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120 中国食品卫生杂志 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年第 26 卷第 2 期 Key words: Campylobacter jejuni; Campylobacter coli; multiplex PCR; identify; animal origin pathogen; food borne pathogen; food safety 弯曲菌 ( Campylobacter) 主要为空肠弯曲菌 ( C. jejuni) 和结肠弯曲菌 ( C. coli), 是重要的人兽共患病源菌, 主要通过饮水 食物等方式传染给人类, 是全球范围内胃肠炎的主要病因, 其感染人的病例数已经超过李斯特菌病 沙门菌病和志贺菌 [1 - 病 2] 可使人致病的弯曲菌中 99% 是空肠弯曲菌, 其次是结肠弯曲菌, 其他弯曲菌也偶尔致病 [3] 弯曲菌的主要传染源为动物及其污染的动物产品, 其广泛分布在各种动物体内, 其中家禽 家畜 宠物是弯曲菌的常见宿主, 因此研究动物源弯曲菌具有重要的公共卫生意义 建立弯曲菌快速而特异性的分离和检测方法, 是有效提高检出率和诊断水平的关键所在 弯曲菌的生长条件比较苛刻, 常规检测及鉴定方法繁琐耗时, 而且一些初步的生化试验项目不能鉴别出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌 随着分子生物学技术的发展, 逐步建立了以基因为基础的检测方法取得了长足的发 展, 它具有快速简单 特异性强和敏感性高等特点 越来越多的基因用于弯曲菌的检测中, 16S rrna 基因为弯曲菌属的保守序列 ; 马尿酸酶基因为空肠弯曲菌 ( 包括空肠亚种和德莱亚种 ) 所特有 [4], 它可以有效区分空肠弯曲菌和结肠弯曲菌 ; 而 16S 23S rrna 基因 ( Cc) 是结肠弯曲菌的保守序列 因此本研究在参考比较国外研究的基础上, 选择弯曲菌 16S rrna 基因 马尿酸酶基因 ( Jej) 和 16S 23S rrna 基因 ( Cc) 为靶序列, 设计特异性引物, 建立多重 PCR 方法用于空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴别 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌株本研究使用 6 株标准菌株和 2 株本实验室鉴定保存的菌株作为对照菌株, 编号及来源详见表 1 表 1 菌株的编号及来源 Table 1 Number and source of strains 菌株名称 菌株编号 来源 菌株数量 / 株 空肠弯曲菌 33560 美国 ATCC 1 结肠弯曲菌 7709 中国农业科学院上海兽医研究所 1 大肠埃希菌 25922 美国 ATCC 1 金黄色葡萄球菌 25923 美国 ATCC 1 鸡白痢沙门菌 CVCC 526 中国兽医药品监察所 1 副溶血性弧菌 17802 中国兽医药品监察所 1 空肠弯曲菌 QD2012 2 CJ 本实验室鉴定保存 1 结肠弯曲菌 QD2012 19 CC 本实验室鉴定保存 1 1 1 2 主要仪器与试剂 核酸电泳仪 凝胶成像系统 PCR 仪均购自美 国 Bio Rad, 紫外分光光度计, 离心机 弯曲菌选择性培养基 ( 美国 Sigma) 哥伦比亚血 琼脂基础培养基 ( 英国 Oioid) 绵羊血 ( 青岛高科园海 博生物科技有限公司 ) 2 Taq PCR Master Mix( 上海 生工生物工程公司 ) 低分子量 PCR Marker ( 大连 TaKaRa 公司 ) in gene CAM nested PCR 鉴别检测试剂 盒 ( 西班牙 Ingenasa) 其他常规试剂为国产分析纯 1 2 1 2 1 方法 引物设计 根据 Keramas 等 [5] [6-7] Giessen 等的报道分别 设计 16S rrna 基因 马脲酸酶基因和 16S 23S rrna 基因序列合成 3 对 PCR 引物 : 弯曲菌属的特异引物 对 16S F 和 16S R; 空肠弯曲菌的特异性引物对 Jej F 和 Jej R; 结肠弯曲菌的特异性引物对 Cc F 和 Cc R, 见表 2 引物由上海生工生物技术有限公司合成 1 2 2 多重 PCR 方法的建立在哥伦比亚血琼脂平板上挑取灰色或黄色湿润的 有金属光泽的弯曲菌典型菌落置于盛有 200 μl 超纯水的离心管中, 斡旋混匀, 