乙型肝炎”两对半“及病毒核酸、抗-HCV检测的应用

乙 型 肝 炎 两 对 半 及 病 毒 核 酸 抗 -HCV 检 测 的 应 用 李 金 明 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 锦 州 2011.3.23

亚 洲 是 乙 肝 病 毒 肆 虐 的 重 灾 区, 全 球 2/3 以 上 的 慢 性 乙 肝 患 者 生 活 在 亚 洲 而 根 据 1992 年 全 国 乙 肝 血 清 流 行 病 学 调 查 的 结 果, 中 国 的 乙 肝 病 毒 携 带 者 近 1.3 亿 人, 平 均 每 10 个 人 中 有 一 个, 感 染 率 更 高 达 57.6%?

我 国 的 HBV 人 群 感 染 率 (HBsAg 阳 性 率 7.18%)( 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部. 全 国 人 群 乙 肝 血 清 流 行 病 学 调 查 结 果 [R]. 北 京 : 卫 生 部, 2008.) 远 高 于 美 国 (0.3%) (Centers for Disease Control and Prevention. National Health and Nutrition Examination Survey. 2008 (cited October 20, 2008). Available at: http://www.cdc.gov/nchs/about/m ajor/ nhanes/nhanes2005 2006/ lab05_06.htm.)

乙 型 肝 炎 病 毒 ( Hepatitis B Virus )

HBV 感 染 后 血 液 中 指 标 的 出 现

乙 肝 两 对 半 乙 肝 表 面 抗 原 (HBsAg): 最 早 出 现 在 血 液 中 的 病 毒 抗 原 乙 肝 表 面 抗 体 ( 抗 HBs): 中 和 或 保 护 抗 体 乙 肝 e 抗 原 (HBeAg): 第 二 个 出 现 在 血 液 中 的 病 毒 抗 原 乙 肝 e 抗 体 ( 抗 HBe) 乙 肝 核 心 抗 体 ( 抗 HBc): 最 早 出 现 在 血 液 中 的 抗 体 (IgM)

其 他 HBV 感 染 检 测 标 志 物 抗 -HBc IgM Pre-S1 Pre-S2 HBV DNA

HBsAg( 一 ) 于 1963 年 由 Blumberg 在 澳 大 利 亚 土 著 人 血 中 发 现, 称 为 澳 大 利 亚 抗 原 ( 即 以 前 所 谓 的 澳 抗 ) Baruch Blumberg

HBsAg( 二 ) HBV 感 染 后 绝 大 多 数 感 染 者 外 周 血 中 可 出 现 HBsAg, 含 量 在 5ng~600μg/ml 之 间 最 低 含 量 为 0.2 ng/ml, 高 者 可 达 2000μg/ml 以 上 HBV 的 前 S/S 基 因 编 码 HBsAg, 构 成 病 毒 外 膜, 根 据 所 带 亚 型 决 定 簇 的 不 同 分 为 adw adr ayw 和 ayr 我 国 绝 大 多 数 地 区 以 adr 为 主,adw 次 之

HBsAg( 三 ) HBsAg 不 仅 存 在 于 血 液 中, 而 且 还 存 在 于 许 多 体 液 和 分 泌 物 中, 如 唾 液 尿 液 乳 汁 精 液 等 最 常 用 的 HBsAg 免 疫 测 定 方 法 为 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 (ELISA) 和 免 疫 化 学 发 光 方 法, 测 定 下 限 进 口 试 剂 盒 可 小 于 0.1 IU/ml, 国 产 试 剂 盒 可 能 会 要 求 达 到 0.2IU/ml 以 下 1 IU 0.58 ng

HBsAg 测 定 中 可 能 存 在 的 问 题 在 HBsAg 的 测 定 中, 最 大 的 问 题 是 假 阴 性 问 题 : (1)HBsAg 含 量 低 于 所 用 方 法 的 测 定 下 限 之 下 如 感 染 的 窗 口 期 急 性 期 后 或 恢 复 期 自 限 性 感 染 末 期 的 携 带 者 等 (2) 编 码 HBsAg 的 HBV S 基 因 的 突 变 (3)HCV/HDV 重 叠 感 染 对 HBV 复 制 和 / 或 HBsAg 的 表 达 的 抑 制 作 用 (4) 测 定 方 法 所 用 抗 体 对 HBV 不 同 基 因 型 检 测 敏 感 性 的 不 同 (5) HOOK EFFECT

