中 国 农 业 科 学 2008,41(8):2419-2424 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.08.028 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 廖 兰 1,2, 饶 勇 1,3, 杨 桂 香 1, 黄 显 会 1, 曾 忠 良 3, 曾 振 灵 1 ( 1 华 南 农 业 大 学 兽 医 学 院 / 广 东 省 兽 药 研 制 和 安 全 评 价 重 点 实 验 室, 广 州 510640; 2 西 南 大 学 荣 昌 校 区, 重 庆 402460; 3 西 南 大 学 药 学 院, 重 庆 400715) 摘 要 : 目 的 建 立 并 验 证 同 时 检 测 诺 氟 沙 星 氧 氟 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 洛 美 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 二 氟 沙 星 噁 喹 酸 萘 啶 酸 和 氟 甲 喹 等 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 在 鸡 蛋 中 残 留 的 高 效 液 相 色 谱 - 荧 光 检 测 分 析 方 法 方 法 鸡 蛋 样 品 以 乙 腈 - 三 氯 乙 酸 溶 液 匀 浆 和 超 声 提 取, 经 反 相 聚 合 物 SPE 净 化 和 浓 缩 ; 样 品 以 乙 腈 - 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液 为 流 动 相 经 C18 柱 HPLC 梯 度 洗 脱 分 离, 用 荧 光 检 测 器 程 序 波 长 检 测 结 果 线 性 范 围 除 达 氟 沙 星 为 5.0~160.0 μg kg -1 外, 其 余 11 种 药 物 为 12.5~400.0 μg kg -1 添 加 6 个 浓 度 测 得 的 校 正 曲 线 的 相 关 系 数 除 氟 甲 喹 为 0.982 以 外, 其 它 11 种 药 物 均 大 于 0.995 添 加 1/2 MRL MRL 2 MRL 共 3 个 浓 度 水 平 3 批 样 品 的 回 收 率 除 萘 啶 酸 为 52% 外, 其 它 11 种 药 物 为 68%~85% 批 内 变 异 系 数 <8%, 批 间 变 异 系 数 除 氟 甲 喹 1/2 MRL 为 18.0% 和 恩 诺 沙 星 1/2 MRL 为 18.8% 外, 其 它 药 物 均 13.0% 12 种 药 物 的 检 测 限 为 0.2~4.1 μg kg -1, 定 量 限 为 0.9~13.5 μg kg -1 结 论 建 立 的 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 简 便 快 速 使 用 有 机 溶 剂 少, 适 用 范 围 广, 适 合 大 量 样 品 的 筛 选 和 定 量 检 测 关 键 词 : 喹 诺 酮 类 ; 残 留 ; 高 效 液 相 色 谱 ; 鸡 蛋 Development of HPLC Method for Multiresidue Determination of 12 Quinolones in Egg LIAO Lan 1, 2, RAO Yong 1, 3, YANG Gui-xiang 1, HUANG Xian-hui 1, ZENG Zhong-liang 3, ZENG Zhen-ling 1 ( 1 College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Development and Safety Evaluation; Guangzhou 510640; 2 Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460; 3 College of Pharmacy, Southwest University, Chongqing 400715) Abstract: Objective A high performance liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection (FLD) was developed and validated for simultaneous determination of residues of 12 quinolones (QNs), norfloxacin (NOR), ofloxacin (OFL), ciproflocacin (CIP), peflocacin (PEF), lomefloxacin (LOM), danofloxacin (DAN), enrofloxacin (ENR), sarafloxacin (SAR), difloxacin (DIF), oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL) and flumequine (FLU) in egg. Method Egg samples were extracted by a homogenater and an ultrasonic cleaner in 10% trichloroacetic acid (TCA) in water acetonitrile (8:2, v/v) and cleared and purified by a solid phase extraction (SPE) cartridges, Strata-X, based on a modified styrene-divinylbenzene polymer. Twelve QNs were separated by C 18 column (Hypersil BDS-C 18 ) with acetonitrile-citric acid/ammonium acetate buffer in water as the mobile phase using a linear gradient elution program and detected with fluorescence detection by means of a wavelength program. Result The tested ranges of quinolone calibrations were 5.0-160.0 μg kg -1 for DAN, 12.5-400.0 μg kg -1 for the other 11 QNs in egg with the correlation coefficients more than 0.995 for 11 QNs exception to FLU (0.982). The validations for egg fortified with 12 QNs at three levels (1/2 MRL, MRL, and 2 MRL) obtained recoveries of 68%-85% exception to NAL (52%), intra-day coefficient of variability (CV) of less 8% and inter-day CV of less 13% exception to ENR (18.8% at 1/2 MRL) and FLU (18.0% at 1/2 MRL), limit of detection (LOD) of 0.2-4.1μg kg -1 and limit of quantification (LOQ) of 0.9-13.5 μg kg -1. Conclusion The results suggested that the method for determination of 12 QNs residues in egg has a simple, fast sample treatment procedure with a little consumption of 收 稿 日 期 :2007-10-25; 接 受 日 期 :2008-01-07 基 金 项 目 : 科 技 部 食 品 安 全 重 大 项 目 (2001BA804A18-04) 作 者 简 介 : 廖 兰 (1969-), 女, 重 庆 荣 昌 人, 实 验 师, 硕 士, 研 究 方 向 为 兽 医 药 理 学 与 毒 理 学 E-mail:liaolan69@163.com 通 讯 作 者 曾 振 灵 (1963-), 男, 广 东 兴 宁 人, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 兽 医 药 理 学 与 毒 理 学, 动 物 源 食 品 安 全 Tel:020-85280237;Fax:020-85284896;E-mail: zlzeng@scau.edu.cn
