花 青 素 及 原 花 青 素 综 述 和 提 取 分 析 手 段 1. 前 言 1.1 花 青 素 花 青 素 (Anthocyanidin), 又 称 花 色 素, 是 自 然 界 一 类 广 泛 存 在 于 植 物 中 的 水 溶 性 天 然 色 素, 属 黄 酮 类 化 合 物 也 是 植 物 花 瓣 中 的 主 要 呈 色 物 质, 水 果 蔬 菜 花 卉 等 颜 色 大 部 分 与 之 有 关 在 植 物 细 胞 液 泡 不 同 的 ph 值 条 件 下, 使 花 瓣 呈 现 五 彩 缤 纷 的 颜 色 在 酸 性 条 件 下 呈 红 色, 其 颜 色 的 深 浅 与 花 青 素 的 含 量 呈 正 相 关 性, 可 用 分 光 光 度 计 快 速 测 定, 在 碱 性 条 件 下 呈 蓝 色 花 青 素 的 颜 色 受 许 多 因 子 的 影 响, 低 温 缺 氧 和 缺 磷 等 不 良 环 境 也 会 促 进 花 青 素 的 形 成 和 积 累 图 一 图 二 花 青 素 的 基 本 结 构 单 元 是 2 一 苯 基 苯 并 吡 喃 型 阳 离 子, 即 花 色 基 元 ( 图 一 ) 现 已 知 的 花 青 素 有 20 多 种, 主 要 存 在 于 植 物 中 的 有 : 天 竺 葵 色 素 (Pelargonidin) 矢 车 菊 色 素 或 芙 蓉 花 色 素 (Cyanidin) 翠 雀 素 或 飞 燕 草 色 (Delphindin) 芍 药 色 素 (Peonidin) 牵 牛 花 色 素 (Petunidin) 及 锦 葵 色 素 (Malvidin)( 图 二 ) 自 然 条 件 下 游 离 状 态 的 花 青 素 极 少 见, 主 要 以 糖 苷 形 式 存 在, 花 青 素 常 与 一 个 或 多 个 葡 萄 糖 鼠 李 糖 半 乳 糖 阿 拉 伯 糖 等 通 过 糖 苷 键 形 成 花 色 苷 ( 图 三 ) 萝 卜 红 色 素 主 要 成 分 为 天 竺 葵 色 素 (Pelargonidin) 葡 萄 糖 花 色 苷 花 青 素 因 种 类 较 多, 其 基 本 结 构 分 子 量 约 287, 因 R1 及 R2 取 代 基 不 同 分 子 量 有 变 化, 且 一 般 花 青 素 都 以 花 色 苷 形 式 存 在, 故 还 应 加 上 形 成 花 色 苷 的 糖 的 分 子 量, 故 花 色 苷 分 子 量 大 多 介 于 430-530 之 间
图 三 1.2 原 花 青 素 原 花 青 素, 简 称 OPC, 是 一 种 有 着 特 殊 分 子 结 构 的 生 物 类 黄 酮, 是 目 前 国 际 上 公 认 的 清 除 人 体 内 自 由 基 最 有 效 的 天 然 抗 氧 化 剂 一 般 为 红 棕 色 粉 末, 气 微 味 涩, 溶 于 水 和 大 多 有 机 溶 剂 最 新 研 究 表 明 蓝 莓 叶 提 取 物 原 花 青 素 可 阻 止 丙 肝 病 毒 复 制 图 四 图 五 在 结 构 上, 原 花 青 素 是 由 不 同 数 量 的 儿 茶 素 (catechin)( 图 四 ) 或 表 儿 茶 素 (epicatechin) ( 图 五 ) 结 合 而 成 最 简 单 的 原 花 青 素 是 儿 茶 素 或 表 儿 茶 素 或 儿 茶 素 与 表 儿 茶 素 形 成 的 二 聚 体, 此 外 还 有 三 聚 体 四 聚 体 等 直 至 十 聚 体 按 聚 合 度 的 大 小, 通 常 将 二 ~ 五 聚 体 称 为 低 聚 原 花 青 素 ( 简 称 OPC), 将 五 