编 码 HBsAg 的 HBV S 基 因 的 突 变 对 检 测 的 影 响 HBV 容 易 发 生 突 变, 较 其 他 DNA 病 毒 的 突 变 率 要 高 10 倍 与 检 测 有 关 的 突 变 主 要 集 中 在 核 心 启 动 子 前 核 心 区 和 编 码 病 毒 包 膜 蛋 白 的 a 决 定 簇 的 基 因 区 域

目 前 的 商 品 试 剂 盒 对 HBsAg 突 变 株 的 测 定 能 力 可 归 为 三 类 : 突 变 HBsAg 和 野 生 型 均 可 检 出 不 能 检 出 突 变 HBsAg 与 野 生 型 抗 原 相 比, 突 变 HBsAg 的 检 出 能 力 明 显 降 低 使 用 酶 标 多 克 隆 抗 体 的 商 品 试 剂, 大 多 数 可 归 为 第 一 和 第 三 类

HBV S 基 因 变 异 所 致 HBsAg 假 阴 性 的 最 大 的 问 题 输 血 安 全 性 尤 其 是 逃 逸 突 变 株 流 行 较 广 的 地 区, 在 HBV 高 流 行 区 域, 突 变 株 的 流 行 率 也 高 导 致 疫 苗 免 疫 的 失 败 要 在 进 行 人 群 HBV 分 子 流 行 病 学 的 基 础 上, 考 虑 研 制 针 对 主 要 流 行 HBsAg 变 异 株 的 乙 肝 疫 苗, 保 证 免 疫 的 有 效 性 临 床 检 测 中 两 对 半 异 常 模 式 的 出 现

HBsAg 的 变 异 所 致 的 不 常 见 的 HBV 标 志 物 模 式 或 不 一 致 的 结 果 单 独 抗 HBc 阳 性 HBsAg 阴 性 但 HBeAg 阳 性 血 清 HBsAg 阴 性 但 抗 HBc 和 抗 HBs 阳 性 HBsAg(HBeAg) 和 抗 HBs( 大 多 为 <100IU/ml 的 低 滴 度 ) 同 时 存 在 使 用 不 同 厂 家 的 HBsAg 试 剂 盒 得 到 的 不 一 致 结 果

HBV 不 同 基 因 型 对 检 测 敏 感 性 的 影 响 HBV 基 因 型 依 其 全 基 因 组 大 于 8% 的 变 化 而 分 为 八 型, 命 名 为 A 到 H 基 因 型 A 主 要 存 在 于 白 人, 而 基 因 B 和 C 主 要 在 亚 洲 人 群 以 单 抗 为 基 础 建 立 的 HBsAg 免 疫 测 定 方 法, 当 用 于 生 产 单 抗 的 病 毒 株 与 流 行 人 群 的 亚 型 / 基 因 型 或 变 异 株 不 同 时, 可 能 得 不 到 可 靠 的 结 果

HBsAg 检 测 的 临 床 意 义 血 清 HBsAg 仅 为 HBV 感 染 的 标 志 ; 是 感 染 后, 血 液 中 最 早 出 现 的 HBV 血 清 学 标 志 物, 且 可 长 时 间 高 浓 度 存 在 不 反 映 病 毒 有 无 复 制 复 制 程 度 传 染 性 强 弱 慢 性 乙 型 肝 炎 患 者 血 清 HBsAg 定 量 检 测?