取出冰浴 10 min,12 000 r / min 室温离心 10 min, 于 - 20 保存备用 PCR 反应体系 :2 Taq PCR Master Mix 12 5 μl, DNA 模板 2 μl, 上 下游引物 (10 nmol / L) 各 0 5 μl, 灭菌超纯水补足至 25 μl PCR 循环条件 :95 变性 10 min;95 变性 30 s,56 退火 90 s,72 延伸 1 min,35 个循环 ;72 延伸 10 min 取 5 μl PCR 产物于 1 0% 琼脂糖凝胶 ( 含 0 5 mg / L 溴化乙锭 ) 进行电泳鉴定 1 2 3 特异性试验用水煮法分别对 6 株标准菌株和 2 株本实验室鉴定保存的菌株进行基因组 DNA 的提取, 提取 DNA 作为模板进行 PCR 检测, 高压过滤的超纯水作为空白对照, 以确定方法的特异性
多重 PCR 鉴定动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌方法的建立 盖文燕, 等 121 表 2 引物的名称 特异性 序列和扩增产物大小 Table 2 The name,specificity,sequences and product sizes of primers 引物名称 细菌种属 引物序列 产物长度 / bp 16S F 弯曲杆菌属 5 GCGAAGAACCTACCYGGRCTTGATA 3 314 16S R 5 TCGCGRTATTGCGTCTCATTGTATATG 3 Jej F 空肠弯曲杆菌 5 CATCTTCCCTAGTCAAGCCT 3 774 Jej R 5 GCAAAGGCAAAGCATCCATA 3 Cc F 结肠弯曲杆菌 5 GTTAAGAGTCACAAGCAAGT 3 194 Cc R 5 CTAAAAATATCTAAACTAAGTCG 3 1 2 4 敏感性试验用紫外分光光度计测定空肠弯曲菌和结肠弯曲菌模板 DNA 含量, 然后分别做 10 倍梯度稀释, 每个稀释度的 DNA 各取 2 μl 进行 PCR 扩增, 电泳后观察条带亮度, 直至不出现扩增条带为止, 确定出现条带的最大稀释度 1 2 5 不同方法的符合试验选取分离鉴定的动物源弯曲菌 32 株 ( 其中 20 株 C. jejuni 菌株 12 株 C. coli 菌株 ), 另取 5 株实验室保存的大肠杆菌菌株作为阴性样品 用水煮法提取模板 DNA 后, 用建立的多重 PCR in gene CAM nested PCR 检测试剂盒和 GB / T 4789 9 2008 食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌 [8] 三种方法进行比较检测 in gene CAM nested PCR 按照试剂盒说明书进行操作和结果判定, 计算三种方法的符合率 符合率为两种方法检测同为阴性的样品数加同为阳性的样品数之和与样品总数的比值 1 2 6 方法的初步应用从农贸市场 屠宰场和动物医院随机采集生鲜鸡肉样品 ( 87 份 ) 盲肠拭子样品 ( 31 份 ) 共计 118 份, 进行分离培养 挑取哥伦比亚血琼脂平板上的菌落, 提取基因组 DNA 做模板, 用建立的多重 PCR 进行检测, 考查所建立方法的应用效果 2 结果与分析 2 1 多重 PCR 反应条件的优化试验比较了加入不同体积的模板 引物 2 Taq PCR Master Mix 的反应结果, 并根据不同的退火温度摸索出最佳的 PCR 反应体系及反应条件 在 25 μl 反应体系中, 加入 2 Taq PCR Master Mix 12 5 μl,dna 模板 2 μl, 上下游引物各 0 5 μl, 灭菌超纯水 7 5 μl 2 2 特异性试验结果电泳结果显示, 空肠弯曲菌分别在 314 和 774 bp 处扩增出属特异性条带和种特异性条带, 结肠弯曲菌分别在 314 和 194 bp 处扩增出属特异性条带和种特异性条带, 而检测的大肠杆菌 鸡白痢沙门菌 金黄色葡萄球和副溶血弧菌均未出现特异性条带 ( 见图 1) 注 :M:DNA Marker;1: 空肠弯曲菌标准株 ;2 3: 空肠弯曲菌分离株 ; 4: 结肠弯曲菌标准株 ;5: 结肠弯曲菌分离株 ;6: 大肠杆菌 ; 7: 鸡白痢沙门菌 ;8: 金黄色葡萄球菌 ;9: 副溶血弧菌 ;10: 空白对照图 1 多重 PCR 的特异性扩增结果 Figure 1 Specificity amplification results of mpcr 2 3 敏感性试验结果分光光度计测得空肠弯曲菌模板 DNA 的浓度为 8 