聚 体 以 上 的 称 为 高 聚 原 花 青 素 ( 简 称 PPC) 原 花 青 素 可 看 做 是 聚 合 物, 单 体 分 子 量 分 别 为 308,290 且 原 花 青 素 通 常 为 多 聚 体 的 混 合 物, 平 均 分 子 量 越 小 证 明 其 聚 合 度 越 低, 生 理 活 性 也 就 越 强 原 花 青 素 纯 度 通 常 是 指 所 有 原 花 青 素 总 的 纯 度, 没 有 指 明 单 独 二 聚 体 或 三 聚 体 的 的 纯 度, 故 评 价 原 花 青 素 同 时 要 看 平 均 分 子 量, 若 分 子 量 太 大, 虽 然 纯 度 高 但 生 理 活 性 不 强 原 花 青 素 的 基 本 结 构 单 元 为 儿 茶 素 和 表 儿 茶 素, 最 简 单 的 原 花 青 素 是 儿 茶 素 或 表 儿 茶 素 或 儿 茶 素 与 表 儿 茶 素 形 成 的 二 聚 体, 此 外 还 有 三 聚 体 四 聚 体 等 直 至 十 聚 体 平 均 聚 含 度 (mdp) 范 围 从 2 到 大 于 15, 平 均 分 子 量 从 578 到 大 于 5000Dalton, 结 构 见 下 图 (Kennedy JA,Jones GP,2001) 按 聚 合 度 的 大 小, 通 常 将 二 聚 体 ~ 四 聚 体 称 为 低 聚 体 (procyanidolie oligomers, 简 称 OPC s), 将 五 聚 体 以 上 的 称 为 高 聚 体 (procyanidolicpolymers, 简 称 PPC)( 国 植 和 徐 莉,1996) 二 聚 体 中, 因 两 个 单 体 的 构 象 或 键 合 位 置 的 不 同, 可 有 多 种 异 构 体, 已 分 离 鉴 定 的 8 种 结 构 形 式 分 别 命 名 为 B1~B8, 其 中 B1~B4 是 由 C4 一 C8 键 合,B5 一 B8 由 C4 一 C6 键 合 在 各 类 原 花 青 素 中, 二 聚 体 分 布 最 广, 研 究 最 多, 是 最 重 要 的 一 类 原 花 青 素 三 聚 体 中, 也 因 组 成 的 单 体 及 其 相 连 接 碳 原 子 位 置 的 不 同 形 成 各 种 各 样 的 结 构 并 命 名 为 C1 C2 等 等 其 中 cl 在 自 然 界 中 分 布 最 丰 富 (BombardelliE,et a1.1995)
图 六 : 原 花 青 素 结 构 通 式
图 七 : 原 花 青 素 低 聚 体 结 构 式 1.3 二 者 的 区 别 与 联 系 原 花 青 素 (OPC) 存 在 于 葡 萄 籽 银 杏 叶 柏 树 松 树 皮 黑 米 种 皮 玫 瑰 花 等 植 物 中, 是 一 种 天 然 的 超 强 抗 氧 化 剂 花 青 素 (VMA) 主 要 存 在 于 蓝 莓 果 实 紫 薯 葡 萄 皮 中 最 主 要 的 作 用 是 能 缓 解 眼 部 疲 劳, 加 速 维 生 素 A 在 视 网 膜 上 合 成 视 紫 质 的 速 度 其 清 除 自 由 基 抗 氧 化 的 能 力 远 不 及 OPC 两 者 是 不 同 的 物 质 但 OPC 在 植 物 体 内 能 转 变 成 VMA, 所 以 叫 原 花 青 素 2. 