HBsAg 定 量 检 测 的 意 义 干 扰 素 治 疗 预 后 判 断 及 监 测 指 标 HBsAg 携 带 者 预 后 意 义 不 明 确 核 苷 类 药 治 疗 的 预 后 及 监 测 意 义 不 明 确

抗 -HBs 接 受 乙 肝 疫 苗 接 种 者, 体 内 血 循 环 中 除 了 抗 - HBs 外, 不 应 出 现 其 它 乙 肝 病 毒 感 染 血 清 免 疫 学 标 志 物, 如 抗 -HBe 抗 -HBc 等, 一 旦 出 现 除 抗 -HBs 以 外 的 标 志 物, 则 应 视 为 既 往 HBV 感 染

抗 -HBs 血 清 中 抗 -HBs 和 HBsAg 同 时 检 出, 可 能 为 抗 -HBs 产 生 的 早 期, 或 属 于 不 同 亚 型 的 HBV 感 染, 或 由 HBV 的 S 基 因 变 异 所 致 自 然 发 生 的 逃 逸 变 异 株 可 使 某 些 慢 性 携 带 者 同 时 存 在 HBsAg 和 抗 -HBs, 产 生 的 抗 体 直 接 针 对 血 循 环 中 HBsAg 抗 原 不 含 的 表 位, 因 而 不 具 保 护 作 用 HBsAg 和 抗 -HBs 同 时 存 在 的 最 常 见 的 原 因 是 所 产 生 的 抗 - HBs 针 对 的 是 亚 型, 而 非 HBsAg 的 a 决 定 簇

抗 -HBs 测 定 的 意 义 HBV 感 染 指 标 : 未 进 行 疫 苗 免 疫 者, 如 出 现 抗 -HBs, 则 为 HBV 感 染 者 疫 苗 免 疫 效 果 的 判 断 指 标 : 定 量 测 定 在 10 IU/L 以 上, 则 说 明 有 免 疫 力

HBeAg HBeAg 为 HBcAg 的 可 溶 性 成 份, 两 者 约 有 75% 共 同 的 氨 基 酸 序 列, 但 二 级 结 构 不 同, 各 有 特 异 的 抗 原 决 定 簇 其 在 血 清 中 的 出 现 时 间 稍 后 于 HBsAg, 当 乙 肝 病 毒 的 前 核 心 区 发 生 点 突 变 时, 可 使 得 HBeAg 无 法 表 达, 表 现 为 血 清 HBeAg 或 抗 HBe 测 定 持 续 为 阴 性, 但 血 清 HBsAg 或 HBV DNA 可 表 现 为 阳 性 HBeAg 与 病 毒 Dane 颗 粒 HBV DNA 具 有 伴 随 关 系, 是 HBV 复 制 活 跃 的 血 清 学 指 标

HBeAg 检 测 的 临 床 意 义 HBV 感 染 指 标 反 映 HBV 的 活 跃 复 制 ( 但 如 前 C 区 发 生 突 变, 则 可 不 出 现 )

抗 -HBe 抗 -HBe 阳 性 说 明 病 毒 复 制 减 少, 传 染 性 弱, 但 并 非 没 有 传 染 性 抗 -HBe 不 是 保 护 性 抗 体

抗 -HBe 检 测 的 临 床 意 义 HBV 感 染 指 标

总 抗 -HBc 机 体 对 HBV 抗 原 的 免 疫 应 答 最 早 出 现 的 是 对 HBcAg 的 细 胞 免 疫 应 答, 随 后 是 体 液 免 疫 应 答 产 生 抗 -HBc, 总 抗 -HBc 包 括 抗 -HBc IgM IgA IgG 和 IgE 等 抗 -HBc 不 是 保 护 性 抗 体 抗 -HBc 在 血 中 呈 低 滴 度 且 与 抗 -HBs 同 时 存 在, 是 既 往 感 染 的 标 志 在 HBV 高 流 行 人 群 中, 抗 -HBc 常 作 为 疫 苗 免 疫 前 的 筛 检 方 法 在 欧 洲 和 美 国, 抗 -HBc 还 是 血 液 筛 查 的 一 个 指 标 在 我 国, 抗 -HBc 没 有 作 为 血 液 筛 查 指 标, 其 主 要 原 因 是 抗 -HBc 检 测 的 假 阳 性 导 致 血 液 废 弃 过 多