1 ng / μl, 结肠弯曲菌模板 DNA 浓度为 9 3 ng / μl 不同稀释度的模板经过多重 PCR 扩增后, 结肠弯曲菌和空肠弯曲菌均可在 10-4 稀释度时检测到特异性条带 ( 见图 2 和 3) 由此可见, 该方法检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的敏感性分别为 0 81 和 0 93 pg / μl 的 DNA 注 :M:DNA Marker;1 ~ 8: 稀释度分别为 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 图 2 多重 PCR 检测结肠弯曲菌的敏感性试验结果 Figure 2 Sensitivity test results of mpcr for detection of C. coli 注 :M:DNA Marker;1 ~ 8: 稀释度分别为 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 图 3 多重 PCR 检测空肠弯曲菌的敏感性试验结果 Figure 3 Sensitivity test results of mpcr for detection of C. jejuni 2 4 符合性试验结果对选取的 37 份菌株样品分别进行检测, 比较
122 中国食品卫生杂志 CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 2014 年第 26 卷第 2 期 结果表明, 所建立的多重 PCR 方法与 in gene CAM nested PCR 检测试剂盒符合率为 100%, 二者与国 标 GB / T 4789 9 2008 方法的符合率均达 97% 以 上, 见表 3 方法 Table 3 表 3 多重 PCR in gene CAM nested PCR 与国标方法的符合率比较结果 Coincidence comparison of mpcr, in gene CAM nested PCR and GB standard method 菌株数 / 株 阳性数 ( 结肠弯曲菌 / 空肠弯曲菌 ) 阴性数 ( 结肠弯曲菌 / 空肠弯曲菌 ) 多重 PCR in gene CAM nested PCR GB / T 4789 9 2008 37 12 / 20 25 / 17 100% a / 97 3% b 100% a / 97 3% b 多重 PCR 37 12 / 19 25 / 18 100% a / 100% b in gene CAM nested PCR 37 12 / 19 25 / 18 100% a / 100% b 注 :a 为两种方法检测空肠弯曲杆菌的符合率,b 为两种方法检测结肠弯曲杆菌的符合率 2 5 临床样品检测结果 118 份临床样品经初步细菌分离培养后, 进行 生化鉴定, 同时应用建立的多重 PCR 方法进行检 测 结果显示,23 份样品为空肠弯曲菌,12 份样品 为结肠弯曲菌, 与生化鉴定结果一致 结果见表 4 采样地点 样品数 / 份 表 4 Table 4 样品的来源及检测结果 Samples source and result 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 阳性数 / 份阳性率 / % 阳性数 / 份阳性率 / % 青岛 63 17 26 98 9 14 29 济南 24 3 12 50 2 8 33 上海 31 3 9 68 1 3 23 3 讨论 弯曲菌一直是动物源性食品安全监测的主要细 菌之一 弯曲菌检测主要是生化鉴定, 但是生化鉴定 试验存在操作繁琐 检测周期长 假阳性高 不能区分 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌等问题 随着分子生物学 的发展, 逐步建立了一些以基因为基础的检测方法 [9] 杨毓环等以鞭毛蛋白基因 flaa 为靶基因, 建立检 测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的 PCR 方法, 该法有较好 的特异性, 但不能对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行鉴 [10] 别 ; 何蕊等以 mapa 基因和 ceue 基因为靶基因, 建立 了针对弯曲菌的多重 PCR 方法, 但 mapa 基因的特异 性不强, 并非所有的空肠弯曲菌都能扩增出 589 bp 的 [11] mapa 