宿主细胞残留DNA检测技术培训手册
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- 弩硬牙 柯
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1 宿主细胞 DNA 残留检测 技术培训手册 2016 年 12 月 中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心 湖州申科生物技术有限公司
2 目录 1. 使用范围 残留 DNA(rDNA) 检测必要性 致瘤性 传染性 DNA 整合 rdna 检测 rdna 限量规定 rdna 检测方法 检测方法发展趋势 样品前处理方法 SHENTEKrDNA 检测试剂盒介绍 标准术语 rdna 样本 典型取样点 样本运送和保存 rdna qpcr 检测实验 实验要求 rdna 检测试验流程 样本准备 rdna qpcr 检测数据分析 : rdna 检测方法学验证 验证项目 分类 方法学验证举例 特定样品的方法学验证 注意事项 常见问题 参考文献...25 技术服务咨询 :...27
3 1. 使用范围 本手册由中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心和湖州申 科生物技术有限公司编写, 为宿主细胞 DNA 残留检测方法的建立提供全面指导, 供生 物制品生产及研发企业等人员参考 2. 残留 DNA(rDNA) 检测必要性 随着生物医药技术的飞速发展, 生物制品的表达系统一直在改变 除了一些常见的细胞系, 如 CHO E.coli 酵母等之外, 细胞系如植物 昆虫以及人的细胞越来越广泛应用于治疗性疫苗和治疗性生物制品生产中 生物制品包括重组蛋白, 疫苗, 以及特殊的单克隆抗体 源自细胞及微生物培养生产的生物制品含有特定杂质, 包括宿主细胞蛋白 (HCP) 及 DNA 残留 (rdna) 相关研究表明, 生物制品中宿主细胞 rdna 具有潜在致瘤和传染风险,rDNA 还可能造成基因插入突变, 因此检测 rdna 的含量关系到生物制品的质量与纯度, 是产品质量的一个重要指标, 更是一个安全性问题 2.1 致瘤性 人体内的原癌基因正常情况下参与细胞进程, 而一旦被激活 ( 如突变 ), 原癌基因则变成活化的癌基因 而这种被激活的癌基因常存在于特定细胞的基因组中, 如连续传代细胞系和成瘤细胞 ( 残留 DNA 可能携带 HIV 病毒或 Ras 癌基因等 ) 研究表明, 分布在哺乳动物细胞基因组的 LINE-1 序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中, 这种插入可能影响关键基因功能的发挥, 如激活癌基因或抑制抑癌基因 2.2 传染性 残留 DNA 的感染性是由于细胞 DNA 中可能存在传染性病毒基因组, 该基因组无论是作为染色体外组分还是整合入人体基因组, 都能够扩增并产生传染性病毒粒子, 因此 DNA 感染性风险可能比致瘤风险更大 对于肿瘤来源的细胞基质, 尤其是活病毒疫苗, rdna 应作为安全性评价的一个指标 1
4 目前的研究结果显示, 残留 DNA 的致瘤性相比传染性风险要低, 但考虑到致瘤性 实验是动物实验, 传染性实验是在细胞水平做的, 或许对两方面的风险都不能掉以轻心 2.3 DNA 整合 DNA 整合入人体基因组, 然后通过激活原癌基因或失活抑癌基因致瘤, 这种可能性理论上是成立的, 而这种风险存在与否取决于整合的 DNA 研究发现,25μg 含有强启动子的质粒并未诱导敏感鼠系致瘤, 而表达原癌基因的相同质粒则可导致肿瘤产生 此外, 由于微生物来源的基因组 DNA 富含 CpG 和非甲基化序列, 增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险 在一些临床前和临床研究中报道了高剂量的核酸样品, 比如 DNA 疫苗或佐剂中的 CpG 寡聚核苷酸, 可以诱导免疫反应, 还诱导产生 DNA 抗体 3. rdna 检测 生物制品中的宿主细胞残余 DNA 的检测是非常重要的,WHO,EU,ICH,FDA, EMEA 和 CFDA 等监管机构对最终剂量中的 rdna 的量有明确的强制要求 rdna 潜在的风险以及确定生产过程中 rdna 的清除情况是监管考虑的重要内容 这就需要 rdna 的检测方法是准确, 灵敏, 定量的, 特别是要采用高敏度的方法检测以确保最终成品中的 rdna 被清除到尽可能低 3.1 rdna 限量规定 虽然在基本结构碱基配对单位上类似, 但是 rdna 会以不同的大小和组成存在 检测重组产品中 rdna 的意义不仅在于阐明生产中纯化的有效性, 也是对宿主表达系统中存在的一些 DNA 潜在的感染性以及致癌性的考虑 ( 分别以 HIV 病毒和 Ras 致癌基因为代表 ) 基于 rdna 的潜在危害, 许多机构对生物制品 rdna 残留有明确限量要求, 并不像 HCP 可以根据个案来进行处理 WHO 可接受的非口服生物制品 rdna 为 10ng/ 剂量 特殊情况下, 由于高度纯化工艺, 可使 DNA 残留量为 10pg/ 剂量 同时对于某些活病毒疫苗, 在不损失病毒滴度而达到纯化 DNA 标准很困难时,WHO 建议与药品监管部门和国家质控实验室研讨确定 欧洲药典通则对 rdna 残留量限制为 10ng/ 剂量, 但针对个别疫苗 ( 如甲型肝炎灭活疫苗 rdna 不超过 100pg/ 剂量, 乙型肝炎疫苗 rdna 不超 2
5 过 10pg/ 剂量 ) 会有所不同 FDA 建议生物制品可允许的 rdna 限度为 100pg/ 剂量, 对 于大剂量的制品 ( 如单克隆抗体 ),rdna 放宽到 10ng/ 剂量, 这主要取决于 rdna 的 来源和产品给药途径 ( 表 1) 表 1 宿主细胞 rdna 残留限制及风险等级 参数 类型 限值 风险因子 原代细胞 - 1 细胞株 二倍体细胞株 - 1 连续传代非肿瘤细胞株 10ng 2 连续传代肿瘤细胞株 100pg 3 口服 100ug 1 皮下注射 10ng 2 给药方式 肌内注射 10ng 3 静脉注射 100pg 4 输液 100pg 5 注 : 风险依风险因子数值递增 中国生物制品规程 中规定 rdna 含量每剂量应不高于 10ng 中国药典 中对于 Vero 细胞培养疫苗一般要求 rdna 残留量不超 100pg/ 剂量,CHO 细胞培养疫苗 rdna 残留量不高于 10pg/ 剂量 (EPO 单克隆抗体等生物制品,rDNA 残留量放宽到 100pg/ 剂量 ), 酵母和 E.coli rdna 残留量不高于 10ng/ 剂量 基于 rdna 潜在的风险,2010 年 FDA 发布的相关指导,ICHQ9 中强调对于不同的细胞系根据其来源和遗传背景来确定 rdna 的测试 : 通过降低生物活性来减少宿主细胞来源的 DNA 的致瘤性和感染性风险 通过降低 rdna 含量, 减小 rdna 片段的大小 ( 如 DNase 或其他方法处理 ) 至功能基因大小 ( 目前的证据表明为 200bp) 以下 通过化学方法来减小 rdna 的大小和降低它的生物学活性 如果使用到 DNA 清除, 降解或者失活的方法, 则需要方法学验证 在终产品中需要检测 rdna 的含量和片段大小分布情况 现有研究表明, 一个功能基因至少在 200bp 以上, 因此, 为减少 rdna 风险,FDA 建议 rdna 片段不大于 200bp DNA 片段大小风险等级如下表 : 3
6 表 2 DNA 片段大小风险等级划分 rdna 片段 /bp 风险因子 < > > 注 : 风险依风险因子数值递增 3.2 rdna 检测方法 因为残留 DNA 涉及到潜在来源 ( 传染性病毒 DNA) 管理规程等关键问题, 药品 监管部门建议必须建立产品的 DNA 残留检测方法 rdna 检测方法有杂交法, 阈值法, PicoGreen 为代表的荧光染料法和 qpcr 法等 2010 年版中国药典附录收录了以地高辛 标记为代表的 DNA 杂交探针法和 PicoGreen 为代表的荧光染料法 但这两种方法都存 在技术缺陷, 已经被美国和欧盟药典摒弃 新版美国药典 (USP) 中将唯一推荐 qpcr 法作为生物制品中宿主残留 DNA 的标准方法 qpcr 法的技术优势在于序列特异性高 灵敏度高 重现性好, 还可以实现定量检测, 使得结果更精确, 对 rdna 风险的评估更 加客观 表 3 不同检测方法的理想检测限 检测方法 检测限 (LOD) 分光光度法 0.1μg/mL 荧光染料法 (PicoGreen) pg 杂交, 随机标记 DNA 50pg(10-12 g) 杂交, 生物素标记探针 2pg 杂交, 重复序列 (SINA,Alu) 5pg 免疫方法 5-10pg PCR, 单一序列 fg(10-15 g) PCR, 重复序列 (SINE,Alu) ag(10-18 g) 杂交法 (Hybridization-based) 根据宿主 DNA 序列设计 DNA 探针用于测定产品中配对 DNA 的数量 双链 DNA 被变性成单链后固定在尼龙膜或硝化纤维膜上,DNA 探针被放射或荧光随机掺入标记以后, 与膜上固定的样品宿主 DNA 杂交结合, 并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点 对于荧光标记的探针, 斑点的光密度结果可以在仪器中定量分析 斑点光密度对应结合 4
7 在目标 DNA 上的探针数, 进而推测出残留 DNA 的数量 通过目测方法可以半定量地检测样品中残留 DNA, 仪器读片可以对应斑点光密度绘制标准曲线, 对应检测结果更加准确 DNA 结合蛋白免疫阈值法 (DNA-BINDING PROTEIN-BASED) 这种方法使用 DNA 结合蛋白和 DNA 抗体, 分四步检测 第一步, 通过加热把 DNA 变性成单链 DNA, 变性后 DNA 与偶联了亲和素的 DNA 结合蛋白以及偶联了尿素酶的 DNA 单克隆抗体混合反应, 液相中的单链 DNA DNA 结合蛋白 DNA 抗体共同形成序列非特异的复合物 第二步, 样品混合液通过生物素标记的膜, 亲和素 - 生物素结合把 DNA 复合物固定在膜上, 洗去非特异吸附 第三步, 膜放入检测仪器中与尿素溶液反应, 反应产物氨改变溶液 ph 值并被仪器记录变化, 这种 ph 值的变化直接与样品中的 DNA 数目相关 第四步, 仪器软件自动分析原始数据确定样品中残留 DNA 数量 染料法染料法主要以 PicoGreen 方法为代表, 其原理为 PicoGreen 荧光染料与双链 DNA 结合发出荧光信号, 使用仪器检测荧光信号以此对 DNA 进行定量分析 PicoGreen 方法的优点是使用方便, 成本低廉, 可以检测相对 DNA 残留量比较高的样品 但 PicoGreen 灵敏度较低, 仅能检测 0.2ng 的纯 DNA 溶液 定量 PCR 法 (QUANTITATION PCR-BASED) qpcr 方法以其快速 高通量的特点已经被应用于生物制药的一些领域 ( 拷贝数检测与病毒检测 ) 在 PCR 反应过程中,1-2h 内以一段 DNA 模板扩增出上百万片段 ; 这项技术使得检测低水平 DNA 成为可能, 且能够确定各种样品中目标 DNA 序列的准确数量 定量 PCR 使用到好几种化学物质, 其中两种使用的非常普遍, 并且都利用了荧光染料 第一个是基于双链 DNA 的结合染料, 如 SYBR Green 游离的染料荧光信号非常弱, 相反, 当 SYBR Green 结合到双链 DNA 上时会产生很强的荧光信号, 大约高于游离染料信号强度的 2000 倍, 因此这个分析具有很高的信噪比, 但 SYBR Green 能与所有的 DNA 双链相结合, 对 DNA 模板没有选择性 第二种化学方法是 TaqMan 技术, 在同一个片段中, 两个特异性引物之间设计一条特异性探针, 该探针包括 5' 端的报告基团和 3' 端的淬灭基团, 当探针完整时, 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收, 5
8 仪器检测不到信号, 随着 PCR 的进行, 聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针, 其核酸外切酶活性能够将探针切断, 报告基团远离淬灭基团, 其能量不能被吸收, 即产生荧光信号, 每经过一个循环, 荧光信号也和目的片段一样, 有一个同步指数增长的过程 ( 图 1) 由于 TaqMan 探针是特异性针对目的片段的, 所以其特异性和准确性要优于 SYBR Green, 且不像 SYBR Green 一样存在引物二聚体影响结果的问题 图 1 Taqman 探针法工作原理 DNA 探针的设计非常关键, 这种 DNA 探针包含一端染料分子和另一端淬灭分子 当特殊设计的 DNA 引物引导 DNA 聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时, DNA 聚合酶切断结合在目标 DNA 上的探针染料端, 释放到反应液里的染料信号被仪器测量 经过数十个循环的 DNA 扩增, 荧光信号与起始 DNA 模板成对应关系, 对应标准曲线可以准确计算出样品中残留 DNA 的数量 PCR 原理聚合酶链式反应 (PCR) 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术 PCR 由高温变性 低温退火 ( 复性 ) 及适温延伸三个基本反应步骤组成一个周期, 循环进行, 使目的 DNA 得以迅速扩增 ( 图 2) 图 2 PCR 扩增原理 6
