第 30 卷 第 2 期 2012 年 6 月 经 济 林 研 究 Nonwood Forest Research Vol. 30 No.2 Jun. 2012 油桐种子 FAD2 基因全长 cdna 序列分析 谢禄山 a,b 谭晓风 a,c 张 琳 a,c 龙洪旭 a 中南林业科技大学 a. 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 b. 风景园林学院 c. 林学院 湖南 长沙 410004 摘 要 油桐种子中 FAD2 催化形成的亚油酸是合成桐油酸的直接原料 研究油桐种子中的 FAD2 基因对提高桐 油酸的产量具有实际意义 将油桐对年桐近成熟种子 cdna 文库中的 16 个 FAD2 克隆子进行 CAP3 拼接 再进 行 BLAST 比对 并进行 DNAMAN 分析 结果表明所克隆的基因序列为 FAD2 全长 cdna 序列 其长度为 1 537 bp 含有 1 个完整的编码序列 长度为 1 146 bp 106 1 255 bp 编码 383 个氨基酸 酶蛋白相对分子 质量 44 144.4 u 等电点为 8.57 氨基酸序列 N 端有 6 个残基的信号肽序列 有 5 个跨膜结构域 N 端 C 端及 中间各有一段表现为强亲水性 酶活性中心为 3 个保守的组氨酸簇 在系统进化上 油桐 FAD2 基因与千年桐的 亲缘最近 与蓖麻 乌桕 橡胶树 麻疯树等大戟科植物的亲缘关系较近 与油橄榄 花生 芝麻等植物的亲 缘较远 与油茶的亲缘关系更远 关键词 油桐 种子 cdna 文库 FAD2 中图分类号 S603.2 S794.3 文献标志码 A 文章编号 1003 8981(2012)02 0001 09 Analysis of full-length cdna sequence of FAD2 gene in Vernicia fordii seeds XIE Lu-shana,b, TAN Xiao-fenga,c, ZHANG Lina,c, LONG Hong-xiua (a. Key Lab of Non-Wood Forest Product of State Administration of Forestry; b. College of Landscape Architecture; c. College of forestry, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China) Abstract: Linoleic acid produced in seeds of Vernicia fordii is the direct material for synthesize eleostearic acid through catalysis of FAD2, the researches on FAD2 gene in seed from V. fordii has practical significance on improving yield of eleostearic acid. Taking 16 FAD2 clones in cdna library of nearly mature V. fordii Duinian tung seeds as materials, CAP3 splicing, BLAST alignment and DNAMAN analysis were carried on. The results showed that the cloned gene sequence was FAD2 full-length cdna sequence, its length was 1 537 bp. The sequence contained a complete coding sequence, length of 1 146 bp (106-1 255 bp), encoding 383 amino acids. The relative molecular mass of the enzyme protein was 44 144.4 u, isoelectric point was 8.57. The N end of amino acid sequence had a signal peptide sequence of 6 residues, 5 transmembrane domains, 3 strong hydrophilic sequences existed at the N end, C end and intermediate part, respectively, and the activity center of enzyme was 3 conserved histidine clusters. In system evolution, FAD2 gene in V. fordii had a nearest phylogenetic relationship