SHENTEK Hi5&AcNPV 残留 DNA 检测试剂盒 ( 多重 PCR- 荧光探针法 ) 说明书 货号 :1101102 版本 :A/1 仅供研究用 湖州申科生物技术有限公司
试剂盒简介 SHENTEK Hi5&AcNPV 残留 DNA 检测试剂盒用于定量检测昆虫细胞 (High Five) 杆状病毒表达系统来源的基因工程疫苗中残留的 Hi5 细胞 DNA 和杆状病毒 (AcNPV) DNA 的专用试剂盒 本试剂盒利用荧光探针原理, 采用多重 qpcr 的方法定量检测样品中 Hi5 和 AcNPV 残留 DNA 检测快速, 专一性强, 性能可靠, 最低检测限可以达到 10 copies/μl 试剂盒配套有 Hi5&AcNPV 定量参考品 本试剂盒与 SHENTEK 宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用, 可准确定量样品中残留的 Hi5&AcNPV 微量 DNA 试剂盒组分表 1. 试剂盒组分组分装量储存条件 Hi5&AcNPV DNA 定量参考品冻干粉,1 管 -18 及以下 Hi5&AcNPV Primer&Probe MIX 300μl 1 管 -18 及以下, 避光 qpcr Reaction Buffer 850μl 2 管 -18 及以下, 避光 DNA 稀释液 1.5ml 3 管 -18 及以下 IPC MIX 150μl 1 管 -18 及以下, 避光 规格 100 Reactions 有效期规定储存条件下 24 个月, 具体详见试剂盒标签 适用机型 ( 包括但不限于 ) SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统 7500 Real-Time PCR System CFX96 定量 PCR 系统 FQD-96A 定量 PCR 系统 实验所需但试剂盒中未含材料 1.5ml 无菌低吸附离心管 96 孔 qpcr 板或八联管 1000μl,100μl,10μl 无菌有滤芯枪头 第 1 页共 6 页
相关设备 荧光定量 PCR 仪 1000μl,100μl,10μl 移液枪 操作过程 Hi5&AcNPV DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备 Hi5 细胞 DNA 和 AcNPV DNA 定量参考品浓度标注于管壁标签, 请确认后再进行稀 释 Hi5&AcNPV DNA 定量参考品内含有 Hi5 细胞 DNA 和 AcNPV DNA 将定量参考品快速离心 15s, 准确移取 55μl ddh2o 加至管底, 溶解冻干粉 为保证冻干粉充分溶解, 轻弹数下混匀, 短时间快速离心 10s, 如此重复 3 次, 再静置 10min 后使用 其中 AcNPV DNA 通过如下公式换算成拷贝数,2ng/μl 浓度换算成拷贝数为 2.12 10 9 copies /μl 公式 : 质粒拷贝数 (copies/μl)=6.02 10 14 质粒浓度 (ng/μl)/( 质粒碱基数 660) 用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行梯度稀释, 具体操作如下 : 1. 将试剂盒中的 Hi5&AcNPV 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 条件下融化 待完全融化后, 轻弹数下混匀, 短时间快速离心 3~5s, 如此重复 3 次 2. 取 7 支干净的 1.5ml 离心管, 分别标记为 ST ST0,ST1,ST2,ST3,ST4,ST5 3. 在 ST 管中用 DNA 稀释液将 Hi5&AcNPV DNA 定量参考品按标识稀释至 Hi5 DNA 浓度为 3ng/μl,AcNPV DNA 浓度为 2.12 10 8 copies /μl, 得到 ST 振荡混匀后短时间快速离心 3~5s, 重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀 4. 在 ST0,ST1,ST2,ST3,ST4,ST5 管中分别加入 90μl DNA 稀释液 5. 按表 2 依次进行 6 次稀释操作 第 2 页共 6 页
表 2. Hi5&AcNPV DNA 定量参考品的稀释 稀释管稀释体积 Hi5(pg/μl) AcNPV(copies /μl) copies /μl ST0 10μl ST+90μl DNA 稀释液 300 2.12 10 7 ST1 10μl ST0+90μl DNA 稀释液 30 2.12 10 6 ST2 10μl ST1+90μl DNA 稀释液 3 2.12 10 5 ST3 10μl ST2+90μl DNA 稀释液 3.00 10-1 2.12 10 4 ST4 10μl ST3+90μl DNA 稀释液 3.00 10-2 2.12 10 3 ST5 10μl ST4+90μl DNA 稀释液 3.00 10-3 2.12 10 2 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 若 DNA 稀释液中有析出, 建议于 37 条件下进行孵育 标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择, 应至少有 5 个浓度点 阴性质控 NCS 的制备根据实验设置阴性质控, 具体操作如下 : 1. 取 100μl DNA 稀释液加入 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NCS 阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理, 制备成阴性质控 NCS 纯化液 qpcr 反应液的制备和加样 1. 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量, 计算所需反应孔数, 一般做 3 个重复孔 / 样 反应孔数 =(5 个浓度梯度的标准曲线 + 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS + 待测样品 ) 3 2. 根据反应孔数计算本次所需的 qpcr MIX 总量 : qpcr MIX =( 反应孔数 +2) 20μl( 含有 2 孔的损失量 ) 3. 各试剂放在冰上或 2-8 条件下融化, 并根据表 3 所示准备 qpcr MIX: 第 3 页共 6 页