9 qpcr 基本概念及理论 qpcr 全名 Real-time Quantitative PCR Detecting System, 即实时荧光定量核酸扩增检测系统, 是通过实时检测 PCR 每一个循环扩增产物相对应的荧光信号, 来实现对起始模板进行定量及定性分析 在实时荧光定量 PCR 反应中, 引入了一种荧光化学物质, 随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累积, 荧光信号强度也等比例增加 每经过一个循环, 收集一个荧光强度信号, 这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化, 从而得到一条荧光扩增曲线 一般而言, 荧光扩增曲线可以分成三个阶段 : 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段和平台期 ( 图 3) 在荧光背景信号阶段, 扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖, 我们无法判断产物量的变化 而在平台期, 扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系, 所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数 只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系, 我们可以选择在这个阶段进行定量分析 图 3 qpcr 扩增曲线 qpcr 方法包括染料法和探针法, 本试剂盒采用 Taqman 探针法 Taqman 探针法含一条特异性探针序列, 该探针包括 5' 端的报告基团和 3' 端的淬灭基团, 其工作原理如图 3 所示 3.3 检测方法发展趋势 32 杂交法可以序列特异性地检测目标 DNA, 但 P 标记的探针因为存在半衰期短 放射等问题, 实际应用并不广泛 荧光标记的探针如果采用仪器读取信号, 杂交法理论上可以达到定量检测要求的灵敏度, 但是检测时间需要 48 小时 阈值法因为是采用 DNA 抗体的非特异序列免疫检测技术, 不能特异性识别宿主残留 DNA 序列, 且容易受到环境和操作人员的 DNA 污染, 导致读值偏高 qpcr 法具有序列特异性, 灵敏度 准确 7
10 度 精密度都好, 还可以高通量筛选, 但开发一个合格的 qpcr 试剂检测宿主残留 DNA 并不是件容易的事情 有人会提出疑问, 终产品中应该限定任何物种的 DNA 残余以确保安全性, 所以阈值法是不是最合理的分析方法? 这里还需要强调一下宿主残余 DNA 检测的目的 :1. 确认纯化工艺合理, 能有效去除宿主 DNA 残余 ;2. 确认产品中杂质含量符合标准要求 非特异性的 DNA 检测结果不能区分究竟是生产中污染 检测污染 或是工艺缺陷引起的 DNA 残余, 就无法为解决方案提供有效信息 在严格的生产体系中, 残留 DNA 检测是解决工艺合理性问题, 任何外源污染问题都归 SOP 或 GMP 管理体系解决 最后, 经典的残留 DNA 检测方法灵敏度不同,qPCR 法 DNA 结合法 杂交法的检测限分别达到 <1 3 6pg/ 样品的水平 ( 目前 qpcr 法灵敏度可达 10fg, 表 4), 但是技术上限制, 要求待测 DNA 片段分别不能小于 bp 才能用于杂交法 qpcr 法 阈值法检测, 而 WHO 和 FDA 可接受的 DNA 限度内的片段长度 <200bp 由此可见, 这三种方法中,qPCR 法的适用性和技术指标最好 从 qpcr 技术原理来看,Taqman 法要优于荧光染料随机掺入的 SYBR Green 法 正如前面介绍的 USP 修订内容, 经过几年来对三种检测方法的系统研究和应用反馈, 美国药典将会在新版药典中唯一推荐 qpcr 法作为生物制品残留 DNA 检测的标准方法 在不久的将来, 我国药典也将列出 qpcr 法检测 rdna 2015 年 3 月底, 中国食品药品检定研究院网站的国家药品标准物质目录中已经增加了一个编号为 的产品 : CHO 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒 (PCR- 荧光探针法 ) 表 4 残余 DNA 不同检测方法比较 杂交法 阈值法 荧光染料 (PicoGreen) qpcr 法 最小序列长 (bp) 抗干扰性 结果重现性 所需时间 ( 小时 ) 检测范围 3.4 样品前处理方法 ng (10-6 ~10-9 ) pg (10-11 ~10-12 ) ng-pg fg (10-7 ~10-11 )(10-6 ~10-15 ) 待检测 rdna 的生物制品样本除成品, 还包括中间品等, 其样本中除 rdna 外, 还有很多其他成分, 如高浓度的蛋白 多糖等, 都会影响后续检测, 因此如 8
11 何进行样本前处理以稳定高效获取样本中的微量 DNA 是非常关键的步骤 目前主要有酚 / 氯仿法 碘化纳沉淀法 柱提取法及磁珠法 酚 / 氯仿法是实验室常用方法, 获得的 DNA 纯度高 含量多, 但耗时长 步骤繁琐 残留的有机溶剂对 DNA 聚合酶有抑制作用且有损操作者健康 ; 碘化纳沉淀法操作简单, 但是时间长,DNA 易丢失, 回收率不稳定等 ; 柱提取法简单 快速, 但获得的 DNA 纯度不高, 且每批次膜柱的回收效率不稳定, 批间差大 ; 磁珠法简单 快速 可实现自动化高通量操作 且得到 DNA 纯度高, 是比较理想的 rdna 提取方法 根据最新版 USP 中对 qpcr 法检测 rdna 的相关要求,rDNA 的提取纯化回收效率的要求为 50~ 150% 3.5 SHENTEK rdna 检测试剂盒介绍 本试剂盒采用基于 Taqman 探针的 qpcr 方法, 与现行美国药典建议的检测方法同步, 包括样本前处理试剂盒和检测试剂盒 rdna 检测需对 mg 级样本中 pg 水平的 DNA 进行准确定量 样本本身, 无论是蛋白还是其他化学成分, 都可能产生基质效应, 从而影响检测过程, 因此需进行前期处理, 去除样本中其他物质干扰 样本前处理试剂盒采用磁珠吸附方法对各种生物制品样本进行处理, 去除样本中的蛋白质 盐类 缓冲液等杂质, 从而获得样本中残留的微量宿主 DNA 样本提取可能会引起残留 DNA 不完全回收或引入环境中外源性 DNA, 因此除操作格外注意外, 还需增加回收率试验进行评价检测 试剂盒采用 qpcr 方法进行, 通过特异性探针和引物, 对提取的宿主细胞 rdna 含量进行定量检测 4. 标准术语 4.1 DNA 脱氧核糖核酸的简称, 又称去氧核糖核酸, 是染色体的主要化学成分, 同时也是组成基因的材料 4.2 基因 9
12 是遗传物质的最小功能单位, 是指具有一定生物学意义的一段 DNA 4.3 聚合酶链反应 (PCR) 是一种体外扩增特异 DNA 片段的技术 利用 DNA 在体外摄氏高温时变性会变成单链, 低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合, 再调温度至 DNA 聚合酶最适反应温度,DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖 (5'-3') 的方向合成互补链 4.4 qpcr 全名 Real-time Quantitative PCR Detecting System, 即实时荧光定量核酸扩增检测系统, 是通过实时检测 PCR 每一个循环扩增产物相对应的荧光信号, 来实现对起始模板进行定量及定性分析 4.5 绝对定量绝对定量是利用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的 DNA 含量 4.6 基线 PCR 的最初几次循环, 在此基线上荧光信号几乎没有变化, 一般以 PCR 反应前 15 个循环的荧光信号作为本底信号 4.7 阳性参比荧光一种荧光, 其本身产生一种内部荧光, 通过参比这种荧光, 在数据分析期间对报告基团信号进行标准化 标准化对于纠正由于浓度或体积发生改变而引起的荧光波动现象是必须的 4.8 校正后报告荧光强度 (Rn) 与阳性参比荧光信号强度相比较的报告基团荧光信号强度 4.9 Delta Rn( Rn) 在给定的一组 PCR 条件下所生成信号的量值 ( Rn= Rn - 基线 ) 4.10 阈值 Delta Rn ( 校正后报告荧光强度 ) 的一个值 由 SDS 软件自动确定或手动设置 用于在实时实验分析中确定 CT 值 此阈值应设置为高于基线, 但应足够地低, 使其控制在扩增曲线的指数增长阶段范围之内 阈值线与扩增曲线的交叉点确定 CT 值 10
13 4.11 阈值循环 (CT) 荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数 4.12 无模板对照 (NTC) 不包含模板的样本 用于验证扩增量 4.13 模板需要确定是否含有或其数量为多少的核苷酸序列 4.14 报告基团此荧光加在 TaqMan 探针的 5' 端 它发出的荧光信号作为特异性扩增的指示物 4.15 标准样本已知量的样本, 用于构建标准曲线 4.16 未知样本包含要测定的模板的样本, 模板的量未知 4.17 准确性指测定值与真实值或认可的参考值的一致性或接近程度 4.18 精密度指在规定条件下对均质供试品多次取样进行一系列检测结果的接近程度, 一般表示为变异系数 (CV%), 变异系数即是测定值的标准差和测定值均数的比值 4.19 重复性是指在同样的操作条件下, 在较短时间间隔的精密度 4.20 中间精密度是指在试验室内部条件改变, 如不同日期 不同分析者 不同仪器 不同批号或来源的实验材料等情况下的精密度 4.21 重现性是指不同实验室间的精密度, 需通过多个实验室之间的协作研究得到 当分析方法将被法定标准采用时, 应进行重现性试验 4.22 耐用性 11
14 指试验参数被有意进行微小改变时, 测量结果不受影响的能力, 用于说明通常使用条件下该分析方法的可靠性 4.23 线性在给定的范围内检测结果与供试品中被分析物的成比例关系 4.24 范围是能达到一定的准确性 精密度和线性时被分析物的较高和较低浓度 ( 量 ) 的一个区间 4.25 专属性指当制品中含有其它组分, 如杂质 降解物 添加物 ( 如缓冲液 赋形剂 稳定剂 ) 等存在时, 准确可靠测定供试品的能力 4.26 检测限度指供试品中的被分析物能够被检测到的最低量, 但不一定要准确定量 4.27 定量限度指准确性和精密度都能达到要求时能够定量测定供试品中被分析物的最低量 5. rdna 样本 5.1 典型取样点 生物制药生产中 DNA 残留检测的取样点主要是从收集目标物开始, 到不同的纯化 工艺, 乃至最后的成品 一般在 DNA 去除工艺研究和过程验证上, 会在从收集细胞到 成品的每个处理过程的前端取样进行 DNA 残留检测 12
15 图 4 生物制药生产工艺中的杂质分析 5.2 样本运送和保存 样品收集好后如果不直接检测可放入 -20 冰箱保存 需要转送的样本 : 实验室应建立详细的样本运送标准操作规程 (SOP), 要求物流人员填写相关运送记录, 确保样品运送过程的可控性, 样本放在冰袋中运送, 以保证微量的 DNA 不会被降解 6. rdna qpcr 检测实验 宿主细胞 rdna 检测分析中质量控制内容包括 : 实验室设计的要求 ; 检测方法及流程 ; 仪器设备的使用 维护与校准 ; 人员培训 ; 确认检测结果的可靠性 实验室应制定室内质量控制操作程序 (SOP) 和参加室间质评或实验室间比对 6.1 实验要求 场地要求宿主细胞 rdna 检测受环境因素影响大, 因此 rdna 检测实验室一定要远离生产车间, 有条件的企业应将实验室设置在与车间不在一幢楼内 可选择使用 40m 2 左右实验室, 配备独立空调及 2 台超净台 ( 一台用于标曲配制 一台用于反应液配制,2 者尽量分开距离 ), 实验室内划分成 4 块区域 标曲配制区 样品前处理区 反应液配置区和模板加样区, 并尽量远离出风口,PCR 反应区设置在单独房间内并配备独立空调 rdna qpcr 检测所需材料 13
16 生物制品中 rdna 残留极低, 其要求精度高, 推荐在进行 rdna 检测实验中所使用 到的如移液枪头 EP 管等一次性耗材为低吸附的,qPCR 仪和移液器需定期进行校准 表 5 检测所需设备 设备名称 要求 定量 PCR 仪 1 台, 带分析软件 电脑 恒温金属浴 1 台 漩涡振荡器 1 台 微型离心机 1 台 低温冰箱 1 台 超微量分光光度计 1 台 单道可调移液器 1-10μl,10-100μl,20-200μl, μl, 各 1 支推荐使用电动移液器 磁力架 1 个 4 度冰箱 1 台 高压灭菌锅 1 台 电热鼓风烘箱 1 台 超净台 2 台 表 6 检测常用耗材 名称 规格 备注 PCR 八连管八连管平盖 96 孔 PCR 板封板膜 EP 管 1.5ml 低吸附 滤芯枪头 10μl,200μl,1000μl 低吸附 表 7 检测所需常用试剂 类别 货号 备注 宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒 SK030203D100 疫苗制剂宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒 SK030206DM50 适用于疫苗等产品检测 CHO 残留 DNA 检测试剂盒 SK030201C100 E.coli 残留 DNA 检测试剂盒 SK030202E100 Vero 残留 DNA 检测试剂盒 SK030204V100 毕赤酵母残留 DNA 检测试剂盒 SK030205P100 人源细胞残留 DNA 检测试剂盒 SK030207H100 无水乙醇 ( 分析纯 ) 异丙醇 ( 分析纯 ) 14