2420 中 国 农 业 科 学 41 卷 organic solvent and an extensive applicability. It could meet the screening and quantification requirements for residue analysis. Key words: Quinolones; Residue; High performance liquid chromatography (HPLC); Egg 0 引 言 研 究 意 义 喹 诺 酮 类 药 物 (quinolones,qns) 是 一 类 新 型 高 效 广 谱 的 人 工 合 成 抗 菌 药, 在 人 医 和 兽 医 临 床 上 都 应 用 广 泛 随 着 QNs 在 食 品 动 物 中 大 量 使 用, 微 生 物 的 耐 药 性 越 来 越 严 重 [1], 而 且 残 留 于 食 品 中 的 药 物 会 直 接 危 害 消 费 者 健 康 及 影 响 动 物 性 产 品 的 出 口 贸 易, 因 此, 世 界 各 国 近 年 来 加 强 了 QNs 在 动 物 性 食 品 中 的 残 留 监 控 前 人 研 究 进 展 在 检 测 QNs 残 留 的 标 准 方 法 中, 欧 盟 在 1994 年 发 布 了 检 测 环 丙 沙 星 和 恩 诺 沙 星 在 猪 肉 熏 肉 和 牛 肉 中 残 留 的 HPLC 方 法 [2], 中 国 在 2003 年 公 布 了 动 物 性 食 品 中 恩 诺 沙 星 和 环 丙 沙 星 残 留 检 测 方 法 噁 喹 酸 和 氟 甲 喹 在 鸡 组 织 和 鱼 组 织 的 残 留 检 测 方 法 高 效 液 相 色 谱 法 等 3 种 方 法 [3] [4] 在 常 规 分 析 方 面, 曾 振 灵 等 建 立 了 9 种 FQs 在 鸡 蛋 中 的 多 残 留 HPLC 检 测 方 法, 此 检 测 方 法 在 色 谱 条 件 的 筛 选 方 面 做 了 很 多 出 色 的 工 作, 但 只 能 检 测 恩 诺 沙 星 等 呈 两 性 的 FQs, 而 不 能 检 测 氟 甲 喹 等 [5] 呈 酸 性 QNs Yang 等 建 立 了 11 种 QNs 在 牛 奶 中 的 多 残 留 HPLC 检 测 方 法, 此 方 法 采 用 了 固 相 萃 取 净 化 样 品 曲 线 梯 度 洗 脱 和 波 长 变 化 等 技 术 手 段, 但 检 测 时 间 太 长 本 研 究 切 入 点 目 前, 在 国 内 专 门 研 究 鸡 蛋 中 QNs 的 多 残 留 检 测 方 法 少, 能 同 时 分 析 两 性 和 酸 性 QNs 的 方 法 还 未 见 报 道 拟 解 决 的 关 键 问 题 本 研 究 拟 建 立 中 国 兽 医 临 床 可 能 应 用 于 鸡 蛋 的 12 种 QNs 的 HPLC 残 留 检 测 方 法, 能 同 时 测 定 包 括 9 种 呈 两 性 的 药 物 [ 诺 氟 沙 星 (norfloxacin,nor) 氧 氟 沙 星 (ofloxacin,ofl) 培 氟 沙 星 (pefloxacin,pef) 环 丙 沙 星 (ciprofloxacin, CIP ) 洛 美 沙 星 (lomefloxacin,lom) 达 氟 沙 星 (danofloxacin, DAN) 恩 诺 沙 星 (enrofloxacin,enr) 沙 拉 沙 星 (sarafloxacin,sar) 二 氟 沙 星 (difloxacin,dif)] 和 3 种 呈 酸 性 药 物 [ 噁 喹 酸 (oxolinic acid,oxo) 萘 啶 酸 (nalidixic acid,nal) 氟 甲 喹 (flumequine, FLU)], 所 建 立 方 法 要 具 有 简 便 快 速 使 用 有 机 溶 剂 少 适 用 范 围 广, 适 合 大 量 样 品 的 筛 选 和 定 量 检 测, 为 中 国 的 兽 药 残 留 监 控 工 作 服 务 1 材 料 与 方 法 1.1 试 剂 对 照 品 : 盐 酸 环 丙 沙 星 甲 磺 酸 培 氟 沙 星 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星, 中 国 兽 医 药 品 监 察 所 ; 甲 磺 酸 达 氟 沙 星, 广 东 燕 塘 兽 药 有 限 公 司 ; 洛 美 沙 星, 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ; 盐 酸 二 氟 沙 星, 广 州 惠 华 动 物 保 健 品 有 限 公 司 ; 噁 喹 酸 萘 啶 酸 和 氟 甲 喹,Sigma 公 司 乙 腈 为 色 谱 纯 ; 水 为 符 合 GB/T 6682 规 定 的 二 级 水 ; 柠 檬 酸 乙 酸 铵 三 乙 胺 乙 腈 甲 醇 三 氯 乙 酸 (TCA) 磷 酸 二 氢 钠 磷 酸 氢 二 钠 均 为 分 析 纯 1.2 设 备 