with V. montana, nearer relationship with Euphorbiaceae plants such as Ricinus communis, Triadica sebifrea, Hevea brasiliensis, Jatropha curcas, and far relationship with Olea europaea, Arachis hypogaea, Sesamum indicum, further relationship with Camelia oleifera. Key words: Vernicia fordii; seed; cdna Library; FAD2 收稿日期 2011-11-25 基金项目 国家林业公益性行业科研重点专项子项目 油桐种质资源评价与新品种选育 201004009-2 湖南省 十二五 重点学科 风 景园林学 湘教发 2011 76 号 作者简介 谢禄山 1963 男 湖南新化人 副教授 博士 主要从事林业生物技术方面的研究 E-mail xiels278@163.com 通讯作者 谭晓风 1956 男 湖南茶陵人 教授 博士 博士研究生导师 主要从事经济林栽培育种与林业生物技术方面的研究 E-mail tanxiaofengcn@126.com
谢禄山 等 油桐种子 FAD2 基因全长 cdna 序列分析 2 油 桐 Vernicia fordii 是 我 国 特 有 经 济 林 木 又 名 三 年 桐 光 桐 桐 籽 树 与 油 茶 Camellia oleifera 核桃 Juglans regia 乌桕 Triadica sebifera 并称我国四大木本油料树种 [1-2] 其种仁含油率高 第2期 局重点实验室构建的油桐对年桐种子 cdna 文库 1.2 方 法 通 过 生 物 信 息 学 软 件 CAP3 Huang X. 和 Madan A.1999 对测序获得的基因序列进行拼接 达 70% 所榨出油脂称桐油 是重要工业用油 通 过 NCBI 进 行 在 线 BLASTN BLASTX 分 析 经济价值特高 桐油为三酰甘油的混合物 其脂 对克隆子进行基因功能确定 并运用 DNAMAN 肪酸成分中以桐油酸含量最高 约为 80% 桐油 等 软 件 对 全 长 cdna 序 列 进 行 分 析 确 定 序 列 色泽金黄 不能食用 是优良的干性油 干燥快 CDS 及推导氨基酸序列 并对氨基酸序列进行理 比重轻 附着力强 有光泽 成膜后具有不透水 化特性分析及结构预测 不透气 不传电 抗酸碱 防腐蚀 防锈 耐冷 热等特点 广泛用于高级油漆 涂料 人造皮革 油墨等制造业 又可供制生物柴油 树脂 人造 [3] 橡胶 塑料 颜料及医药等 目前 国内外对油 桐的研究主要集中在栽培选优及丰产林改造方面 [4-7] 2 结果与分析 2.1 油桐种子 FAD2 基因全长序列分析 2.1.1 FAD2 核苷酸序列分析 将试验中获得的油桐种子油酸脱饱和酶 FAD2 对个别基 基 因 的 16 个 克 隆 子 编 号 分 别 为 Vf04_G07 因进行了克隆 周冠等构建了油桐种仁 cdna 文 Vf05_H02 Vf07_H05 Vf13_B08 Vf14_G03 分子水平的研究报道较少 李建安等 [8] 库 本文中以生产上广泛应用的对年桐近成熟 Vf16_E10 Vf18_E07 Vf19_A02 Vf20_F08 种子为材料 在构建 cdna 文库及 EST 文库的基础 Vf21_G02 Vf24_C05 Vf28_B06 Vf30_F09 上 开展对油桐优质基因资源的分离克隆研究 以 Vf32_E12 Vf34_F10 Vf34_H03 的 EST 序 列 期为油脂形成进行遗传改良提供资源和技术基础 油酸脱饱和酶 FAD2 是多不饱和脂肪酸合成的 用 CAP3 程序进行在线拼接 获得编号为 yt_0034_ 关键酶 催化油酸转化为亚油酸 在油桐种子内 亚油酸是桐酸合成的直接底物 因此 FAD2 基因的 F10.ab1 的重叠序列 contig 以 Fasten 格式在 NCBI 进行在线 BLASTX 与已登录的部分物种的 FAD2 分离克隆及酶蛋白的特性研究对提高油桐种子桐 基因进行比对分析 结果表明 与 Genebank 中已 登录的油桐 FAD2 基因的相似性最高 达 818 一 酸的合成进程有重要的促进作用 致性 100% 与其它部分物种的比对结果见表 1 一 1 材料与方法 致性均在 80% 以上 E 值 期望值 为 0 确认所 得 contig 为油桐对年桐品种的 FAD2 基因 1.1 材 料 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业 使用 DNAMAN 程序对基因进行分析 所克 隆 的 FAD2 基 因 为 全 长 cdna 序 列 其 长 度 为 表 1 油桐种子FAD2基因的BLASTX比对 Table 1 The BLASTX alignment of FAD2 gene from Vernicia fordii seeds 编号 No. 