17 6.1.3 检测人员要求 rdna qpcr 检测人员需要为生物技术专业或相关专业毕业, 并可根据企业的样本建立企业内部质控样本库 ; 实验人员应了解 qpcr 技术或经过 PCR 技术培训 ; 对于新进实验人员, 应在具有 rdna qpcr 技术合格的人员指导下进行实验工作, 并进行考核培训, 包括批内和批间质控评测 6.2 rdna 检测试验流程 图 5 rdna 检测流程图 15
18 6.3 样本准备 待检测 rdna 的样本可能是高纯度的蛋白, 也可能是含有其他成分的化学品, 其要求的 rdna 定量分析含量极低 根据国家药监局 WHO FDA 等的规定, 生物制品中 DNA 的残余量一般在 100pg/dose 这意味着要在 mg 级的产品中分析 pg 级的残留量 对这样的样本进行 rdna 的检测分析, 需要一个有效的稳定的样本前处理, 能够使 rdna 从这样复杂的一个样本基质中释放出来, 并能够富集 DNA 以提高检测灵敏度 综合考量各方面要求, 推荐使用磁珠法 磁珠法简单 快速 可实现自动化高通量操作 且得到 DNA 纯度高, 是比较理想的 rdna 提取方法 更重要是对于 rdna 的提取纯化回收效率的要求为 50~150%, 包括批内和批间实验 磁珠法能够满足微量 rdna 的提取要求 进行磁珠法提纯 rdna, 则需要在样本准备前对待处理样本的背景有所了解, 如离子浓度 ph 值 蛋白浓度 缓冲体系等 如果待检测样本是生物制品纯化过程中的上游中间样本, 可能含有较高的 DNA 含量 为了保证检测的准确性, 使样本的检测值在标准曲线线性范围之内, 可以用灭菌超纯水对高 DNA 含量样本进行适当比例的稀释后再进行样本纯化处理 ; 也可以在样本纯化处理完成之后, 用稀释液对纯化处理后的样本进行稀释, 然后再进行 DNA 残留检测 一般可考虑将高 DNA 含量样本稀释 100 倍或 1000 倍 若样本为干粉状态, 可以用稀释液将干粉样本进行溶解, 再进行下一步操作 ; 或先用适当的试剂将干粉样本溶解, 配成高浓度溶液, 再用稀释液稀释后, 进行下一步操作 一般可考虑将干粉样本稀释成 10mg/ml 或 100mg/ml ph 值要求 : 一般情况下生物制品纯化过程中间样本的 ph 值均为中性, 若样本的 ph<5 或者 ph>9, 则会影响样本纯化处理效果 因此可以用 1M 的盐酸或氢氧化钠调整样本的 ph 至中性后 (ph6.0~8.0) 再进行纯化操作 盐离子浓度要求 : 若样本中盐离子浓度过低, 可使用 5M 的 NaCl 进行调节, 保证样本中盐离子浓度在 0.5M 左右, 否则会影响样本纯化处理效果 16
19 6.4 rdna qpcr 检测数据分析 : 下图显示了一个有代表性的扩增图谱, 其中包括 qpcr 中定义的一些术语 图 6 扩增图谱及术语 rdna qpcr 参数绝对定量结果评价指标包括相关系数 R 2 标准曲线斜率(Slope) 扩增效率(E) 和回收率 利用线性回归方法确定循环数 (Ct) 与试验样品 DNA 量 (log10) 之间的线性关系 通过回归方程计算参数 ( 斜率, 截距以及相关系数 ): y a bx y 是样本 y(ct) 平均值, x 是 x 值 (log10[fg]) 的平均值,a 是 y- 截距,b 是斜率 斜率 (b) 和 y- 截距 (a) 计算如下 : ( x b 1 x)( y ( x 1 1 y) ( x 2 x) ( xn n x)( y x) 2 n y) a y bx 见表 8: 斜率要求在 -3.6~-3.1 之间 E= 10-1/Slope -1,qPCR 扩增效率允许范围为 90%-110%, 斜率与扩增效率换算值 17
20 含量 表 8 斜率与扩增效率换算表 Slope Efficiency % % % % R 2 是评估 qpcr 效率的关键参数,R 2 等于 1, 说明可以用 CT 值来准确预测样品 DNA 相关系数 r 如下计算 : r ( x 1 ( x x) 2 1 x)( y 1 ( x y) ( x n x) 2 ( y 1 n y) x)( y 2 n y) ( y n y) y 是样本 y(ct) 的平均值, x 是 x 值 (log10[fg]) 的平均值 相关系数的绝对值一般要求 回收率和结果计算 回收率 (%)=( 加标样品测定值 - 样品测定值 )/DNA 标准品理论值 100% 新版美国 药典允许回收率范围为 50%~150% 标曲赋值 3000pg/10ul,300pg/10ul,30pg/10ul,3pg/10ul,0.3pg/10ul,0.03pg/10ul, rdna 检测结果计算 :DNA 的浓度 (pg/ml)=10 (Ct-b)/m 50 其中 Ct 为达到阈值的循环数,m 和 b 为标准品曲线的斜率和 y 轴截距 rdna qpcr 检测结果判定参数 rdna 结果分析参数包括标准曲线相关系数 R 2 扩增效率 复孔间 CV 值 样品回 收率以及阴性质控品和无模板对照 CT 值, 要求如下表 : 表 9 rdna qpcr 检测结果判定标准 参数 要求 R 扩增效率 90%-110% CV <15% 样品回收率 50%~150% 阴性质控品 CT 值 至少在标曲定量限后 2 个循环 无模板对照 CT 值 >35 18
21 7. rdna 检测方法学验证 方法学验证是对测定方法的评价, 证明采用的方法适合于相应检测要求, 具有相当的准确性和可靠性, 进而可以达到控制产品质量的目的 只有经过验证的分析方法才能用于控制产品质量, 因此方法验证是制定质量标准的基础 7.1 验证项目质控分析方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的专属性 准确性 精密度 线性 范围 检测限度 定量限度 耐用性等几个指标中的一个或几个, 用于不同检测目的的试验方法需进行不同参数的测定, 下表为各种检测方法通常需测定的参数 : 表 10 不同检测方法的方法学验证指标 分析方法 参数 鉴别试验 定量 杂质检查 限度 生物活性 ( 效 价 ) 测定 含量测定 准确性 精密度 耐用性 线性 范围 专属性 检测限度 定量限度 注 :- 表示通常不需测定的参数,+ 表示通常需测定的参数 宿主细胞 rdna 检测属于对生物制品中的杂质定量检测, 其方法学验证指标为准确性 精密 度 耐用性 线性 范围 专属性和定量限度等 7.2 分类 全面验证 对于新药的分析方法及首次建立的分析方法需进行全面分析方法的验证 19
22 7.2.2 部分验证已经经过验证的分析方法变更时可考虑做部分分析方法的验证, 部分验证的内容可以根据分析方法变更的程度从只进行日内精密度和准确度的考察到接近全面的分析方法的考察 部分验证常见于方法转移 ( 人或实验室 ) 检测方法改变( 如仪器改变 ) 样品基质变化 同一基质不同种属变化 相关线性浓度范围变化等 因此企业首次采用商业试剂盒检测或样品基质改变需进行部分方法学验证, 以确定该试剂盒适用于企业样品 交叉验证数据从相同或不同研究中的不同方法中获得, 或数据从不同实验室的相同研究方法中获得, 需要对这些数据进行比较, 并进行交叉验证 下表为方法学验证内容对比 : 表 11 方法学验证实验内容对比 性能检测指标实验内容企业方法 商业试剂 +USP 中检院 试剂盒 线性范围 定量检测范围 - 参考品溯源 自制内部参考品定量 - 准确度 检测国家标准品 - 精密度 实验批间差 特异性 Human mouse rat E. coli DNA 干扰 - - 不同浓度 DNA 回收率 加样回收率 不同基质中的回收率 不同 PH 值样本回收率 /- /- - 不同生产节点的实际样品回收率 - 与同类试剂盒对比纯化回收性能 /- - - 对比实验 与同类试剂盒对比检测性能 /- - - 实际样本检测性能对比实验 /- - - 多种 qpcr 仪器适用性 /- - - 适用性能 DNA 碎片化的影响 - - 高蛋白 高盐 低 PH 值等样本 /- /- - 20
23 蛋白降解效率蛋白酶 K 消化中间品 - 检测试剂可反复冻融 - 稳定性 40 加速稳定性 个月成品稳定性 - - 时间 建立方法 >12m 3m 0m 验证可靠性 >3m 1-3m 5d : 必须做 /- : 选择做 : 不必做 m : 月 d : 天 7.3 方法学验证举例以 CHO 宿主细胞 DNA 残留检测试剂盒方法学验证为例 主要进行了以下验证 : 线性与范围按说明书方法稀释国标, 测定其对 CHO 细胞残留检测试剂的反应曲线, 分析曲线线性 试剂盒参考品标定以国家标准品作为标准品, 对试剂盒参考品进行标定测定, 比较国家标准品与内控参考品曲线的平行性, 试验中国家标准品与待测样品的精密度与准确度均应符合相关要求 准确度以试剂盒参考品为标准品, 对已知浓度国家标准品进行 DNA 测定, 分析测定结果的平均值 比较检测值和已知值得出检测准确度 精密度检测试剂盒重复性 中间精密度及重现性 特异性梯度稀释试剂盒参考品绘制标准曲线, 同时平行制备一组含有干扰基因的标准曲线进行对比, 检测拟合后曲线的重合性 定量限用试剂盒给出的线性范围中最低浓度作为定量限, 进行 10 次重复检测, 分析检测结果 回收率 21
24 检测不同浓度 DNA 的回收率 不同基质回收率 不同 ph 值样本回收率 不同生产中间样本回收率 稳定性测试检测试剂的反复冻融稳定性 前处理试剂的加速稳定性及检测试剂盒的长期稳定性 适用性测试试剂盒在不同型号仪器上的适用性及不同 DNA 片段大小对检测的影响 7.4 特定样品的方法学验证 采用 SHENTEK rdna 检测试剂盒验证特定样品的适用性, 可采用如下验证方案 : 表 12. 样品适用性验证方案 项目 实验方案 检测样品中 r DNA 残留量, 据此确定高中低 3 个加标量 ( 最低加标量比样品残留量高一个数量级 ) 设置如下 4 组 : 日间精密 度 样品组 样品 +DNA 1 组 ( 高 ) 样品 +DNA 2 组 ( 中 ) 精密 度 样品 +DNA 3 组 ( 低 ) 纯化回收,PCR 检测, 不同时间检测 3 次 ( 需 2~3 人 完成 ), 计算 CV 值 设置 2 组 : 样品组 重复性 样品 + DNA 2 组 ( 中 ) 纯化回收,PCR 检测, 计算 CV 值 ( 检测时做 6 个 重复 ) 回收 率 根据样品中 DNA 残留量, 设置 3 个加标量 设 置如下 4 组 : 22
25 样品组 样品 +DNA 1 组 ( 高 ) 样品 +DNA 2 组 ( 中 ) 样品 +DNA 3 组 ( 低 ) 纯化回收,PCR 检测, 计算回收率 8. 注意事项 8.1 定量 PCR 仪的开关机顺序按照正确的开关机顺序操作, 有助于延长仪器的使用寿命, 减少仪器出故障的频率 开机顺序 : 先开电脑, 待电脑完全启动后再开启定量 PCR 仪主机, 等定量 PCR 仪主机面板上的绿灯亮后即可放入 qpcr 管, 打开定量 PCR 的收集软件, 设置参数进行实验 关机顺序 : 确认实验已经结束后, 首先关闭定量 PCR 仪主机的电源, 接着可在信号收集软件上分析实验结果, 然后关掉信号收集软件, 最后关闭电脑 8.2 定量 PCR 仪反应管放置问题使用单管或 8 连管做实验, 并且样本数量不多的时候, 建议在样品加热块上对称地安放样品, 最好是纵向放置, 并且优先放在靠中间的第 6 列或第 7 列, 然后逐渐向两边放置 这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜, 各个反应管的受力和受热都比较均匀, 提高孔与孔之间的数据精密性 8.3 防止 PCR 污染 1) 实验时穿实验服并戴口罩, 勤换手套 ; 2) 使用带滤芯移液枪头和灭菌 ep 管, 每次实验尽量更换新的枪头和 ep 管 ; 3) 分区操作 : 标曲配置区 样品前处理区 反应液配置区 模板加样区和 PCR 反应区,PCR 反应区需设置在单独房间内, 尽量远离生产车间或 DNA 提取实验室 每个区分别配备移液枪, 勿交叉使用, 其中模板加样区需配备 2 把移液枪, 一把用于阴性质控和无模板对照孔加样, 一把用于检测样本模板加样 ; 4) 实验前整理操作环境, 有条件的进行消毒, 尽量防止空气流通 ; 23
26 5) 空调必须开启时, 可在实验开始前先开启空调预冷实验室, 待进行实验时, 将空调风速调至最低并尽量远离出风口操作 ; 6) 实验过程中先准备阴性对照管 样品管并盖紧管盖, 最后准备阳性对照管 ; 7) 勿将扩增产物带至 PCR 反应液配制区 ; 8) 实验结束后清理桌面, 可以用 DNA 清除剂清理环境 8.4 标准品稀释为节省时间, 标准品稀释可在样本消化的等候时间内准备, 并存放于 蛋白酶 K 用量建议表 13 蛋白酶 K 用量建议 蛋白浓度 (mg/ml) 建议加入蛋白酶 K 量 /ul 100~ ul ul 9. 常见问题 9.1 标准曲线线性关系不佳 1) 参考品稀释操作有误, 使参考品不呈梯度 ; 2) 标准品出现降解或受到污染, 应避免标准品反复冻融和被其他试剂污染 ; 9.2 扩增效率异常 1) 注意各试剂成份的储存温度, 收到货后及时按要求进行储存 ; 2) 分析参数设置不合适, 说明书中参数设置适用于 ABI 7500 qpcr 仪 ; 若检测机型不同, 应相应调整 threshold 至合适的位置 ; 3) 参考品稀释不准确 ; 4) 反应体系中有 PCR 反应抑制物, 一般是加入模板时所引入, 应先把模板适度稀释, 再加入反应体系中, 减少抑制物的影响 9.3 无模板对照 NTC 或阴性质控 NCS 的检测值不为 Undetermined 或 Ct 值 <35 请参照 8.3 防止 PCR 污染 NCS Ct 值至少控制在定量限后 2 个循环左右 9.4 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线判断曲线是否正常的标准为扩增效率在 90%~110% 之间,R , 灵敏度 特 24