高 效 液 相 色 谱 仪 :Waters 2695 分 离 系 统 在 线 负 压 脱 气 机 2475 荧 光 检 测 器 自 动 进 样 器 柱 温 箱, Empower 色 谱 工 作 站, 美 国 Waters 电 子 分 析 天 平 : AE160 型, 瑞 士 Mettler; 离 心 机 :Universal-16 型, 德 国 Hettich,5415D 型, 德 国 Eppendorf 组 织 匀 浆 机 超 声 波 洗 涤 仪 :HS10260D 型, 天 津 市 东 科 仪 器 设 备 有 限 公 司 旋 涡 混 合 仪 :MSI 型, 马 来 西 亚 IKA 多 功 能 振 荡 器 :HS250 Basic 型, 德 国 IKA 氮 气 浓 缩 仪 :TurboVap LV 型, 配 备 5 ml 20 ml 玻 璃 试 管, 美 国 Zymark 可 调 微 量 移 液 器 :Eppendorf Research 型, 德 国 Eppendorf 负 压 固 相 萃 取 装 置 : 配 备 真 空 泵, 美 国 Waters 反 相 聚 合 物 SPE 柱 :Strata-X,60 mg/3 ml, Phenomenex 1.3 试 液 1.3.1 单 药 标 准 贮 备 液 用 0.5 ml 0.5 mol L -1 NaOH 溶 解 对 照 品, 甲 醇 定 容 至 10 ml, 各 药 物 的 浓 度 为 1 mg ml -1 使 用 期 为 6 个 月 以 内 1.3.2 混 合 药 物 标 准 中 间 工 作 液 取 达 氟 沙 星 标 准 贮 备 液 4.0 ml, 用 甲 醇 定 容 到 10 ml 成 浓 度 为 400 μg ml -1 分 别 取 达 氟 沙 星 溶 液 (400 μg ml -1 ) 和 其 它 11 种 单 药 标 准 贮 备 液 (1 000 μg ml -1 ) 各 40 μl, 以 甲 醇 定 容 至 10 ml, 即 成 8 MRL 10 的 混 合 标 准 工 作 液 置 4 保 存, 使 用 期 为 1 个 月 以 内 1.3.3 混 合 药 物 系 列 标 准 工 作 液 ( 10) 按 2 倍 稀 释 法 配 制 10 倍 浓 度 混 合 药 物 系 列 标 准 工 作 液 :8 MRL 4 MRL 2 MRL MRL 1/2 MRL 和 1/4 MRL 1.3.4 样 品 提 取 液 含 三 氯 乙 酸 (TCA)10%(m/v) 和 乙 腈 20%(v/v) 的 水 溶 液 1.3.5 PBS 缓 冲 液 称 取 NaH 2 PO 4 2H 2 O 14.50 g 和 Na 2 HPO 4 12H 2 O 1.482 g, 用 蒸 馏 水 定 容 至 1 L
8 期 廖 兰 等 : 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 2421 1.3.6 样 品 淋 洗 液 10%(v/v) 甲 醇 - 水 溶 液 1.3.7 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液 称 取 10.5598 g 柠 檬 酸 和 7.8650 g 乙 酸 铵, 用 纯 净 水 定 容 至 1 L, 加 三 乙 胺 1 ml,0.45 μm 过 滤, 为 流 动 相 的 水 相 1.3.8 流 动 相 量 取 色 谱 纯 乙 腈 10 ml, 用 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液 定 容 至 100 ml 1.4 样 品 前 处 理 过 程 1.4.1 试 样 的 制 备 取 鸡 蛋 3~5 枚, 去 蛋 壳, 食 品 均 质 器 处 理 3 min -20 以 下 保 存 备 用 1.4.2 提 取 样 品 室 温 解 冻, 称 样 (2.0±0.01)g, 加 PBS 缓 冲 液 4.0 ml, 涡 旋 30 s 加 样 品 提 取 液 10 ml, 组 织 匀 浆 机 10 000 r/min 匀 浆 3 min, 另 用 5 ml 提 取 液 洗 刀 头 和 匀 浆 杯, 合 并 样 液, 涡 旋 30 s; 超 声 处 理 5 min;8 000 g 离 心 6 min; 样 液 用 10 ml 蒸 馏 水 稀 释 后 供 SPE 净 化 1.4.3 SPE 净 化 将 反 相 聚 合 物 SPE 柱 (Strata-X) 以 3 ml 甲 醇 活 化,3 ml 蒸 馏 水 平 衡 ; 将 样 品 液 加 入 SPE 柱 上 接 的 贮 液 库 中, 过 柱 流 速 约 为 1~2 ml min -1 ; 样 品 淋 洗 液 3 ml 淋 洗, 