种类 Specie 拉丁名 Latin name 登录编号 Accession ID 总分值 Total score 期望值 E value 最高一致性 The highest consistency /% 1 油桐 Vernicia fordii AAN87573.1 818 100 2 千年桐 Vernicia montana ABL86147.1 805 98 3 麻疯树 Jatropha curcas ABA41034.1 762 91 4 橡胶树 Hevea brasiliensis AAY87459.1 756 90 5 蓖麻 Ricinus communis XP_002530704.1 754 88 6 乌桕 Triadica sebifera ABI96919.1 745 90 7 毛果杨 Populus trichocarpa XP_002323284.1 734 88 8 大豆 Glycine max BAD89862.1 699 9 亚麻 Linum usitatissimum ACF49507.1 705 10 美国葡萄 Vitis labrusca AEI60128.1 697 11 菜豆 Phaseolus vulgaris ADO17551.1 697 12 花生 Arachis hypogaea ACZ06072.1 695 13 旱金莲 Tropaeolum majus AAV52834.1 695 81 14 西葫芦 Cucurbita pepo AAS19533.1 692 15 马齿苋 Portulaca oleracea ACJ66779.1 692 80 16 陆地棉 Gossypium hirsutum AAL37484.1 690
第 30 卷 经 济 林 研 究 3 1 537 bp 含 有 1 个 完 整 的 编 码 序 列 CDS 端非编码区 106 bp 和 3 端非编码区 2 bp 有 1 CDS 长 度 为 1 146 bp 106 1 255 bp 编 码 个长为 19 bp 的 polya 尾 383 个氨基酸 推导氨基酸序列如图 1 所示 5 暗影示起始密码子和终止密码子 * 为翻译终点 The shadow show start and stop codons, and * shows the end point of translation. 图 1 油桐 FAD2 基因全长 cdna 序列与推导氨基酸序列 Fig. 1 The full-length cdna sequence and the sequence of deduced amino acid of FAD2 gene from Vernicia fordii 2.1.2 FAD2 的氨基酸序列分析 72 92 161 170 位的氨基酸区间 N 端起始 用 DNAMAN 程序对基因的氨基酸序列进行 分析 将所克隆的 FAD2 基因全长 CDS 与同源性 段的 6 个氨基酸 MGAGGR 保守性较高 后面预 达到 80% 以上的其它物种的氨基酸序列进行比对 在的 105 110 HECGHH 141 145 HRRHH 结果如图 2 所示 油桐 千年桐 麻疯树 橡胶 及 315 319 HVAHH 具有高度保守性 这与 树 蓖麻 乌桕 毛果杨 亚麻 大豆 美国葡萄 所有脱饱和酶的活性中心相一致性 2.2 油桐 FAD2 基因的系统进化关系 菜豆 花生 旱金莲 西葫芦 马齿苋 陆地棉 及查询序列 FAD2 保守性较高 有 4 个区段多变 分别位于 N 端 7 21 C 端 369 383 及中段的 测为信号肽序列 酶的活性中心 3 个组氨酸簇所 为研究目的基因的进化位置 运用 BLAST 结 果 设 进化距离为 0.75 形成油桐 FAD2 基因进
4 谢禄山 等 油桐种子 FAD2 基因全长 cdna 序列分析 第2期
第 30 卷 经 济 林 研 究 5 左侧编号 1 16 对应物种见表 1 The corresponding species of No. from 1 to 16 at the left see Table 1. 图 2 油桐种子 FAD2 的氨基酸序列比对结果 Fig. 2 Alignment results of FAD2 amino acid sequence from Vernicia fordii seeds 行系统进化分析 见图 3 从进化树中发现查 询基因首先与伞形科欧芹 Petroselinum crispum 区 了油茶的 FAD2 基因 [9-10] 油桐与油茶的 FAD2 的 CDS 比对 见图 4 一致性 77.49% 296/3 分 然后与木犀科油橄榄 Olea europaea 茄科番 茄 Solanum lycopersicum 夹 竹 桃 科 蓝 树 Wrightia 相似的残基 19.90% 76/3 缺位 0.26% 1/383 tinctoria 及紫草科琉璃苣 Borago officinalis 等 6 个 至 22 位区别较大 氨基酸残基间相似性较小 而 