27 异性等符合试剂盒标准 同一试剂在不同仪器上有可能产生不同的扩增曲线 9.5 qpcr 重复性问题加样时, 重复孔操作尽量一致 建议使用电动分液器, 提高重复性 9.6 荧光定量 PCR 模板未扩增标准当进入对数期的循环数大于 35 个时, 荧光定量 PCR 检测无效, 可认为没有扩增 ; 当进入对数的循环数在 个循环时, 需要有至少 3 个重复, 并与参考品比对才能判断是否有扩增 9.7 样本纯化回收率异常 1) 洗涤液 A 中未加入乙醇 ; 2) 样本 ERC 中添加的 DNA 量不准确 ; 3) 洗脱时磁珠附着于管壁, 洗脱液与磁珠未能充分混匀或洗涤后磁珠干燥时间过长, 导致磁珠难以洗脱 ; 4) 磁珠吸附力下降, 建议预先分装磁珠 ; 5) 样本盐离子浓度低或 ph 不合适, 建议调节盐离子浓度和 ph 值 ; 6) 样本中蛋白含量太高, 对样本进行适当稀释或增加蛋白酶 K 用量 9.8 样品调 ph 值后出现絮状沉淀, 且蛋白酶 K 消化完成后仍有沉淀, 对检测结果是否有影响? 消化完成后仍有沉淀会影响后续的纯化过程, 进而影响实验结果, 因此建议将待检样品进行适当比例稀释或适当增加蛋白酶 K 后再进行纯化回收, 同时还需注意盐离子浓度, 如果离子浓度过低, 可用 5M NaCl 调节 10. 参考文献 1.WHO (1987) Acceptability of cell substrates for production of biologicals (World Health Organization, Geneva). 2.Lebron JA, et al. (2006) Adaptation of the WHO guideline for residual DNA in parenteral vaccines produced oncontinuouscell lines to a limit for oral vaccines. Dev Biol 123: WHO (1998) WHO Expert Committee on Biological Standardization. (World Health Organization, Geneva). 4.Champion K, Madden H, Dougherty J, Shacter E (2005) Defining your product profile and maintaining controlover it, part 2. BioProcess International 3(8):
28 5.Wang X, Hunter AK, Mozier NM (2009) Host Cell Proteins in Biologics Development: Identification,Quantitation and Risk Assessment. Biotechnology and Bioengineering 103(3): Peden K, Sheng L, Pal A, Lewis A (2004) Biological Activity of Residual Cell-Substrate DNA. Dev Biol 123: Li S, et al. (2008) Oncogenicity of DNA in vivo: Tumor induction with expression plasmids for activated H-ras andc-myc. Biologicals 36: Li S-F, Lewis AMJ, Peden K (2009) Quantitative determination of the infectivity of the proviral DNA of a retrovirusin vitro: Evaluation of methods for DNA inactivation. Biologicals 37: Suntharalingam G, et al. (2006) Cytokine storm in a Phase 1 trial of the anti-cd28 monoclonal antibody TGN1412.The New England Journal of Medicine 355(10): Cavagnaro JA (1995) Immunotoxicity assessment of biotechnology products: a regulatory point of view.toxicology 105: WHO (2011) Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture ofbiologicalmedicinal products and for the characterization of cell banks. Proposed replacement of TRS 878, Annex WHO (1997) Meeting Report WHO Study Group on Cell Substrates for Production of Biologicals 13.FDA (1997) Points to Consider in the Manufacturing and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use. 14.FDA (2010) Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other BiologicalMaterialsUsed in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications. 15.EMEA (1997) Position statement on DNA and host cell proteins (HCP) impurities, routine testing versus validation studies. 16.ICH Q6B (1999) Note for Guidance on specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Chapter 4.1.3: Purity and impurities 17.ICH Q 9 (2005) Quality Risk Management Step WHO (1998) Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals.world Health Organization (WHO) Technical Report. Series 878, Annex WHO (2007) Guidelines To Assure The Quality, Safety And Efficacy Of Live Attenuated Rotavirus Vaccines (Oral),World Health Organization (WHO) Technical Report Series 941, Annex Chu et al. industrial choices for protein production by large-scale cell culture. Cur. Opinion Biotechnology (2001),12: USP (2008) <1130> Nucleic Acid-Based Techniques-Approaches for Detecting Trace Nucleic Acids (Residual DNATesting) USP 31-NF 26, Second Supplement. 22.Klinman DM, Yamshchikov G, Ishigatsubo Y (1997) Contribution of CpG Motifs to the Immunogenicity of DNA Vaccines.The Journal of Immunology 158:
29 23.Kojima Y, et al. (2002) Adjuvant effect of multi-cpg motifs on an HIV-1 DNA vaccine. Vaccine 20: cFDA, 2007: 生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则 25. 中国药典 (2015 年版 ): 生物样品定量分析方法验证指导原则 26.FDA, 2015: Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs andbiologics, Guidance for Industry 27.ICH, 2005: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology 技术服务咨询 : 电话 : Info@nhc.ac.cn 27
材料 方法
生物技术通报 姜燕 采用鼠抗人血红蛋白 单克隆抗体 和胶体金标记鼠抗人血红蛋白 单克隆抗体 及对照抗体羊抗鼠 利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原 在 内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克 隆一步法胶体金检测试卡 用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病 应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白 抗 体 方法检测 效价 免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡 法检测 效价的结果显示 鼠抗人
材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析
生物技术通报 黄艳燕 黄靖华 卢福芝 孙靓 彭立新 周兴 黄日波 利用 的方法从鼠李糖乳杆菌基因组 中扩增到 乳酸脱氢酶基因 并连接到载体 上 构建表达质粒 将重组质粒 转化大肠杆菌 重组菌株经 诱导表达 电泳分 析表明 在大肠杆菌中实现了表达 表达产物的分子量约为 同时采用紫外分光光度法测定 乳酸脱氢酶的酶活 测得重组菌株的 乳酸脱氢酶活力为 最适反应温度为 最适 乳酸脱氢酶 克隆 表达 鼠李糖乳杆菌
124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na
![124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na](/thumbs/91/105785327.jpg "124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na")
河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖 与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,
王军淋 等 超高效液相色谱 大体积流通池荧光法检测奶及奶制品中的黄曲霉毒素 Ｍ １ 第２期 １９５ 左 １ 为国标法 经典提取法 提取 其余为乙腈法提取 从左到右依次为 ｍ 牛奶 Ｖ 乙腈 １ ０ １ １ １ ２ １ ３ １ ４ １ ５ Ｔ ｈｅ ｌｅｆ ｔ ｏｎｅ ｗ ａｓ ｅｘ ｔ ｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｅｘ ｔｒａｃｔｉｏｎ
材料 方法
生物技术通报 张发洲 杨慧兰 为了构建单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽 真核表达质粒 应用 技术从 株 的基因组中扩增 基因 并连接至真核表达载体 对阳性克隆进行菌落 酶切和测序鉴定后 成功构建了重 组质粒 用 转染试剂盒将重组质粒 转染至 细胞中 并用 及 检测其表达情况 结果显示 基因在 细胞中得到正确表达 真核表达质粒 的构建成功 为进 一步研究 对宿主细胞的影响奠定了基础 单纯疱疹病毒 型 感染细胞多肽
幻灯片 1
碧云天定量 PCR 技术服务 Real-time PCR Services by Beyotime 碧云天网站 微信公众号 碧云天生物技术 /Beyotime Biotechnology 订购热线 :400-168-3301 或 800-8283301 技术咨询 :info@beyotime.com 技术服务 :service@beyotime.com 网址 :http://www.beyotime.com
g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min
25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.