抽 干 ; 甲 醇 3 ml 洗 脱, 抽 干 洗 脱 液 于 60~70 氮 气 ( 或 者 空 气 ) 吹 干, 用 1 000 μl 流 动 相 溶 解 残 留 物, 涡 旋 混 匀,12 000 g 离 心 6 min, 上 清 液 供 HPLC 测 定 1.5 测 定 色 谱 柱 :C 18 ( 封 尾 ),250 mm 4.6 mm(i.d), 粒 径 5 μm, 大 连 伊 利 特 分 析 仪 器 有 限 公 司 保 护 柱 : C 18,4 mm 3.0 mm(i.d),phenomenex 柱 温 :50 进 样 量 :40 μl 流 动 相 A 液 为 乙 腈 B 液 为 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液,A 液 的 变 化 为 :0~11 min,9%;11~ 20 min,9%~29%;20~25 min,29%~37%;25.01 min, 9% 流 速 2 ml min -1 荧 光 检 测 器 检 测 波 长 :9 种 FQs(NOR OFL CIP PEF LOM DAN ENR DAR 和 DIF)Ex=278 nm,em=465 nm;3 种 QNs(FLU NAL 和 OXO) Ex=312 nm,em=366 nm 波 长 变 化 的 时 间 在 DIF 和 OXO 之 间, 不 同 的 试 验 条 件 下 保 留 时 间 可 能 会 发 生 变 化, 测 定 前 应 预 测 保 留 时 间 1.6 校 正 曲 线 和 线 性 范 围 称 取 (2.0±0.01)g 空 白 鸡 蛋 试 样, 加 系 列 混 合 标 准 工 作 液 (1.3.3)200 μl, 按 1.4 方 法 进 行 样 品 前 处 理 和 按 1.5 方 法 测 定 添 加 1/4 MRL 1/2 MRL MRL 2 MRL 4 MRL 和 8 MRL 共 6 个 浓 度, 各 浓 度 水 平 包 含 3 个 重 复 样 品 将 3 个 重 复 样 品 的 色 谱 峰 面 积 的 平 均 值 (Y) 和 相 对 应 的 药 物 质 量 浓 度 (X) 进 行 线 性 回 归, 得 到 各 个 药 物 的 校 正 曲 线 1.7 回 收 率 测 定 和 变 异 系 数 测 定 将 10 浓 度 的 混 合 标 准 工 作 液 (1.3.3)200 μl 加 入 到 2.0 g 空 白 鸡 蛋 中, 按 方 法 1.4 进 行 样 品 处 理 和 1.5 分 析, 测 定 1/2 MRL MRL 和 2 MRL 共 3 个 浓 度 水 平, 每 一 添 加 水 平 包 括 6 个 重 复 样 品 ; 同 时 测 定 相 同 浓 度 的 标 准 液 ( 取 10 浓 度 的 混 合 标 准 工 作 液 200 μl, 加 800 μl 流 动 相, 混 匀 ) 以 相 应 水 平 的 标 准 液 为 校 正 点, 用 单 点 校 正 的 方 法 以 EMPOWER 工 作 站 处 理 得 到 添 加 样 品 的 实 测 浓 度 批 内 变 异 系 数 为 各 个 添 加 水 平 的 6 个 重 复 样 品 (n=6); 批 间 变 异 系 数 为 各 个 添 加 水 平 在 不 同 的 日 期 共 做 3 个 批 次 的 所 有 重 复 样 品 (n=18) 不 同 批 次 时 间 间 隔 为 1 d 或 1 d 以 上, 可 能 由 不 同 的 操 作 者 试 验 1.8 灵 敏 度 测 定 计 算 回 收 率 测 定 的 最 低 质 量 浓 度 (1/4 MRL) 的 18 个 添 加 样 品 的 HPLC 色 谱 图 的 信 号 / 噪 声 比 (S/N) 的 平 均 值, 计 算 检 测 限 (LOD)=3 S/N 和 定 量 限 (LOQ) =10 S/N 2 结 果 与 分 析 2.1 色 谱 图 空 白 鸡 蛋 样 品 没 有 干 扰, 结 果 见 图 1 1/2 MRL 标 样 和 添 加 于 空 白 鸡 蛋 样 品 的 HPLC-FLD 的 色 谱 图 分 别 见 图 2 和 图 3 12 种 药 物 的 保 留 时 间 (min) 为 : NOR 8.30 OFL 8.99 CIP 9.62 PEF 10.44 LOM 12.64 DAN 13.38 ENR 15.20 SAR 16.23 DIF 17.22 OXO 18.23 NAL 21.91 FLU 22.72, 所 有 药 物 均 达 到 了 基 线 分 离, 分 离 度 好 图 1 空 白 鸡 蛋 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 1 Chromatogram of blank egg by HPLC 2.2 标 准 曲 线 和 线 性 范 围 添 加 1/4 MRL 1/2 MRL MRL 2 MRL 4 MRL 和 8 MRL 共 6 个 浓 度 水 平, 各 水 平 包 含 3 个 重 复 样 品 结 果 见 表 1 NOR OFL CIP PEF LOM ENR