抗 -HBc 测 定 方 法 竞 争 ELISA 模 式 待 测 抗 体 E E E 酶 标 抗 体 底 物 显 色 固 相 抗 原 洗 板 温 育 E E

抗 -HBc 测 定 存 在 的 最 大 问 题 假 阳 性 单 项 抗 -HBc 阳 性 结 果 的 解 释

抗 -HBc 测 定 假 阳 性 的 主 要 原 因 血 清 ( 浆 ) 中 存 在 交 叉 反 应 性 抗 体 或 干 扰 性 物 质 一 个 主 要 原 因 : 前 母 B 淋 巴 细 胞 的 非 特 异 激 活, 导 致 未 感 染 HBV 的 IgA 或 IgM 相 关 分 子 的 产 生

抗 -HBc 检 测 特 异 性 的 改 善 使 用 还 原 剂 如 二 硫 苏 糖 醇 (dithiothreitol) 重 亚 硫 酸 钾 (potassium bisulfite) 和 半 胱 氨 酸 等 预 处 理 血 清 标 本 具 有 标 本 预 处 理 的 抗 -HBc 试 验 的 特 异 性 在 99.8% 至 99.9% 之 间 在 竞 争 性 抗 -HBc 免 疫 测 定 中, 只 有 抑 制 值 大 于 或 等 于 90% 者 可 考 虑 为 真 正 的 阳 性

单 项 抗 -HBc 真 阳 性 常 为 HBV DNA 阳 性 常 见 于 吸 毒 者 HIV 感 染 者 和 HBV/HCV 重 叠 感 染 者, 在 吸 毒 者 中 最 高 (>40%), 在 妊 娠 妇 女 中 单 独 抗 -HBc 反 应 性 的 检 出 率 为 1.2%

抗 -HBc IgM 抗 -HBc IgM 可 以 说 是 机 体 感 染 HBV 后 在 血 液 中 最 早 出 现 的 特 异 抗 体, 在 肝 炎 的 急 性 期 呈 高 滴 度, 是 判 断 急 性 乙 型 肝 炎 的 重 要 指 标 研 究 表 明 在 慢 性 活 动 性 乙 型 肝 炎 患 者 血 循 环 中, 抗 -HBc IgM 检 出 率 及 滴 度 亦 较 高, 说 明 HBV 在 体 内 复 制 活 跃, 是 传 染 性 强 的 指 标 之 一

抗 -HBc IgM 的 定 量 测 定 对 急 性 乙 型 肝 炎 和 慢 性 乙 型 肝 炎 的 急 性 发 作 的 临 床 诊 断 有 重 要 价 值 急 性 乙 型 肝 炎, 抗 -HBc IgM 值 高 于 500 PEIU/ml 如 果 为 亚 临 床 感 染, 或 标 本 采 集 时 间 在 急 性 发 作 前 或 急 性 HBV 感 染 中 晚 期, 则 抗 -HBc IgM 值 较 低 在 慢 性 活 动 性 肝 炎, 可 见 有 中 等 程 度 (10-500PEIU/ ml) 抗 -HBc IgM 浓 度 出 现 *PEIU:Paul-Ehrlich Institute Units

抗 -HBc IgM 的 高 灵 敏 的 定 性 测 定 高 灵 敏 的 定 性 测 定 对 不 常 见 乙 肝 标 志 物 血 清 学 模 式 如 单 项 抗 -HBc 阳 性 和 HBsAg 阴 性 的 急 性 乙 肝 等 的 明 确 也 有 应 用 价 值, 其 可 与 抗 -HBe 和 敏 感 的 定 性 HBV DNA 核 酸 扩 增 检 测 一 起 使 用, 以 证 实 不 常 见 模 式 结 果 的 正 确 性, 提 供 患 者 潜 在 的 HBV 相 关 的 肝 病 信 息, 尤 其 是 HBV DNA 测 定 阴 性 的 患 者 以 10 PEIU/ ml 为 阳 性 判 断 值, 在 8.5% 证 实 为 单 独 抗 -HBc 反 应 性 的 患 者 中 检 出 了 特 异 的 IgM 抗 体