福建农业学报 材料与方法 试验菌株 引物 主要仪器 主要试剂 细菌培养 模板的制备 反应条件 扩增产物的检测 特异性试验 敏感性试验 分离菌株检测 产物的克隆及序列测定 结果与分析
未命名-1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ss a c y e vg 13 14 15 16 17 18 19 H 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 发现生命的螺旋 克里克在提出 中心法则 时曾指出 遗传信息是沿 Ｄ Ｎ Ａ - Ｒ Ｎ Ａ - 蛋白质的方向流动的 遗传信息不可能从 Ｒ Ｎ Ａ 回到 Ｄ Ｎ
第 期 黄雪莲等 响应面优化绿色木霉菌培养基 材料与方法 菌种 仪器与试剂 菌种的活化 单因素试验 响应面优化试验 优化工艺的验证 数据处理 结果与分析
第 卷第 期 年 月 食品与生物技术学报 响应面优化绿色木霉菌培养基 黄雪莲 于新 仲恺农业工程学院轻工食品学院 广东广州 利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化 通过测量不同营养条件下绿色木霉 菌落生长直径研究其生物学特性 在单因素实验的基础上 选定葡萄糖添加量 丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量 个因素进行中心组合实验 建立二次回归方程 并应用响应面分析法进行优化 结果表明 绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖
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疑 似 狂 犬 病 動 物 抓 咬 傷 臨 床 處 置 指 引 衛 生 福 利 部 疾 病 管 制 署 2015 年 1 月 13 日 1 一 傷 口 清 潔 : 立 即 及 徹 底 的 以 肥 皂 及 大 量 水 清 洗 沖 洗 傷 口 15 分 鐘, 再 以 優 碘 或 70% 酒 精 消 毒 二 傷 口 處 理 : ( 一 ) 如 果 可 能 的 話, 避 免 縫 合 傷 口, 如 須 縫 合,
2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告
PCR PCR PCR RT-PCR PCR (Polymerase Chain Reaction,PCR) 80 DNA, DNA PCR PCR PCR DNA PCR -- -- DNA DNA 93 DNA PCR DNA DNA ( ) DNA 55 DNA DNA -- TaqDNA dntp DNA -- -- PCR PCR DNA DNA Y (1 X) n Y DNA X (Y)
材料导报 研究篇 年 月 下 第 卷第 期 种球的制备 单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球 洗脱处理 种子溶胀聚合机理 种球用量的影响
水相中 组氨酸单分散分子印迹聚合物微球的合成 表征及其识别性能研究 李思平等 李思平 徐伟箭 较佳工艺条件下 在水性体系中选用无皂乳液聚合法制得的单分散微米级聚苯乙烯微球为种球 分别以组氨酸 甲基丙烯酸 或丙烯酸胺 乙二醇二甲基丙烯酸酯 为模板分子 功能单体和交联剂 合成了 组氨酸分子印迹聚合物微球 研究了形貌 粒径及其分布以及模板分子与功能单体之间的相互作用 分别以 激光粒度分析仪紫外分光光度法和红外光谱表征功能单体与交联剂之间的共聚情况
892213E006146
Modular Design of Quality Control Systems NSC89-2213-E006-146 89 8 1 90 7 31 ( ) ISO14000, and OHSAS18000. Keywords: ISO9000; ISO14000; OHSAS18000; Quality ISO9000 ISO14000 OHSAS18000 Management; Environment
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附 表 一 : 统 一 定 价 药 品 表 金 额 : 元 定 价 目 1 293 追 风 透 骨 片 48 片 追 风 透 骨 片 24 片 追 风 透 骨 片 24 片 ( 薄 膜 追 风 透 骨 片 48 片 ( 薄 膜 ( 瓶 ) 30.0 * ( 瓶 ) 15.4 ( 瓶 ) 16.9 ( 瓶 ) 33.0 追 风 透 骨 丸 水 蜜 丸 6g 袋 1.8 * 追 风 透 骨 丸 水 蜜
吸入制剂质量控制研究技术指导原则
指 导 原 则 编 号 : H G P H 9-1 吸 入 制 剂 质 量 控 制 研 究 技 术 指 导 原 则 二 〇 〇 七 年 九 月 目 录 一 概 述 2 二 吸 入 制 剂 的 分 类 3 三 质 量 控 制 研 究 3 ( 一 ) 吸 入 制 剂 质 量 控 制 的 主 要 指 标 和 参 数 3 ( 二 ) 气 雾 剂 4 ( 三 ) 喷 雾 剂 12 ( 四 ) 粉 雾 剂 14
第 二节. PCR 技术的原理与应 用
分子生物学技术的原理 及其应用 第 二节. PCR 技术的原理与应 用 Ø 提问 : 什么是聚合酶链式反应 (PCR)? 一种体外特异地扩增已知基因的 方法, 可将微量的 DNA 片段 大量扩增 ---- 在分 子 生物学领域中有 革命性的影响 PCR 发明之前 : 某 A 基因 2 万个基因 基因组 30 亿个碱基对 所有针对基因 A 的研究 工作都同时对 30 亿个碱基对进 行操作 研究 工作举步维艰
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2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Enabling Technologies Safety Assurance 2015 2016 2017 2018 2019 Future Forecast of Enabling Technologies Driver Acceptance of Automated Vehicle Systems
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已 有 国 家 标 准 化 学 药 品 研 究 技 术 指 导 原 则 目 录 一 前 言 2 二 已 有 国 家 标 准 药 品 研 究 的 基 本 原 则 2 ( 一 ) 安 全 有 效 和 质 量 可 控 原 则 2 ( 二 ) 等 同 性 原 则 3 ( 三 ) 仿 品 种 而 不 是 仿 标 准 原 则 5 三 质 量 控 制 研 究 6 ( 一 ) 原 料 药 制 备 工 艺 研 究 7
从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II
从 菜 鸟 到 高 手 - 手 把 手 教 你 qpcr 教 程 II --- 定 量 PCR 原 理 常 见 问 题 分 析 和 数 据 统 计 分 析 前 言 由 于 Real-time qpcr 的 众 多 优 点, 现 在 已 经 是 生 命 科 学 领 域 的 一 项 常 规 技 术 越 来 越 多 的 研 究 文 章 中 涉 及 RT-PCR 的 实 验, 也 基 本 上 被 real-time
荧光定量PCR
荧 光 定 量 PCR 荧 光 定 量 PCR 原 理 荧 光 定 量 PCR 最 早 称 TaqMan PCR, 后 来 也 叫 Real-Time PCR, 是 美 国 PE(Perkin Elmer) 公 司 1995 年 研 制 出 来 的 一 种 新 的 核 酸 定 量 技 术 该 技 术 是 在 常 规 PCR 基 础 上 加 入 荧 光 标 记 探 针 或 相 应 的 荧 光 染 料
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组织样本 mirna 提取细胞样本 mirna 提取全血样本 mirna 提取 TaqMan mirna 反转录试剂盒 通过 HG TaqMan mirna 定量 PCR 试剂盒检测 microrna 1-4 2 3 4 5-6 7-8 7 8 9 B1802 mirna 25T/100T 500/1600 B1803 mirna 25T/100T 500/1600 D1802 HG TaqMan
GE Healthcare 3 4 5 6 8 10 12 14 FDA ph 90% 70% DNA DNA Cytodex TM Baxter Biosciences 3 FDA EMEA cytodex 1 4400 cm 2 /g cytodex 1 25 g 17-0448-01 cytodex 1 100 g 17-0448-02 cytodex 1 500 g 17-0448-03 cytodex
白喉疫苗
白 喉 疫 苗 WHO 立 场 文 件 依 据 为 各 成 员 国 提 供 卫 生 政 策 方 面 指 导 意 见 这 一 职 责, 世 界 卫 生 组 织 (WHO) 就 预 防 具 有 全 球 公 共 卫 生 影 响 的 疾 病 的 疫 苗 及 联 合 疫 苗 问 题, 发 布 一 系 列 定 期 更 新 的 立 场 文 件 这 些 文 件 着 重 关 注 的 是 疫 苗 在 大 规 模 免 疫
measles vaccine
麻 疹 疫 苗 WHO 立 场 文 件 依 据 为 各 成 员 国 提 供 卫 生 政 策 方 面 指 导 意 见 这 一 职 责, 世 界 卫 生 组 织 (WHO) 就 预 防 具 有 全 球 公 共 卫 生 影 响 的 疾 病 的 疫 苗 及 联 合 疫 苗 问 题, 发 布 一 系 列 定 期 更 新 的 立 场 文 件 这 些 文 件 着 重 关 注 的 是 疫 苗 在 大 规 模 免 疫
图 对片剂累积释放度的影响
岳红坤 常明 游雅 邱树虹 王婧 乔宇 石家庄学院化工学院 河北石家庄 为筛选盐酸小檗碱胃漂浮片的处方并评价其漂浮和体外释放特性 根据辅料性质及制剂质量要求 通过单因素实验及正交试验确定影响盐酸小檗碱胃漂浮片性能的主要参数 确定了最优 处方 采用干粉直接压片制得盐酸小檗碱胃漂浮片 在人工胃液中考察其漂浮性能及溶出度 并用 紫外可见分光光度法检测其释药量 优选的处方为每片含 碳酸氢钠 羧甲基淀粉钠 聚乙二醇
结果与讨论
金青哲 谢 峰 丁志华 施峰华 王兴国 利用碳同位素比值法进行花生油和玉米油掺合物的检测研究 用气相色谱仪获得 转化途径 的玉米油和 转化途径的花生油的脂肪酸组成 再用气相色谱 燃烧 同位素比值质谱仪确定三种主要脂肪 酸 的 值 利用所测得的数据 构建了玉米油与花生油混合油中主要脂肪酸的 值 混合比例的标准曲线 结果表明 玉米油与花生油的 值差异很大 应用试验中将花生油与一种未知的其他植物油进行掺和
第 期 甘金华等 强力霉素人工抗原的合成与抗体制备 材料与方法 试剂及溶液
第 卷第 期 年 月 食品与生物技术学报 强力霉素人工抗原的合成与抗体制备 甘金华 邓薇 李进平 艾晓辉 中国水产科学研究院长江水产研究所 湖北荆州 武汉纺织大学环境与城建学院 湖北武汉 采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白 连接制备强力霉素 牛血清白蛋白 人工免疫抗原 并用同样方法将强力霉素与载体蛋白 连接制备人强力霉素 卵清白蛋白 人工包被抗原 经紫外扫描分析和动物免疫试验证实 强力霉素人工抗原合成成功
SO 2 g/kg 2.0 ppm 2
ISSN 0255-6162 GPN 2006900031 273 92 9 20 161-2 02 26531318 http://www.nlfd.gov.tw 1 SO 2 g/kg 2.0 ppm 2 (Center of Biological Evaluation and Research, FDA) 30 1991 FDA 91 10 30 Trend of Vaccine Development
福建农业学报 材料与方法 毒株 主要仪器 主要试剂 引物设计 的培养 反应条件的建立 荧光定量 检测临床样本 结果与分析
福建农业学报 林 甦 朱春华 陈 珍 刘斌琼 施少华 江 斌 蔡国漳 林 羽 黄 瑜 甦 男 硕士 助理研究员 主要从事病毒学和动物传染病学研究 福建农业学报 材料与方法 毒株 主要仪器 主要试剂 引物设计 的培养 反应条件的建立 荧光定量 检测临床样本 结果与分析 林 甦等 鸡 亚型白血病病毒荧光定量 检测方法的建立 福建农业学报 讨 论 林 甦等 鸡 亚型白血病病毒荧光定量 检测方法的建立 责任编辑
程汉良 夏德全 吴婷婷 孟学平 吉红九 董志国 陈淑吟 对文蛤 青蛤 硬壳蛤 江户布目蛤 薄片镜蛤 和菲律宾蛤仔 种帘蛤科贝类和 个地理种 群文蛤 大连 连云港 湛江 防城港 的细胞色素 氧化酶亚基 基因片段的核苷酸序列进行了分析 以探讨这一序列在种质鉴定 种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值 测序结果 表明 所有物种扩增片段长度均为 序列 含量 明显高于 含量 物种间共有变异位点 个 其中简约信息位点