2422 中 国 农 业 科 学 41 卷 各 药 物 浓 度 分 别 为 25 μg kg -1 (NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU) 和 10 μg kg -1 (DAN) 下 同 Concentritions of 12 QNs are 25 μg kg -1 (NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU) and 10 μg kg -1 (DAN) respectively. The same as below 图 2 12 种 QNs 标 样 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 2 Chromatogram of 12 QNs stand solution by HPLC SAR DIF OXO NAL 和 FLU 11 种 药 物 的 线 性 范 围 定 为 12.5~400 μg kg -1,DAN 的 线 性 范 围 定 为 5.0~ 160 μg kg -1 在 上 述 的 线 性 范 围 内, 添 加 6 个 浓 度 测 得 的 校 正 曲 线 的 相 关 系 数 除 FLU 为 0.982 以 外, 其 它 11 种 QNs 均 大 于 0.995, 表 明 线 性 关 系 良 好 2.3 回 收 率 与 变 异 系 数 鸡 蛋 添 加 1/2 MRL MRL 2 MRL 共 3 个 浓 度 药 物 的 3 批 回 收 率 和 变 异 系 数 见 表 2 回 收 率 除 个 别 药 物 较 低 (NAL 为 52%) 外, 其 它 11 种 均 大 于 70% 批 内 变 异 系 数 <8%, 批 间 变 异 系 数 除 个 别 药 物 较 大 外 ( 如 FLU 的 3 个 浓 度 分 别 为 18.0% 14.9% 10.6%, ENR 在 1/2 MRL 为 18.8%), 其 它 各 药 物 和 各 浓 度 的 变 异 系 数 均 13% 表 2 鸡 蛋 中 添 加 12 种 QNs 的 回 收 率 和 变 异 系 数 Table 2 Recoveries and CVs of 12 QNs spiked in egg 药 物 QNs 回 收 率 Recovery (%) 变 异 系 数 CV (%) 1/2 MRL MRL 2 MRL 1/2 MRL MRL 2 MRL NOR 79.0 79.2 78.1 5.3 4.9 3.2 OFL 84.1 81.5 79.9 4.8 4.4 2.8 CIP 83.5 82.1 79.8 5.5 10.2 3.9 图 3 空 白 鸡 蛋 添 加 12 种 QNs 标 样 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 3 Chromatogram of egg spiked 12 QNs 1/2 MRL stand by HPLC 表 1 鸡 蛋 添 加 12 种 QNs 的 校 正 曲 线 Table 1 Calibration curves of 12 QNs spiked in egg 药 物 QNs 添 加 浓 度 Ranges of conc. 回 归 方 程 Regression equations 相 关 系 数 r (μg kg -1 ) NOR 12.5~400 Y = 3.36 10 4 X + 2.67 10 4 0.99838 OFL 12.5~400 Y = 1.37 10 4 X + 4.46 10 4 0.99684 CIP 12.5~400 Y = 2.67 10 4 X + 7.90 10 4 0.99829 PEF 12.5~400 Y = 5.30 10 4 X - 1.54 10 2 0.99876 LOM 12.5~400 Y = 1.77 10 4 X - 1.38 10 4 0.99864 DAN 5.0~160 Y = 1.92 10 5 X - 6.72 10 3 0.99911 ENR 12.5~400 Y = 5.27 10 4 X + 1.22 10 5 0.99855 SAR 12.5~400 Y = 2.01 10 4 X + 1.94 10 4 0.99853 DIF 12.5~400 Y = 2.71 10 4 X - 7.42 