicplateletssignificantlyinhibitthecapilarytube structuresofhuvecinvitro. Keywords tumstatin;lentivirusvector;cd34 + hematopoieticstemcel;huvec;megakaryocyte;platelet