吉林省科技发展计划项目申报书25847
项 目 领 域 : 人 才 团 队 负 责 人 : 承 担 项 目 名 称 : 申 报 主 持 单 位 ( 盖 章 ): 通 讯 地 址 : 制 造 装 备 医 药 卫 生 信 息 光 电 建 筑 与 环 保 节 能 与 新 能 源 新 材 料 农 林 水 类 现 代 服 务 业 其 它 杨 屹 生 物 反 应 器 规 模 化 培 养 及 冻 干 人 用 狂 犬 病 疫 苗 的 研 究 长 春 生
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USP 21 CFR Part 11 入 门 指 南 GxP cgmp PIC/S SOP www.agilent.com/chem/cn 安 捷 伦 科 技 版 权 所 有,2009 2009 年 1 月 1 日 中 国 印 刷 发 行 号 5990-3288CHCN 分 析 仪 器 验 证 和 系 统 认 证 ISO 17025 QA/QC GLP ICH FDA OECD GCP
北京赛迪传媒投资股份有限公司
证 券 代 码 :600881 证 券 简 称 : 亚 泰 集 团 公 告 编 号 : 临 2016-029 号 吉 林 亚 泰 ( 集 团 ) 股 份 有 限 公 司 2016 年 度 非 公 开 发 行 A 股 股 票 预 案 二 〇 一 六 年 四 月 发 行 人 声 明 1 本 公 司 董 事 会 及 全 体 董 事 保 证 本 非 公 开 发 行 A 股 股 票 预 案 不 存 在 任 何
不同基源石斛属 植物 不同来源商品石斛
徐蓓 杨莉 陈崇崇 王峥涛 徐珞珊 建立黄草类石斛的薄层色谱 定性鉴别方法 采用薄层色谱法 考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素 石斛酚 杓唇石斛素 和 三羟基 甲氧基联苄 的薄层色谱行为 对石斛药材进行定性鉴别 通过 种不同基源的石斛及 批商品石斛的薄层色谱鉴别 证明此方法专属性强 操作简单 重复性好 为石斛的鉴别提供了一种准确 有效的新方法 本方法可用于黄草类石斛的鉴别 为中药石斛的质量标准研究提供科学依据
中国科学技术大学 材料工程 05 校外调剂 0870 化学工程 吉林大学 应用化学 05 校外调剂 0870 化学工程 四川大学 制药
045700000787 东北大学 07030 分析化学 05 校外调剂 07030 无机化学 68 66 94 04 34 063700000004 沈阳药科大学 07030 分析化学 04 校内跨专业调剂 070303 有机化学 73 56 9 00 30 0007008903 北京大学 0780Z 药学类 05 校外调剂 070303 有机化学 75 67 09 8 4 085750830 苏州大学
材料 方法
生物技术通报 陆敏 许黎明 吴宏宇 张继恩 李国栋 黄青山 溶葡萄球菌酶 是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶 已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染 但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据 现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究 检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑 杀菌活性 结果显示 重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状
Microsoft Word - 终稿--Power qPCR PreMix.doc
Power qpcr PreMix(SYBR Green)User Manual 实时荧光定量试剂盒说明书 I. 试剂盒组成 产品组成 GK8020-200 20ul X 200 reactions GK8020-600 20ul X 600 reactions GK8020-1000 20ul X 1000 reactions 2 X Power qpcr PreMix (with SYBR Green
吉林大学学报 工学版 ２４４ 第 ４ 卷 复杂 鉴于本文篇幅所限 具体公式可详见参考文 献 ７ 每帧的动力学方程建立及其解算方法如图 ３ 所示 图４ 滚转角速度与输入量 η 随时间的变化波形 Ｆｉｇ ４ Ｗａｖｅｆｏｒｍ ｏｆ ｒｏｌｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｉｎｐｕｔ η ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ 图５ Ｆｉｇ ５ 滚转角随时间的变化波形 Ｗａｖｅｆｏｒｍ ｏｆ ｒｏｌｌ ａｎｇｌｅ ｗｉｔｈ
21 CFR 21 CFR (11.10(d) (i) (g) (b)) 21 CFR Botha Eloff IBM [1] 2
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FDA 21 CFR 11 Agilent OpenLAB CDS 2.1 (Code of Federal Regulations, CFR) 21 US FDA EU Eudralex 4 11 21 CFR 1997 1999 Agilent OpenLAB CDS 2.1 OpenLAB CDS LC GC LC/MS GC/MS A/D OpenLAB CDS OpenLAB CDS (SOP)
图 1 qrt-pcr 扩增曲线 在 PCR 扩增反应达到平台期前, 靶序列的扩增效率相对稳定, 原始模板以相对固定的指数形式增加 对于普通 PCR 来说, 产物在扩增过程中呈指数积累, 但是当产物积累到一定程度, 由于反应体系内引物,dNTPs 的消耗及酶活性的降低, 则进入了平台期 含量不同的起
qrt-pcr 的原理及应用 邹海玥 13 级生物基地班 201300140153 实时荧光定量 PCR 技术 (real-time fluorescent quantitative PCR, qrt-pcr) 是由美国 Applied Biosystems 公司于 1996 年推出的核酸定量技术, 由于它实现了从定性到定量的跨越, 且具有定量准确高的优点, 现已成为分子生物学研究和医学研究等领域的一种热门技术,
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RPC IEX (Sephadex LH2) 4 7 WTO 7 23 51 herbal 39%, 41% 163 32.2% 15 (29.6%)72 (14.1%) 78 (15.4%) 1 3-5% 1 5 FDA 2 Draft Guidance on Botanical Drug Product for Industry IIIII 9 21 8 1. 2. food supplement
第一章 图 １ １ 传染病的特征 ９ Ｔ ｈ１ Ｔ ｈ２ 细胞调节机制简图 正调节 负调节 细胞因子与细菌的相互作用机制目前尚未完全明了 有实验表明 细胞因子与细菌之间 存在有互利和互抑双重效应 例如 Ｔ Ｎ Ｆα 和 ＩＦＮγ 可抑制放线菌的生长而 ＩＬ ６ 的作用则 反之 ＩＬ １ ２ 和 ＧＭ ＣＳＦ 可促进某些致病性大肠杆菌生长而 ＩＬ １ｒａ 可抑制之 研究表 明 某些致病性大肠杆菌有与
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2
Custom gene qrt-pcr Quantitation Kit For the detection and quantification of mrnas using real-time RT-PCR detection instruments User Manual Version 1406 2 介绍 产品简介 本产品为客户提供了便捷, 准确的基因定量检测试剂, 此反应体系经精心优化,
DNA PCR 3 3. TaqMan 2 SYBR
PCR PCR 1996 Applied Biosystems PCR PCR PCR. PCR PCR PCR PCR 1. PCR Ct C Cycle t threshold Ct 1 1. Ct 2. threshold PCR 15 3-15 10 threshold = 10 SD cycle 6-15 3. Ct Ct 1 Ct Ct 2 Ct 2. 4. PCR 2 1 TaqMan
生物技术通报 改善食品原料品质 改良食品工业用菌种 生产酶制剂 改良食品加工性能 生产保健食品
生物技术通报 张占军 王富花 综述基因工程技术在改善食品原料品质 改良食品工业用菌种和食品加工性能 生产酶制剂和保健食品方面的应用 同时对转基因食品及其安全性问题进行了总结归纳 最后对基因工程技术在食品中的发展前景进行展望 基因工程 转基因食品 食品安全 应用 基因工程定义 发展 生物技术通报 改善食品原料品质 改良食品工业用菌种 生产酶制剂 改良食品加工性能 生产保健食品 食品检测 转基因食品定义
TAS - 990
TAS - 990 TAS -990 TAS -990 TAS -990 ＷＷＷ ＰＧＥＮＥＲＡＬ ＣＯＭ 优异的可扩展性 使您轻松应对多种分析需求 ＡＳＣ ９００ 原子吸收 火焰自动进样器 ＴＡＳ ９９０ 系列原子吸收分光光度计火 焰法检测专用自动进样附件主要功 能 自动清洗 校零 自动进样 ６０个样 品杯 ８ 个标样杯 ＡＳＣ ９００ 石墨炉 自动控温 自动进样器 冷却循环水装置 ＴＡＳ ９９０系列原子吸收分光光度计石
生命科学研究 房 蓓 武泰存 王景安 以玉米沈单 号为材料 用溶液培养的方法研究了缺锌 低锌和正常供锌对玉米生长发育的影响 进一步明确了一定量低锌比缺锌对玉米的伤害更大 并对其 同工酶谱及蛋白质表达进行了分析 结果表明 一定浓度的低锌培养使玉米生长受抑及受害最重 且地上部分比地下部分更敏感 低锌和缺锌处理时 种同工酶的酶谱和蛋白表达与正常供锌时均有明显的差异 尤其在一定量低锌浓度时 有些同工酶的表达增强或被特异性诱导
Microsoft PowerPoint - 疫苗與癌症.ppt
疫 苗 疫 苗 與 癌 症 經 過 特 別 處 理 的 致 病 微 生 物 使 人 體 免 疫 系 統 產 生 抗 體 (antibody) 或 其 他 免 疫 反 應 當 再 遇 上 同 一 微 生 物 時, 身 體 就 會 很 快 將 微 生 物 消 滅 蘇 曜 華 先 生 香 港 醫 院 藥 劑 師 學 會 藥 物 教 育 資 源 中 心 藥 劑 師 為 什 麼 要 接 種 疫 苗 免 疫 系
穨ld-sms-c
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 14 14 (1) 14 (1) 14 (2) 14 (2) 14 (2) 14 (3) 14 (3) 14 (3) 14 (4) 14 (5) 14 (5) 14 (6) 14 (6) 14 (7) / 14 (7) / 14 (7) / 14
《实验用小型猪环境条件》编制说明
中国实验动物学会团体标准 实验动物小鼠诺如病毒诊断方法 编制说明 联系人 : 岳秉飞 联系电话 :010-67095401 编制单位 : 中国食品药品检定研究院 时 间 : 2016 年 10 月 20 日 1 2 ~ 3 4 ~ 5 6 A B α μ μ μ 7 8 μ μ μ μ 9 μ μ 表 3 ELISA 检测重复性实验 血清号第一次第二次第三次血清号第一次第二次第三次 1 + + +
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經 濟 部 工 業 局 會 議 紀 錄 經 濟 部 衛 生 署 與 業 者 溝 通 平 台 局 處 層 級 會 議 ( II ): 醫 療 器 材 產 業 會 議 紀 錄 一 時 間 :94 年 7 月 19 日 ( 星 期 二 ) 上 午 9 時 30 分 二 地 點 : 經 濟 部 工 業 局 第 一 會 議 室 三 主 持 人 : 經 濟 部 工 業 局 陳 局 長 昭 義 政 處 廖 處 長
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Ö Ö Ö Ñ Ö Ö Ö Ö Ö Ö Ñ Ö Ö Ù Ñ Ö Ö Ñ Ö Ö Ö Ö Ö Ö 中国药典 年版药用辅料标准起草工作交流会 月 日于西宁召开 国家药典委员会于 年 月 日组织承担药用辅料标准起草任务的 个药品检验所在青海省西宁市召开辅料 标准起草工作交流会 国家局药品注册司派员参加了会议 青海省食品药品监督管理局魏富财副局长到会致欢迎词 中国药 品生物制品检定所和上海市食品药品检验所就药用辅料标准起草工作进行了大会经验交流
II
I II 目 录 前 言...3 内 容 提 要...4 1 加 速 生 物 技 术 药 物 产 业 发 展 具 有 重 大 的 战 略 意 义...6 2 发 展 生 物 技 术 药 物 产 业 的 关 键 成 功 因 素...8 3 中 国 生 物 技 术 药 物 产 业 发 展 所 面 临 的 主 要 挑 战...14 4 打 造 世 界 先 进 的 创 新 型 生 物 技 术 药 物 产 业