10 3 0.99850 OXO 12.5~400 Y = 1.18 10 4 X + 1.23 10 4 0.99820 NAL 12.5~400 Y = 5.37 10 3 X + 1.43 10 4 0.99462 FLU 12.5~400 Y = 1.60 10 4 X + 1.04 10 5 0.98216 X 为 药 物 浓 度 ;Y 为 峰 面 积 X is concentration of QNs; Y is peak area PEF 81.9 82.8 81.2 4.0 6.5 3.5 LOM 78.7 77.0 75.2 5.5 5.8 5.6 DAN 78.5 78.1 76.7 6.2 3.9 4.3 ENR 78.0 77.9 76.0 18.8 4.8 3.8 SAR 72.0 70.2 68.4 4.3 7.7 4.3 DIF 74.8 72.5 68.9 7.0 11.8 7.1 OXO 79.3 79.4 73.9 7.4 13.0 6.2 NAL 51.7 52.2 52.2 5.8 4.7 6.5 FLU 76.0 74.0 71.8 18.0 14.9 10.6 n=18 2.4 灵 敏 度 鸡 蛋 中 12 种 QNs 的 LOD 和 LOQ 见 表 3,LOD 为 0.2~4.1 μg kg -1,LOQ 为 0.9~13.5 μg kg -1 DAN 灵 敏 度 最 高 (LOD=0.2 μg kg -1,LOQ=0.9 μg kg -1 ), 氧 氟 沙 星 的 灵 敏 度 最 低 (LOD=4.1 μg kg -1,LOQ=13.5 μg kg -1 ), 均 能 达 到 残 留 分 析 的 要 求 3 讨 论 3.1 药 物 的 提 取 方 法 鸡 蛋 中 含 有 大 量 的 水 分 蛋 白 质 和 卵 磷 脂, 因 此 样 品 的 提 取 和 净 化 的 主 要 目 的 是 沉 淀 蛋 白 质 和 去 脂
8 期 廖 兰 等 : 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 2423 表 3 鸡 蛋 中 添 加 12 种 QNs 的 灵 敏 度 Table 3 LODs and LOQs for 12 QNs spiked in egg 药 物 QNs 保 留 时 间 Ret. time(min) LOD (μg kg -1 ) LOQ (μg kg -1 ) NOR 8.30 1.4 4.6 OFL 8.99 4.1 13.5 CIP 9.62 1.8 5.9 PEF 10.44 0.9 3.1 LOM 12.64 1.4 4.6 DAN 13.38 0.2 0.7 ENR 15.20 0.6 1.9 SAR 16.23 1.1 3.6 DIF 17.22 0.6 2.1 OXO 18.23 1.6 5.4 NAL 21.91 2.4 7.8 FLU 22.72 1.4 5.6 肪 沉 淀 蛋 白 常 用 的 方 法 有 使 用 乙 醇 甲 醇 和 乙 腈 等 有 机 溶 剂, 或 者 用 乙 酸 甲 酸 磷 酸 和 三 氯 乙 酸 等 酸 性 的 溶 液, 在 建 立 本 方 法 的 过 程 中, 进 行 过 以 上 各 种 沉 淀 蛋 白 方 法 的 比 较, 若 用 有 机 溶 剂 提 取, 虽 然 回 收 率 较 好, 但 一 般 都 需 要 先 挥 发 掉 有 机 溶 剂 后 才 能 进 行 SPE 等 净 化 处 理, 增 加 了 操 作 的 复 杂 性, 同 时, 大 量 有 机 溶 剂 的 使 用 不 利 于 废 液 的 处 理 及 环 境 保 护 在 比 较 各 种 酸 对 蛋 白 的 沉 淀 过 程 中, 三 氯 乙 酸 的 效 果 明 显 较 乙 酸 甲 酸 和 磷 酸 的 效 果 好, 而 加 入 了 柠 檬 酸 后, 沉 淀 蛋 白 的 效 果 很 差, 溶 液 呈 混 浊 状 态, 很 难 进 行 净 [6] 化 Posyniak 等 研 究 表 明 提 取 液 中 乙 腈 的 比 例 与 样 品 的 回 收 率 及 提 取 的 杂 质 的 量 有 较 大 的 关 系, 在 鸡 肝 和 鸡 肉 提 取 时 用 10% 三 氯 乙 酸 : 乙 腈 (8:2,v/v) 混 合 液, 效 果 最 为 理 想 笔 者 的 研 究 证 实 了 此 提 取 溶 剂 也 适 合 对 鸡 蛋 的 处 理, 为 了 不 影 响 在 SPE 柱 上 的 保 留, 样 液 要 用 水 或 者 PBS 液 稀 释 到 乙 腈 的 含 量 低 于 10% 在 加 入 10% 三 氯 乙 酸 : 乙 腈 (8:2,v/v) 混 合 液 提 取 之 前, 加 入 2 倍 量 的 ph 7.4 PBS 液 