HBV DNA 乙 型 肝 炎 的 抗 病 毒 治 疗 在 国 内 以 拉 米 夫 定 的 应 用 最 为 广 泛 拉 米 夫 定 为 口 服 核 苷 类 似 药 物, 化 学 全 称 为 2,3 - 双 脱 氧 -3- 硫 胞 嘧 啶 核 苷, 简 称 3TC 因 其 对 逆 转 录 酶 的 活 性 具 有 抑 制 作 用, 最 先 用 于 艾 滋 病 的 抗 病 毒 治 疗 3TC 抑 制 HBV 复 制 的 作 用 机 理, 系 药 物 在 细 胞 内 经 磷 酸 化 后, 由 于 其 与 脱 氧 胞 嘧 啶 核 苷 (dctp) 类 似, 因 而 其 可 与 dctp 竞 争 而 进 入 合 成 中 的 DNA 链, 进 而 使 DNA 不 能 继 续 延 伸 而 终 止 复 制 这 种 终 止 复 制 的 作 用 对 HBV DNA 负 链 和 正 链 均 有 效 耐 药 产 生 的 机 理 系 因 其 多 聚 酶 基 因 区 发 生 点 突 变 所 致 多 聚 酶 C 区 的 亚 结 构 域 是 HBV 进 行 逆 转 录 的 活 性 部 位, 由 酪 氨 酸 (Y)- 蛋 氨 酸 (M)- 天 门 冬 氨 酸 (D)- 天 门 冬 氨 酸 (D) 即 YMDD 组 成, 是 3TC 干 扰 HBV 复 制 的 结 合 位 点 当 YMDD 中 的 第 552 位 的 蛋 氨 酸 可 被 缬 氨 酸 (V) 或 异 亮 氨 酸 (I) 取 代, 生 成 YV552DD 或 YI552DD, 导 致 亚 结 构 域 的 空 间 构 型 改 变, 从 而 阻 碍 与 3TC 的 结 合

HBV DNA 检 测 定 量 方 法 :PCR 结 果 准 不 准? 什 么 时 候 需 要 做 定 量 测 定? 定 性 方 法 :PCR 什 么 时 候 需 要 做 定 性 测 定?

PCR( 聚 合 酶 链 反 应 ) PCR 是 美 国 科 学 家 穆 利 斯 (Mullis) 于 1983 年 发 明 的, 并 于 1993 年 因 此 发 明 而 获 得 了 诺 贝 尔 化 学 奖 No. of Cycles 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 No. Amplicon Copies of Target 20 1,048,576 30 1,073,741,824

结 果 中 的 7.2E+08 是 什 么 意 思? 7.2E+08 为 7.2 10 8 的 意 思

如 何 判 断 乙 肝 患 者 抗 病 毒 治 疗 疗 效? 当 一 个 HBV DNA PCR 定 量 检 验 结 果 为 7.2E+08 IU/ml 的 乙 肝 患 者, 在 抗 病 毒 药 物 如 拉 米 夫 啶 或 干 扰 素 治 疗, 两 周 后, 再 检 测, 如 结 果 为 5.2E+08 IU/ml, 再 两 周 后, 结 果 为 9.0E+08 IU/ml, 抗 病 毒 治 疗 有 效 吗?

如 果 判 断 乙 肝 患 者 抗 病 毒 治 疗 疗 效?

什 么 时 候 做 HBV DNA 定 性 / 定 量 测 定? 未 知 病 人 的 乙 肝 病 毒 感 染 确 认 检 测 : 定 性 结 果 报 告 : 阴 性 或 阳 性 已 知 乙 肝 患 者 的 抗 病 毒 治 疗 疗 效 动 态 观 察 结 果 报 告 : 量 值, 低 于 方 法 的 最 低 测 定 限 ( 测 定 下 限 ), 则 报 告 小 于 下 限 值

血 清 ( 浆 )HBV DNA 浓 度 与 传 染 性 强 弱 的 问 题 >10 9 拷 贝 /ml, 日 常 生 活 密 切 接 触 强 传 染 性 >10 5 ~10 6 拷 贝 /ml, 日 常 生 活 密 切 接 触 传 染 性 较 小 <10 5 拷 贝 /ml, 日 常 生 活 密 切 接 触 几 乎 没 有 什 么 传 染 危 险 性 但 不 管 HBV DNA 的 浓 度 为 多 少, 那 怕 是 低 于 相 应 PCR 方 法 的 测 定 下 限, 也 均 会 引 起 输 血 后 的 感 染

丙 型 肝 炎 病 毒

中 国 丙 型 肝 炎 病 毒 感 染 的 估 计 人 数 达 3800 万, 其 中 约 50% 携 带 病 毒, 为 全 球 之 最 中 国 丙 型 肝 炎 防 治 指 南 全 国 血 清 流 行 病 学 调 查 资 料 显 示, 我 国 一 般 人 群 抗 -HCV 阳 性 率 为 3.2%?