財團法人生物技術開發中心
財 團 法 人 生 物 技 術 開 發 中 心 生 技 藥 品 檢 驗 中 心 衍 生 成 立 新 創 事 業 徵 選 公 告 及 作 業 細 則 中 華 民 國 105 年 04 月 28 日 目 錄 頁 次 前 言... 2 壹 公 開 徵 選 說 明... 3 1.1 標 的 說 明... 3 1.2 標 的 取 得... 3 1.3 報 名... 4 1.4 實 地 查 核... 5 1.5
< 1+1 <! " #$% &!"#$ %&' ( )( %&* ) + ), %&- )+. )../'0 ) 1 ) "' )!"#$%&' (1% ( )* " + + %,-.2(13/01 )' 扩增 &' 基因 煮沸获得铜绿假单胞菌 ) 基因组作为模板 ) )( 作为引物
213456!"# $ % # %557;&/55/?5,/ @@@!88>>!"#!$% &'()*+ 武汉市疾病预防控制中心 武汉 /&55, % 华中科技大学同济医学院病原生物学系微生物教研室 武汉 /&55&5 & 武汉市第十一医院 武汉 /&5555,- O ' 0 ' =! 6!, 2 M*34!. 5 '2 ' 0 0* 6) 7 88^9:;0, 6! 89-4 O?@ 7%58
第 期 赵金莲等 荧光光谱法分析花茶对羟自由基 诱导的 氧化损伤的保护作用!!!!!!!! 花茶冲泡方法 荧光扫描方法 # 稳定性试验方法 重复性试验方法
年 月 华南师范大学学报 自然科学版 年第 期 赵金莲 曾佑炜 李 宽 彭永宏 采用荧光光谱扫描法定性定量研究了 种花茶对羟自由基 诱导的 氧化损伤的保护作用 结果表明 桂花茶 复合花茶 绿茶和芍药花茶的保护作用要优于红玫瑰花茶和金莲花茶 且各花茶的保护作用在 范围内均随质量浓度的增加而增强 该方法的稳定性和重复性都较好 花茶 氧化损伤 荧光光谱扫描 第 期 赵金莲等 荧光光谱法分析花茶对羟自由基
SDS 1.3
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (With RQ Study) SDS 1.3 I. ~ I. 1. : Dell GX280 2.8GHz with Dell 17 Flat monitor 256 MB RAM 40 GB hard drive DVD-RW drive Microsoft Windows XP Operating System
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2008 中国生物技术发展报告 社 会 发 展 科 技 司 中华人民共和国科学技术部 中国生物技术发展中心 编著 北 2008.indd 1 京 2010-6-24 15:51:36
2008 中国生物技术发展报告 社 会 发 展 科 技 司 中华人民共和国科学技术部 中国生物技术发展中心 编著 北 2008.indd 1 京 2010-6-24 15:51:36 目 录 前言 第 １ 篇 政策篇 １ 一 国家有关部门制定相关规划 引导生物科技与产业快速发展与合理布局 ３ 二 地方政府积极响应 纷纷出台生物医药技术与产业发展规划 突出区域优势和特色 ７ 三 积极制定政策措施
DOI: /j.cnki.bingduxuebao CHINESEJOURNALOF VIROLOGY Vol.34 No.1 January 2018 RT-PCR *,,,,,, (, ) : (ZIKV virus,zikv) (
34 1 2018 1 DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003304 CHINESEJOURNALOF VIROLOGY Vol.34 No.1 January 2018 RT-PCR *,,,,,, (, 102206) : (ZIKV virus,zikv) (Denguevirus,DENV) (Chikungunyavirus,CHIKV) ZIKV NS1
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至 高 生 产 力 Liquidator 96 一次完成 96 孔移液 提供 0.5~20 和 5~200 µl 两个 量程 适用于基因组学和蛋白质组学 快速 方便 符合人体工程学设计 手动 96 通道移液 更快 更好的工作流程 20 µl 200 µl Liquidator 96 96 384 Liquidator 96-20 µl 200 µl Rainin Liquidator liquidator
Fig1 Theforceappliedtothetrainwhenrunning :w = w j +w q (3) :w = w = w 0 +w j (4) w i 121 基本阻力 w r = 600 R ( N/kN) (8) :R : [2] w s [3] w s =0
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31 4 2012 8 JournalofLanzhouJiaotongUniversity Vol31No4 Aug2012 :1001-4373(2012)04-0097-07 * 张友兵 张 波 ( 100073) : 分析了列车运行过程中的受力情况 给出了制动过程中减速度的计算方法 并采用正向 反向两种迭代方式计算列车制动曲线 两种方式计算出的制动曲线一致 证明了计算制动曲线的方法是正确的
Microsoft PowerPoint - QuantStudio 7 Real-Time PCR System Training.pptx
QuantStudio 7 Real-Time PCR System Training 钱晓霞 Field Application Scientist Clinical & Research Technical Support Team Tel: 800 820 8982 / 400 820 8982-2-4 E-mail: cntechsupport@thermofisher.com 1 The
食 品 与 生 物 技 术 学 报 第 卷 列入我国 的植物多酚黄酮抗氧剂 防治高血脂和心血管疾病
第 卷第 期 年 月 食品与生物技术学报 植物多酚黄酮抗氧化剂与人体健康 尤新 中国食品添加剂和配料生产应用工业协会 北京 主要综述了对植物多酚黄酮类物质的生物活性和安全性 其内容包括 茶多酚 甘草黄酮 竹叶黄酮 大豆异黄酮以及从各种鲜果提取物的功能成分 如葡萄提取物 杨梅提取物 橄榄提取 物 乌饭树果提取物等 介绍了植物多酚黄酮的国际市场信息及相关的研究机构和生产单位 多酚 黄酮 健康 食 品 与
APEC衛生任務小組HTF會議圓滿落幕
SARS 2002 1999 1997 42 i 1999 Institute of Medicine To Error is ii Human 44,000 98,000 iii 1995 1987 2001 iv 147 406 24% 15% 11% 9% 2003 1 v / vi HRT 2004 3 9 15 2 X X off-label use 3 4 5 HRT viiviii ix
附件2：
中国实验动物学会团体标准 实验动物肿瘤坏死因子 α 转基因关节炎小鼠模型饲养繁育规范 编制说明 联系人 : 李舸 联系电话 :15011983691 编制单位 : 广东省实验动物监测所 时 间 : 2016 年 10 月 25 日 中国实验动物学会团体标准 人肿瘤坏死因子 α 转基因关节 炎小鼠模型饲养繁育规范 编制说明 GB/T1.1 2009 1 2011A081401005 2013B040400007
臺 灣 生 物 經 濟 產 業 發 展 方 案 Taiwan Bioeconomy Industry Development Program 中 華 民 國 105 年 1 月 5 日 105 年 1 月 5 日 行 政 院 核 定 摘 要 生 物 經 濟 係 指 在 生 物 資 源 或 生 物 技 術 基 礎 上, 發 展 成 產 品 與 服 務 的 一 種 經 濟 型 態, 包 括 所 引 導
实时定量, 定量PCR 探针
实时定量 PCR 探针的合成 (Real-time PCR Probes) 名称 2 OD 5 OD 10 OD Taqman probes with Black 元 / 条 元 / 条 元 / 条 Hole Quencher 5' -FAM and 3'- BHQ-1 600 700 900 5'- HEX and 3'-BHQ-1 750 900 1200 5' -TET and 3' BHQ-1
三 消除阶段的监测 2
中疾控传防发 2015 139 号附件 全国消除疟疾监测方案 (2015 版 ) 一 原则与目的 二 监测相关定义 1 三 消除阶段的监测 2 3 4 5 6 7 8 四 消除后阶段的监测 9 10 11 五 数据的收集 分析和反馈 六 监测能力维持 12 13 七 质量控制 14 八 组织管理 15 九 附件和附表 16 附件 1 一 调查时间 二 调查方法 三 注意事项 17 附件 2 一 监测时间
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创 业 板 风 险 提 示 本 次 股 票 发 行 后 拟 在 创 业 板 市 场 上 市, 该 市 场 具 有 较 高 的 投 资 风 险 创 业 板 公 司 具 有 业 绩 不 稳 定 经 营 风 险 高 退 市 风 险 大 等 特 点, 投 资 者 面 临 较 大 的 市 场 风 险 投 资 者 应 充 分 了 解 创 业 板 市 场 的 投 资 风 险 及 本 公 司 所 披 露 的 风 险
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凯 莱 英 医 药 集 团 ( 天 津 ) 股 份 有 限 公 司 天 津 经 济 技 术 开 发 区 洞 庭 三 街 6 号 首 次 公 开 发 行 股 票 招 股 说 明 书 ( 申 报 稿 ) 本 公 司 的 发 行 申 请 尚 未 得 到 中 国 证 监 会 核 准 本 招 股 说 明 书 ( 申 报 稿 ) 不 具 有 据 以 发 行 股 票 的 法 律 效 力 仅 供 预 先 披 露 使
目 錄 第 一 章 緒 論 第 一 節 研 究 背 景 與 動 機... 2 第 二 節 研 究 目 的... 2 第 三 節 研 究 方 法... 2 第 二 章 溫 泉 的 歷 史... 3 第 三 章 溫 泉 法 律 與 分 布 第 一 節 溫 泉 的 法 律 / 定 義... 5 第 二 節
修 平 科 技 大 學 應 用 日 語 系 題 目 : 日 本 の 温 泉 と 台 湾 の 温 泉 指 導 教 師 : 古 瀨 和 彥 老 師 姓 名 : 袁 緣 姓 名 : 楊 錡 學 號 :BX99063 學 號 :BX99512 中 華 民 國 103 年 01 月 10 日 目 錄 第 一 章 緒 論 第 一 節 研 究 背 景 與 動 機... 2 第 二 節 研 究 目 的... 2 第
Good morning
2003 000661 2003 2003 000661 2004-2003 -------------------------------------------------------1 -------------------------------------------------1 -----------------------------------------------------3
2. 对 DNA 载 体 的 控 制 元 件 和 选 择 标 记 的 序 列 与 来 源, 如 : 真 核 启 动 子 增 强 子 终 止 序 列 抗 生 素 抗 性 标 记 等 进 行 分 析 建 议 避 免 使 用 抗 青 霉 素 或 其 它 饽 邗 0 房 咕 氐 目 剐 员 昙 牵 好 使
预 防 用 DNA 疫 苗 临 床 前 研 究 技 术 指 导 原 则 一 前 言 DNA 疫 苗 是 将 外 源 目 的 基 因 片 段 构 建 在 DNA 质 粒 中, 重 组 后 的 DNA 导 入 机 体 后 可 表 达 目 的 蛋 白, 目 的 蛋 白 刺 激 机 体 产 生 特 异 性 免 疫 学 反 应 而 达 到 预 防 某 种 疾 病 的 生 物 制 剂 该 指 导 原 适 用 于
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2003 4 , 2 22.4%, 3.01%, 2002 4 21 BMI BMI 24 BMI 28 85cm 80cm 2003 3 10 ii *, iii 1 1 2 1 2.1 2 2.2 3 2.3 3 3 4 3.1 5 3.2 5 4 6 4.1 6 4.2 7 4.2.1 7 4.2.2 8 4.2.3 8 5 9 5.1 9 5.1.1 10 5.1.2 2 11 5.1.3
募集样本