的 目 的 是 调 节 ph 和 防 止 加 入 提 取 液 后 蛋 白 质 迅 速 变 性 而 形 成 大 块 的 沉 淀 为 了 提 取 更 为 充 分, 采 用 了 先 高 速 匀 浆 再 用 超 声 波 处 理 的 提 取 过 程 3.2 净 化 方 法 在 QNs 残 留 分 析 方 法 中, 常 用 的 净 化 方 法 包 括 液 - 液 萃 取 (liquid-liquid extraction,lle) 固 相 萃 取 (solid phase extraction, SPE ) 免 疫 亲 和 层 析, 据 [7] Hernández-Arteseros 等 的 统 计, 在 分 析 QNs 残 留 的 净 化 方 法 中,LLE 占 34% SPE 占 26% LLE+SPE 占 8%, 无 特 定 净 化 方 法 占 21% LLE 为 传 统 的 净 化 方 法, 一 般 需 要 消 耗 大 量 的 有 机 溶 剂, 净 化 的 选 择 性 差 ; 免 疫 亲 和 层 析 的 选 择 性 很 高, 但 要 获 得 理 想 的 抗 体 难 度 很 大, 抗 体 性 质 的 稳 定 性 和 检 测 成 本 使 此 类 净 化 方 法 应 用 受 到 很 大 的 限 制 SPE 方 法 具 有 简 便 快 速 选 择 性 较 强 使 用 有 机 溶 剂 少 等 优 点 Strata-X SPE 柱 的 填 料 是 新 型 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 (styrene divinylbenzene) 聚 合 物, 和 传 统 的 C 18 柱 相 比, 具 有 高 保 留 效 率, 柱 容 量 可 达 10% 填 料, 少 量 的 填 料 就 可 以 净 化 大 量 的 样 品, 流 速 快 且 均 匀, 操 作 简 便 和 能 重 复 使 用 等 优 点 3.3 测 定 方 法 HPLC 是 分 析 QNs 应 用 最 为 广 泛 的 分 析 方 法, 其 检 测 器 通 常 使 用 的 是 紫 外 检 测 器 (UVD, 包 括 二 极 管 阵 列 检 测 器 ) 和 荧 光 检 测 器 (FLD), 因 为 FLD 较 UVD 有 更 高 的 选 择 性 和 灵 敏 度, 所 以 后 者 应 用 更 多 [8] 但 有 个 别 化 合 物 如 麻 保 沙 星 (marbofloxacin) 和 伊 诺 沙 星 (enofloxacin) 用 UVD 检 测 更 为 灵 敏 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 方 法 作 为 此 类 药 物 的 确 证 有 较 多 研 究 报 道 [9~16] 本 文 所 检 测 的 12 种 QNs 包 括 9 种 呈 两 性 的 FQs(NOR,OFL,PEF,CIP,LOM,DAN, ENR,SAR,DIF) 和 3 种 呈 酸 性 的 QNs(OXO,NAL, FLU), 这 两 类 化 合 物 的 检 测 波 长 有 较 大 的 差 异, 因 此 采 用 了 程 序 波 长 变 化 来 同 时 检 测 该 两 类 药 物,FQs 为 Ex=278 nm,em=465 nm;qns 为 Ex=312 nm, Em=366 nm 为 了 能 有 效 分 离 12 种 药 物, 采 用 了 等 度 与 梯 度 相 结 合 的 洗 脱 方 式 3.4 灵 敏 度 在 中 国, 鸡 蛋 中 只 规 定 了 OXO 的 MRL 为 50 μg kg -1 [17], 其 它 QNs 的 MRL 参 照 OXO 的 标 准 暂 定 为 50 μg kg -1,DAN 的 荧 光 反 应 性 很 强, 灵 敏 度 更 高, 其 MRL 暂 定 为 20 μg kg -1 提 高 灵 敏 度 的 措 施 有 : 样 品 分 析 量 为 2 g 而 上 机 前 定 容 为 1 ml, 相 当 于 样 品 浓 缩 了 2 倍 ; 采 用 高 效 的 梯 度 洗 脱 分 离, 提 高 柱 效 ; 进 样 量 为 40 μl 4 结 论 建 立 了 12 种 QNs 在 鸡 蛋 中 残 留 的 HPLC-FLD 分 析 方 法, 能 同 时 分 析 9 种 FQs 和 3 种 酸 性 的 QNs, 具 有 操 作 简 便 快 速 和 适 用 范 围 广 等 优 势 References [1] Appelbaum P C, Hunter P A. The fluoroquinolone antibactetials: past,
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