基因区分 第 3 阶与蔷薇科杏 Prunus armeniaca 区 分 第 4 阶与葡萄 莲 Lotus japonicus 大豆和蒺 且油茶在第 11 位有 1 缺位 油桐完整的 FAD2 酶 藜苜蓿 Medicago truncatula 等 22 个基因区分 第 5 阶与花生 柠条锦鸡儿 Caragana korshinskii 珙 231 240 位间区别也较大 但氨基酸性质上还有 一定的相似性 在 N 端 60 85 位以及 C 端 370 桐 Davidia involucrata 芝 麻 Sesamum indicum 及 至末端之间有间断性变化 以上说明油桐与油茶 西葫芦等 53 个基因区分 第 6 阶与陆地棉等 5 个 间亲缘上相距甚远 2.4 油桐 FAD2 酶蛋白理化特性分析 基因区分 以上基因的亲缘相距较远 第 7 阶与 毛果杨 蓖麻等 5 个基因区分 第 8 10 阶分别 与乌桕 橡胶树 麻疯树的基因区分 第 11 阶与 千年桐的基因相区分 最后与已登录的油桐 FAD2 N 端的头 6 个氨基酸一致 信号肽 从第 11 位 蛋白比油茶在第 11 位上多 1 个脯氨酸残基 在 运用 DNAMAN 软件对油桐 FAD2 酶蛋白进行 理化特性分析 得知油桐 FAD2 的相对分子质量为 44 144.4 u 蛋白质等电点 pi 为 8.57 基 因 归 在 一 起 BLASTN 发 现 查 询 序 列 与 油 桐 信 号 序 列 是 引 导 前 体 蛋 白 转 移 的 序 列 经 gb AF525534.1 的序列只在 CDS 外紧靠 poly(a) 尾 切除后前体蛋白才能成为具有正常功能的成熟 有 1 个碱基差异 蛋 白 信 号 序 列 预 测 时 设 定 分 值 大 于 3.50 2.3 油桐与油茶 FAD2 氨基酸序列比较 在 蛋 白 质 结 构 的 1 70 个 氨 基 酸 中 最 大 分 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林 值 为 3.8 且 在 第 7 个 氨 基 酸 因 此 信 号 序 列 业局重点实验室在油茶的 cdna 文库构建中克隆 为 1 6 个 氨 基 酸 即 MGAGGR 成 熟 序 列 为
6 谢禄山 等 油桐种子 FAD2 基因全长 cdna 序列分析 第2期 图 3 油桐种子 FAD2 基因的系统关系进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of FAD2 gene from Vernicia fordii seeds 图 4 油桐与油茶 FAD2 氨基酸序列比对 Fig. 4 Sequences alignment of FAD2 amino acid from Vernicia fordii and Camellia oleifera 油桐 FAD2 酶蛋白的氨基酸序列的疏水性分析 MSVPPPPKKLESEVLKRVP YWYNKKF 油桐 FAD2 氨基酸序列的亲水性分析结果表明 结果表明 见图 6 在 55 68 81 90 92 见图 5 在 12 21 35 39 48 49 139 105 118 134 179 197 227 237 239 145 149 155 159 164 201 203 218 270 291 296 361 365 等区段为疏水性区间 223 296 300 331 336 357 360 366 第 1 个和第 3 个组氨酸簇表现为不完全的疏水性 374 381 381 等位置有 13 个亲水性区段 其中 N 端 C 端及中间各有 1 段具强亲水性 而 说明这 2 个组氨酸簇刚好嵌在膜的表面 预测油桐 FAD2 酶蛋白有 5 个跨膜结构域 见 3 个组氨酸簇中间 1 个具亲水性 第 1 和第 3 个表 图 7 所处位置分别在氨基酸序列的 51 76 26 现为不亲水 aa 83 106 24 aa 119 135 17 aa
第 30 卷 经 济 林 研 究 7 179 197 19 aa 240 268 29 aa 这 5 个 疏水性图形有相似性 在酶蛋白肽链的 N C 端各 跨膜结构域基本处在疏水性序列区段 预测图形与 有一段较长的序列位于膜脂层的外面 C 端的更长 Fig. 5 图 5 油桐 FAD2 氨基酸序列的亲水性 Hydrophilicity of FAD2 amino acid sequence from Vernicia fordii Fig. 6 图 6 油桐 FAD2 氨基酸序列的疏水性 Hydrophobicity of FAD2 amino acid sequence from Vernicia fordii 图 7 油桐 FAD2 蛋白质跨膜结构域预测 Fig. 7 Prediction of the transmembrane domain of FAD2 from Vernicia fordii