华 鲁 控 股 集 团 有 限 公 司 2015 年 度 第 一 期 中 期 票 据 募 集 说 明 书 发 行 人 : 注 册 金 额 : 本 期 发 行 金 额 : 发 行 期 限 : 信 用 评 级 机 构 : 信 用 评 级 结 果 : 担 保 情 况 : 华 鲁 控 股 集 团 有 限 公 司 人 民 币 24 亿 元 人 民 币 3 亿 元 5 年 中 诚 信 国 际 信 用 评 级 有
任春平 邹志利 在坡度为 的平面斜坡上进行了单向不规则波的沿岸流不稳定运动实验 观测到了沿 岸流的周期性波动 波动周期约为 利用最大熵方法和三角函数回归法求得这种波动的主 频率以及幅值 分析了波动幅值在垂直岸线方向的变化 结果表明该变化与沿岸流变化类似 即在 沿岸流最大值附近这种波动强度最大 为了分析波动的机理 利用线性沿岸流不稳定模型对模型实验结果进行了分析 求得了不稳定运动增长模式和波动周期 并与对应实测结果进行了比较
學 名 藥
藥 品 組 新 手 上 路 手 冊 103 年 2 月 0 目 錄 藥 品 查 驗 登 記 概 述... 0 藥 品 查 驗 登 記 新 手 上 路... 2 新 藥 及 新 劑 型 新 使 用 劑 量 新 單 位 含 量 製 劑 查 驗 登 記 查 檢 表... 8 國 產 學 名 藥 品 查 驗 登 記 查 檢 表... 15 輸 入 學 名 藥 品 查 驗 登 記 查 檢 表... 18 生
A1010A0202 Mouse IL-2 ELISA Kit 说明书
小鼠白介素 2 酶联免疫试剂盒 Mouse IL-2 ELISA Kit 用于血清, 血浆, 细胞上清及其他生物体液中小鼠白介素 2 的检测 货号 :A1010A0202 96 tests 仅供科研使用, 勿用于药物 临床检测 联系地址 : 上海市闵行区罗锦路 98 号 2 幢 5 楼, 邮编 :200237 联系电话 :86 21 51692391,4008801880 web: www.biotnt.com
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赵世嘏 高乃云 楚文海 微曝气工艺是在常规 基础上发展起来的 试验表明在紫外光强 投加量为 三氯乙酸 初始浓度约为 的情况下 后该工艺对 的去除达到 以上 工艺效果受 光强 投加量 初 始浓度和 的影响 其他条件一定时 随着 光强和 投加量的增大 去除率增加 然而 投加量超过 后 去除效果增加缓慢 对不同初始浓度 时去除率最 高 而后浓度增加 去除率下降 中性或弱酸性 条件下更有利于降解 消毒副产物
依据为各成员国提供卫生政策方面指导意见这一职责，世界卫生组织（WHO）就预防具有全球公共卫生影响的疾病的疫苗及联合疫苗问题，发布一系列定期更新的立场文件
伤 寒 疫 苗 : WHO 立 场 文 件 依 据 为 各 成 员 国 提 供 卫 生 政 策 方 面 指 导 意 见 这 一 职 责, 世 界 卫 生 组 织 (WHO) 就 预 防 具 有 全 球 公 共 卫 生 影 响 的 疾 病 的 疫 苗 及 联 合 疫 苗 问 题, 发 布 一 系 列 定 期 更 新 的 立 场 文 件 这 些 文 件 着 重 关 注 疫 苗 在 大 规 模 免 疫 规
国际生物制品学杂志 2013 年 2 月第 36 卷第 1 期 IntJBiologicals,February2013,Vol.36,No.1 31 基因和 c myc 基因的 12.5μg 质粒可在成年和新生小鼠中诱导肿瘤 [6] [7] Fung 等发现,2μg 含病毒癌基因 v src 的
![国际生物制品学杂志 2013 年 2 月第 36 卷第 1 期 IntJBiologicals,February2013,Vol.36,No.1 31 基因和 c myc 基因的 12.5μg 质粒可在成年和新生小鼠中诱导肿瘤 [6] [7] Fung 等发现,2μg 含病毒癌基因 v src 的](/thumbs/92/110330744.jpg "国际生物制品学杂志 2013 年 2 月第 36 卷第 1 期 IntJBiologicals,February2013,Vol.36,No.1 31 基因和 c myc 基因的 12.5μg 质粒可在成年和新生小鼠中诱导肿瘤 [6] [7] Fung 等发现,2μg 含病毒癌基因 v src 的")
30 综述 生物制品残留 DNA 分析技术的研究进展 吴浩飞综述黄仕和孟胜利审校 摘要 生物制品中残留 DNA 可能具有感染性和致癌性, 因此生物制品的纯化过程需要验证, 尽可能将产品中残留 DNA 的水平降到最低 厂家有必要显示 DNA 去除过程, 并有适当定量分析方法检测残留 DNA 的含量 当前 DNA 定量分析所采用的最普遍方法是定量 PCR(quantitativerealtimepoly
Microsoft Word 王德伟-二校 3088
6 8 Vol. 6 No. 8 2015 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2015 王德伟 *, 游景水, 黄远英 (, 519040) 摘要 : 目的 (RP-HPLC) 方法 (ph 4.6), RP-HPLC, ph4.6, C 18, A 0.1%, B 0.09%(V:V) 90%(V:V),, 214 nm, 0.7 ml/min
Microsoft Word 张喜金-二校 出3109、3111
6 8 Vol. 6 No. 8 2015 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2015 张喜金 *, 苏昭仑, 黄康惠 (, 519040) 摘要 : 目的 方法, / (V:V=60:40), 1.2 ml/min, Waters Spherisorb C 18, 40 ; 203 nm 结果 0.1023~0.5118 mg/ml, r>0.999,
煤 炭 学 报 仪器与药品 黏土矿物的提纯 黏土样品的制备 红外光谱 分析 射线衍射 分析 射线光电子能谱 分析
张明青 刘炯天 单爱琴 刘汉湖 为了深刻认识煤泥水中 同黏土矿物颗粒之间的相互作用 笔者用 溶液在不同 值条件下分别同高岭土和蒙脱土作用 测定黏土作用前后的 射线衍射 红外光谱和 射线光电子能谱 实验证实了在 溶液中 在黏土表面以静电形式吸附 在 溶液中 以 沉淀和静电形式吸附 此外 在 以上的溶液中还可能存在一 羟基络合吸附形式 提出了 沉淀吸附和一羟基络合吸附的吸附过程模式 黏土颗粒表面的 沉淀使颗粒间形成的非选择性
作 组 即 着 手 编 写 中 国 成 人 超 重 和 肥 胖 症 预 防 与 控 制 指 南 在 广 泛 征 求 相 关 学 科 专 家 意 见 的 基 础 上, 经 七 次 修 改, 形 成 指 南 终 稿 希 望 本 指 南 能 够 为 推 动 中 国 肥 胖 防 治 工 作, 控 制 慢 性
中 国 成 人 超 重 和 肥 胖 症 预 防 控 制 指 南 ( 试 行 ) 前 言 肥 胖 目 前 在 全 世 界 呈 流 行 趋 势 肥 胖 既 是 一 个 独 立 的 疾 病, 又 是 2 型 糖 尿 病 心 血 管 病 高 血 压 中 风 和 多 种 癌 症 的 危 险 因 素, 被 世 界 卫 生 组 织 列 为 导 致 疾 病 负 担 的 十 大 危 险 因 素 之 一 我 国 目 前
特 殊 性, 国 际 上 也 有 将 其 作 为 独 立 行 业 管 理 的, 如 韩 国 等 欧 盟 美 国 等 虽 然 将 口 腔 用 品 列 入 了 化 妆 品, 但 对 口 腔 用 品 的 管 理 也 是 有 别 于 一 般 化 妆 品 的, 如 在 美 国, 防 龋, 抗 敏 感, 抗 牙
中 国 工 业 协 会 文 件 China Oral Care Industry Association 中 口 协 [2015] 第 10 号 关 于 对 化 妆 品 监 督 管 理 条 例 ( 修 订 草 案 送 审 稿 ) 的 意 见 建 议 函 国 务 院 法 制 办 公 室 秘 书 行 政 司 : 贵 司 7 月 20 日 发 来 的 征 求 意 见 函 收 悉 经 研 究 讨 论, 回
修正簡要說明
動 作 機 能 訓 練 領 域 課 程 壹 基 本 理 念 孩 童 的 動 作 發 展 會 隨 著 年 齡 增 長 而 逐 漸 成 熟 化 多 樣 化, 而 動 作 發 展 除 了 需 要 身 體 生 長 神 經 肌 肉 骨 骼 系 統 的 成 熟 外, 還 需 要 個 體 與 環 境 充 分 的 互 動 才 能 達 成 學 生 必 頇 先 具 備 基 本 的 動 作 能 力, 才 能 進 一 步
Bio-Industry Technology Management Review Vol. 3, No. 2 壹 緒 論 由 於 生 物 科 技 及 工 業 技 術 的 快 速 發 展, 食 品 產 業 因 應 科 技 發 展 之 需 求, 發 展 出 各 式 各 樣 的 營 養 補 充 品, 包
我 國 健 康 食 品 之 管 理 及 法 制 規 範 唐 淑 美 摘 要 由 於 生 物 科 技 及 工 業 技 術 的 快 速 發 展, 食 品 產 業 因 應 科 技 發 展 之 需 求, 發 展 出 各 式 各 樣 的 營 養 補 充 品, 包 括 : 補 充 品 (Supplements)( 維 他 命 礦 物 質 草 藥 運 動 飲 料 特 殊 營 養 品 ) 天 然 及 有 機 食 品
基因的 mrna 表达分析流程 样本采集 RNA RealTime 数据 稳定破碎 纯化 RT PCR 分析 本次实验课观察 c-myc 小分子抑制剂 F4 对 HL60 细胞中 c-myc 基因 mrna 表达水平的影响
细胞中 c-myc mrna 表达水平的检测与分析 王松梅复旦大学基础医学院医学实验教学中心东 5 号楼 405 室 smwang2@fudan.edu.cn 基因的 mrna 表达分析流程 样本采集 RNA RealTime 数据 稳定破碎 纯化 RT PCR 分析 本次实验课观察 c-myc 小分子抑制剂 10058-F4 对 HL60 细胞中 c-myc 基因 mrna 表达水平的影响 学习目标
小议攀缘植物的分类及应用
双 歧 杆 菌 的 益 生 性 能 及 其 研 究 进 展 作 者 : 家 环 宇 上 海 交 通 大 学 生 命 学 院 研 究 生 学 号 :5050809039 摘 要 : 双 歧 杆 菌 是 人 和 动 物 肠 道 内 最 主 要 的 生 理 性 细 菌 之 一, 与 其 它 生 理 性 细 菌 成 员 构 成 了 微 生 物 群 落, 并 与 宿 主 构 成 一 个 微 生 态 系 统 因
22 Animal Husbandry & Veterinary Medicine 2011 Vol. 43 No % 3% 3% /% % 6. 67% 1. 71% 1. 11% 0. 14% 0.
2011 43 5 21 3 1 1* 1 2 3 1 1. 2. 3. 78. 68±2. 95 g 28 300 3 5 3% 3 1 ALT TP ALB AST 0. 05 P>0. 05 ALT TP ALB P>0. 05 AST 0. 05 GLOB P>0. 05 2 INS 0. 05 TSH T 3 0. 05 P>0. 05 GLU GH T4 IGF-I P>0. 05 S816.
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1 : 1962 20 : ; :(1) ;(2) ;(3) ;(4) ;(5) 30 ( 1992; 1994; 1998) 20 80 2 1. 20 80 :(1) ;(2) ;(3) ;(4) ;(5) ;(6) ( )( 1984) 1 1 : :..... : 1984. ( 1994) ( ) ( ) ( ) : : : ( ) ( 1987)( 1) 1 ( ) ( ) / :. Human
工作地點的化學安全飲食業的化學安全指引
本 指 引 由 勞 工 處 職 業 安 全 及 健 康 部 編 製 2007 年 12 月 初 版 本 指 引 可 以 在 勞 工 處 職 業 安 全 及 健 康 部 各 辦 事 處 免 費 索 取, 亦 可 於 勞 工 處 網 站 http://www.labour.gov.hk/public/content2_8c.htm 下 載 有 關 各 辦 事 處 的 地 址 及 電 話 的 查 詢, 可
Product Type Batteries (only) Circuit Breatkers & Load Protection Connection Devices Contactors Ethernet Switches, Stratix Switches I/O Modules; PLC N
1201 South Second Street Milwaukee, Wisconsin U.S.A. 53204 Tel 414-382-2000 1 July 2016 RE: China Restriction of Hazardous Substances (RoHS) Dear Customer, Rockwell Automation is committed to demonstrating