HCV 感 染 后 血 液 中 指 标 的 出 现 HCV Ag HCV Ag 图 片 来 自 ABBOTT

抗 -HCV 检 测 方 法 ELISA ( 初 筛 ) RIBA 和 RT-PCR( 确 认 )

可 能 导 致 假 阳 性 结 果 的 标 本 因 素 内 源 性 干 扰 因 素 : 类 风 湿 因 子 补 体 异 嗜 性 抗 体 治 疗 性 抗 体 溶 菌 酶 等 外 源 性 干 扰 因 素 : 溶 血 细 菌 污 染 标 本 贮 存 时 间 过 长 凝 固 不 全

免 测 定 的 灰 区

有 关 抗 -HCV 免 疫 测 定 试 剂 的 阳 性 判 断 标 准 试 剂 名 称 可 判 为 阳 性 的 S/CO Ortho HCV version 3.0 ELISA 3.8 Ortho Vitros anti-hcv assay 8.0 Abbott HCV EIA 2.0 3.8 Abbott Axsym antibody to HCV 10.0 Abbott Architect anti-hcv 5.0

Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003 ;52(RR-3):1-13, 15; quiz CE1-4.

Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003 ;52(RR-3):1-13, 15; quiz CE1-4.

抗 HCV 筛 查 及 确 认 试 验 结 果 的 解 释 筛 查 试 验 结 确 认 试 验 结 果 结 果 报 告 解 释 阴 性 不 需 检 测 抗 HCV 阴 性 未 感 染 HCV, 除 非 怀 疑 是 最 近 感 染, 或 有 其 它 证 据 表 明 有 HCV 感 染 阳 性 且 S/CO 值 高 未 检 测 抗 HCV 阳 性 提 示 既 往 或 现 症 HCV 感 染. 未 进 行 确 认 验.S/CO 值 高 的 标 本 一 般 均 为 确 认 阳 性 ( 95%), 但 尚 有 5% 的 标 本 可 能 为 假 阳 性, 可 在 患 者 要 求 下 进 行 确 认 试 验. 阳 性 阳 性 抗 HCV 阳 性 提 示 既 往 或 现 症 HCV 感 染 阳 性 阴 性 抗 HCV 阴 性 未 感 染 HCV, 除 非 怀 疑 是 最 近 感 染, 或 有 其 它 证 据 表 明 有 HCV 感 染 阳 性 不 确 定 抗 HCV 不 确 定 不 能 确 定 抗 HCV 及 HCV 感 染 状 态,; 应 再 采 集 另 一 份 标 本 重 测 抗 HCV(>1 个 月 ) 或 HCV RNA 阳 性 HCV RNA 阳 性 抗 HCV 阳 性 HCV RNA 阳 性 提 示 活 动 性 HCV 感 染 阳 性 RIBA 阳 性 HCV RNA 阴 性 抗 HCV 阳 性 HCV RNA 阴 性 抗 HCV 阳 性 提 示 既 往 或 现 症 HCV 感 染. 单 个 HCV RNA 阴 性 结 果 不 能 排 除 活 动 性 感 染 阳 性 RIBA 阴 性 HCV RNA 阴 性 抗 HCV 阴 性 HCV RNA 阴 性 未 感 染 HCV 阳 性 RIBA 不 确 定 HCV RNA 阴 性 抗 HCV 不 确 定 HCV RNA 阴 性 抗 HCV 筛 查 结 果 可 能 为 假 阳 性, 此 时, 提 示 未 感 染 HCV Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 2003 ;52(RR-3):1-13, 15; quiz CE1-4.

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