8 谢禄山 等 油桐种子 FAD2 基因全长 cdna 序列分析 第2期 运 用 DNAMAN 软 件 进 行 油 桐 FAD2 的 蛋 白 126 154 158 165 169 179 187 192 质二级结构预测 结果表明有卷曲 Coils β 折叠 Strands 和 α 螺旋 Helixs 3 种主要结构 197 206 208 223 227 233 236 249 预测准确性为 66.0% 其中卷曲有 23 个 见 379 位 α 螺旋有 8 个 见图 10 其中 3 个较大 图 8 多数只有 3 5 个氨基酸的长度 有 6 个 主要位于肽链的 C 端 分别位于 18 22 118 卷曲较大 10 主要位于肽链的 N 端 卷曲 122 238 245 262 264 287 300 305 所处位置分别在 1 5 9 17 23 54 59 308 327 339 351 361 位 60 69 87 93 99 105 117 127 153 159 164 170 178 188 191 198 205 254 265 271 315 321 362 366 376 3 结论与讨论 209 222 228 232 246 248 255 261 试验所克隆的 FAD2 基因长度为 1 537 bp 含 272 286 301 304 309 314 322 326 有长度为 1 146 bp 106 1 255 bp 的完整编码 340 350 367 375 380 383 位 β 折 叠 链 序列 CDS 在 5 端非编码区 106 bp 和 3 端 共有 18 个 见图 9 均较短 多数只有 3 5 个氨基酸的长度 各折叠所处位置分别在 6 8 非编码区 2 bp 有 1 个长为 19 bp 的 polya 尾 编码 383 个氨基酸 为 FAD2 全长 cdna 序列 55 58 61 68 88 92 100 104 123 在系统进化上 油桐 FAD2 基因与油橄榄 花 图 8 油桐 FAD2 的蛋白质二级结构中的卷曲 Fig. 8 The coils of protein secondary structure of FAD2 from Vernicia fordii 图 9 油桐 FAD2 的蛋白质二级结构中的折叠 Fig. 9 The folds of protein secondary structure of FAD2 from Vernicia fordii
第 30 卷 经 济 林 研 9 究 图 10 油桐 FAD2 的蛋白质二级结构中的螺旋 Fig. 10 The helixs of protein secondary structure of FAD2 from Vernicia fordii 生 芝麻等油料植物的 FAD2 基因间亲缘关系较远 与油茶的亲缘关系更远 而与蓖麻 乌桕 橡胶树 麻疯树等大戟科植物的亲缘关系较近 与千年桐 的亲缘关系最近 油桐 FAD2 酶蛋白的分子量为 44 144.4 u 蛋 白质等电点 pi 为 8.57 在氨基酸序列 N 端起始段 的 6 个氨基酸残基为信号肽序列 酶活性中心的 3 19(7):74 76. [3] 现代农业科技, 2008, (16):113. [4] 不完全的疏水性 说明这 2 个组氨酸簇刚好嵌在 膜的表面 油桐 FAD2 酶蛋白有 5 个跨膜结构域 汪阳东, 李 元, 李 鹏. 油桐桐酸合成酶基因克隆和植物表 达载体构建 [J]. 浙江林业科技,2007, 27(2):1 5. [5] 李建安, 孙 颖, 陈鸿鹏, 等. 油桐 LEAFY 同源基因片段的 克隆与分析 [J]. 中南林业科技大学学报,2008, 28(4): 21 26. [6] 个组氨酸簇高度保守 其中第 2 个组氨酸簇具亲 水性 而第 1 和第 3 个组氨酸簇表现为不亲水和 李永梅, 魏远新, 周大林, 等. 油桐的价值及其发展途径 [J]. 龙洪旭, 谭晓风, 陈 洪, 等. 油桐油体蛋白基因的克隆及序 列分析 [J]. 中南林业科技大学学报,2010, 30(4): 31 38. [7] 李 元, 汪阳东, 李 鹏, 等. 油桐种子 FADX 基因的克隆和 序列分析 [J]. 安徽农业科学,2008,36(11):4753 4755. [8] 周 冠, 汪阳东, 陈益存, 等. 油桐种仁 cdna 文库的构建及 其油体蛋白 oleosin 基因的生物信息学分析 [J]. 林业科学研究, N 端 C 端及中间各有一段表现为强亲水性 位于 2009, 22(2): 177 181. 膜脂层的外面 [9] 参考文献 [10] 谭晓风, 陈鸿鹏, 张党权, 等. 油茶 FAD2 基因全长 cdna 的 谭晓风, 胡芳名, 谢禄山, 等. 油茶种子 EST 文库构建及主要 表达基因的分析 [J]. 林业科学,2006, 42(1): 43 48. [1] 谭晓风. 油桐的生产现状及其发展建议 [J]. 经济林研究,2006, 24(3):62 64. [2] 盖廷亮. 中国油桐生产发展战略研究 [J]. 经济林研究,1999, 克隆和序分析 [J]. 林业科学,2008, 44(3): 70 75. [ 本文编校 闻 丽]