表 3. qpcr MIX 配制表 组份 qpcr Reaction Buffer Hi5&AcNPV Primer&Probe MIX IPC MIX 总体积 单孔反应 15.9μl 2.8μl 1.3μl 20μl 4. 上述各试剂置于冰上, 轻微振荡混匀, 按表 4 所示加样 : 表 4. 各反应孔加样示例 标准曲线 NTC NCS 20μl qpcr MIX + 10μl ST1/ST2/ST3/ST4/ ST5 20μl qpcr MIX + 10μl DNA 稀释液 20μl qpcr MIX + 10μl 阴性质控 NCS 纯化液 加样完成后每孔总体积为 30μl 表 5. 96 孔板排版示例 S1 S1 S1 A S2 S2 S2 ST1 ST1 ST1 B S3 S3 S3 ST2 ST2 ST2 C S4 S4 S4 ST3 ST3 ST3 D S5 S5 S5 ST4 ST4 ST4 E ST5 ST5 ST5 F G NCS NCS NCS NTC NTC NTC H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 Hi5&AcNPV DNA 标准曲线 (ST1~ST5) 1 个无模板对照 NTC 1 个阴性质控 NCS 5 个待测样品 (S1~S5) 每个检测做 3 个重复孔 实际检测时可根据样品多少, 参照此示例进行 96 孔板排版加样 5. 将 96 孔板用光学膜封闭, 轻微震荡混匀, 短时间快速离心 10s 后放入 qpcr 仪 第 4 页共 6 页
qpcr 程序设置 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统 软件版本 8.2.2 为例 1. 点击 实验向导, 基本设置 中设置实验信息 2. 孔板编辑 页面中选择步骤 1: 选择反应孔 3. 选择步骤 2: 选择项目中的 Hi5&AcNPV 残留 DNA 程序 4. 实验运行 页面中点击 开始 运行程序 其他定量 PCR 系统程序设置如下 : 选择 FAM 通道代表 Hi5 DNA 检测信号, 选择 CY5 通道代表 AcNPV DNA 检测信号, 选择 VIC 通道代表 IPC 检测信号 1. 创建空白新程序, 选择绝对定量检测模板 2. 创建新检测探针, 命名为 Hi5-DNA, 选择报告荧光基团为 FAM, 猝灭荧光基团为 none; 创建新检测探针, 命名为 AcNPV-DNA, 选择报告荧光基团为 CY5, 猝灭荧光基团为 none; 创建新检测探针, 命名为 IPC, 选择报告荧光基团为 VIC, 猝灭荧光基团为 none; 检测参比荧光为 ROX( 可选 ) 3. 设置两步法反应程序 :95 预变性 10min;95 15 s,60 1 min( 读取荧光 ), 40 个循环 ; 反应体积 30μl qpcr 结果分析 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统 软件版本 8.2.2 为例 1. 孔板编辑 页面中步骤 3: 定义反应孔, 将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品, 并在标品赋值中分别根据表 2 赋值, 例如 通道 1 目标 :Hi5-DNA 中标品赋值设为 30 3 0.3 0.03,0.003, 通道 4 目标 :AcNPV-DNA 中标品赋值设为 2.12 10 6 2.12 10 5 2.12 10 4 2.12 10 3 2.12 10 2, 并且在相应的 样本名称 中命名为 ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 2. 待测样品将样品类型设置为待测样品,NTC 将样品类型设置为无模板对照 3. 在 实验分析 页面点击, 可读取标准曲线的斜率 截距 相关系数 扩增效率 4. 在 反应孔信息表中 可读取无模板对照 NTC 阴性质控 NCS 待测样品的检测值, 单位为 pg/μl 以 7500 Real-Time PCR System 软件版本 1.4 为例 1. 在 Results 的 Amplification Plot 中, 将 Threshold 设置为 0.02, 点击 Analyze, 此 第 5 页共 6 页
时可初步查看扩增曲线的形态是否正常 2. 在 Results 的 Plate 中, 将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard, 并且在 Quantity 一栏分别根据表 2 赋值, 例如 Hi5 设为 30 3 0.3 0.03 0.003( 单位为 pg /μl), 并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 AcNPV 设为 2.12 10 6 2.12 10 5 2.12 10 4 2.12 10 3 2.12 10 2 ( 单位为 copies /μl), 相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 3. 在 Results 的 Plate 中, 将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC, 将阴性质控 NCS 孔 待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown, 并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC NCS S, 之后点击 4. 在 Results 的 Standard Curve 中, 可读取标准曲线的斜率 (Slope) 截距(Intercept) R 2 5. 在 Results 的 Report 中,Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC 阴性质控 NCS 待测样品的检测值 6. 样品的 Ct-IPC 值与 NCS 的 Ct-IPC 值要求在 ±1 个 Ct 值范围内, 如样品的 Ct-IPC 值于 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大, 则表明样品可能有抑制 建议同时测试加标样品, 优先考虑样品回收率结果,IPC 结果作为参考 7. 阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值, 若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度, 则 NCS 的检测值应小于定量限浓度 8. 无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值 35 上述示例结果分析的参数设置仅供参考, 具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定, 一般也可由仪器自动判读 修订日期 :2022 年 11 月 10 日 服务支持 湖州申科生物技术有限公司 www.shenkebio.com 地址 : 浙江省湖州市红丰路 1366 号 6 号楼 Email:Info@shenkebio.com 电话 :0572-2165910 第 6 页共 6 页