基因的特异性片段 ; 娜仁高娃等以 hipo 为 靶基因, 建立的多重 PCR 方法, 对分离的结肠弯曲 [12] 菌扩增的特异性不强 ;Yamazak 等建立的环介导 等温扩增 (LAMP) 方法用于鸡肉中空肠弯曲菌和结 肠弯曲菌的检测,LAMP 方法对环境的要求非常苛 刻, 容易出现极高的假阳性 本研究建立的多重 PCR 方法具有较强的特异 性, 分别扩增出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异条 带, 而其他参考菌株均未扩增出条带, 这表明该多 重 PCR 方法具有很强的特异性 敏感性试验结果 显示, 该方法最低可检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌 敏感性分别为 0 81 和 0 93 pg / μl 的 DNA, 与何蕊 [10] 等报道 0 925 和 1 050 pg / μl 的结果相近, 说明 该方法的敏感性较高 同时应用建立的多重 PCR 对临床采集的 118 份样品进行检测, 结果显示 23 份 样品为空肠弯曲菌,12 份样品为结肠弯曲菌, 与普 通 PCR 结果一致, 但是整个过程只用了 4 h, 具有简 洁快速的优点 该方法对环境的要求不高, 假阳性 几率低, 实现了弯曲菌属和种特异性的扩增, 并且 条带大小相差较大, 肉眼可区分样品的种属 in gene CAM nested PCR 检测试剂盒是用巢氏 PCR 方法对水 土壤 粪便和肉类样品中弯曲菌进行检测, 并且可以对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行鉴别, 具有 较高的敏感性, 但价格较高, 不适合基层临床检测 本 研究应用 in gene CAM nested PCR 检测试剂盒与国标 GB/ T 4789 9 2008 方法对所建立的多重 PCR 方法进 行比较, 结果显示多重 PCR 方法与 in gene CAM nested PCR 检测试剂盒的符合率为 100%, 二者与国标 GB/ T 4789 9 2008 方法的符合率也均达 97% 以上, 说明建 立的多重 PCR 准确性和可靠性较高 总之, 本研究建立的多重 PCR 方法具有特异性 强 敏感性高 快速方便等特点, 适用于弯曲菌临床 快速鉴别检测, 为动物及动物产品中弯曲菌的检测 鉴别提供了一种简洁快速的方法 参考文献 [ 1 ] CHAO H C,CHEN C C,CHEN S Y,et al. Bacterial enteric infections in childern:etiology,clinical manifestations and antimicrobial therapy [J]. Expert Rev Anti Infect Ther,2006,4(4):629 638. [ 2 ] Sonnevend A, Rotimi V O, Kolodziejek J, et al. High level of ciprofloxacin resistance and its molecular background among Campylobacter jejuni strains isolated in the United Arab Emirates [ J]. J Microbiol,2006,15( Pt 11):1533 1538. [ 3 ] Lastovica A J,Skirrow M B. Clinical significance of Campylobacter and related species other than Campylobater jejuni and C. coli [ M ] Nachamkin I, Blaser M J. Campylobacter: 2nd eds. Washington:ASM Press,2000:139 153. [ 4 ] Slater E R,Owen R J. Restriction fragment length polymorphism analysis shows that the hippuricase gene of Campylobacter jejuni is highly conserved[ J]. Lett Appl Microbiol,Lett Appl Microbiol, 1997,25(4):274 278.
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