来 源 发 展 现 状 及 市 场 需 求 2.1 来 源 花 青 素 在 植 物 中 广 泛 存 在, 自 然 界 有 超 过 300 种 不 同 的 花 青 素 葡 萄 是 花 色 苷 色 素 的 主 要 来 源 不 同 的 水 果 和 蔬 菜 也 是 它 们 的 良 好 来 源 如 紫 甘 蓝 紫 甘 薯 越 橘 酸 果 蔓 红 莓 草 莓 葡 萄 ( 尤 其 是 葡 萄 皮 籽 ) 红 醋 栗 黑 醋 栗 樱 桃 蔓 越 莓 蓝 莓 ( 越 橘 ) 桑 椹 茄 子 皮 山 楂 皮 接 骨 木 红 黑 加 仑 紫 胡 萝 卜 和 红 甘 蓝 等 红 紫 紫 红 蓝 色 颜 色 的 蔬 菜 水 果 或 浆 果 原 花 青 素 在 自 然 界 中 广 泛 存 在, 人 们 对 它 的 研 究 已 有 30 多 年 历 史, 特 别 是 自 80 年 代 以
来, 全 世 界 对 原 花 青 素 的 研 究 日 益 广 泛 和 深 入, 研 究 人 员 主 要 针 对 下 列 植 物 的 原 花 青 素 进 行 了 研 究 : 葡 萄, 英 国 山 楂, 单 子 山 楂, 花 生, 银 杏, 日 本 罗 汉 柏, 北 美 崖 柏, 土 耳 其 侧 柏, 花 旗 松, 白 桦 树, 野 生 刺 葵 风 凰, 番 荔 枝, 野 草 莓, 日 本 莽 草, 扁 桃, 高 梁, 耳 叶 番 泻 桂 皮, 两 谷 椰 子, 可 可 豆, 贯 叶 金 丝 桃, 粘 胶 乳 香 树, 海 岸 松, 洋 委 陵 菜, 雉 子 延 和 大 黄 等 此 外 还 用 银 杏 花 旗 松 茶 子 的 叶 和 小 连 翘 进 行 了 组 织 培 养 研 究 除 植 物 外, 葡 萄 汁 红 葡 萄 酒 苹 果 汁 苹 果 酒 和 啤 酒 中 也 都 含 有 原 花 青 素 几 十 年 来, 在 涉 及 的 众 多 植 物 中, 葡 萄 籽 中 的 原 花 青 素 一 直 是 经 久 不 衰 的 研 究 课 题 2.2 花 青 素 的 功 效 : 花 青 素 功 效 主 要 有 预 防 癌 症, 增 进 视 力, 抗 氧 化 及 抗 紫 外 线, 清 除 体 内 有 害 的 自 由 基, 改 善 睡 眠, 加 固 血 管, 改 善 循 环 2.3 原 花 青 素 功 效 原 花 青 素 功 效 主 要 有 改 善 血 液 循 环 治 疗 糖 尿 病 性 视 网 膜 病 减 轻 水 肿 和 抑 制 静 脉 曲 张, 保 护 视 力, 滋 润 皮 肤, 缓 解 过 敏 发 炎, 分 解 胆 固 醇 2.4 花 青 素 发 展 现 状 及 市 场 需 求 已 开 发 的 花 青 素 葡 萄 皮 色 素 是 开 发 最 早 且 最 丰 富 的 花 青 素 类 色 素, 由 葡 萄 科 果 实 的 果 皮 或 葡 萄 酒 酒 厂 的 废 料 -- 葡 萄 渣, 以 水 或 乙 醇 萃 取, 后 经 精 制 真 空 浓 缩 而 得, 主 要 成 分 有 锦 葵 色 素 -3- 葡 糖 啶 丁 香 啶 二 甲 翠 雀 素 甲 基 花 青 素 翠 雀 素 等, 广 泛 用 在 饮 料 冷 饮 蛋 糕 果 酱 等 的 生 产 上, 用 量 0.002%~0.3% 玫 瑰 茄 色 素 ( 玫 瑰 茄 红 ), 由 锦 葵 科 木 槿 属 一 年 生 草 本 植 物 玫 瑰 茄 的 花 萼 提 取 精 制 而 来, 100g 干 花 萼 可 制 得 1.5g 总 花 色 苷, 主 要 成 分 有 飞 燕 草 素 -3- 接 骨 木 二 糖 苷 矢 车 菊 素 -3- 接 骨 木 二 糖 苷 和 少 量 的 飞 燕 草 素 -3- 葡 糖 苷 矢 车 菊 素 -3- 葡 糖 苷, 玫 瑰 茄 红 是 食 用 红 色 ( 至 紫 色 ) 色 素, 适 用 于 ph 值 在 4 以 下, 不 需 高 温 加 热 的 食 品, 如 糖 浆 冷 点 冰 糕 果 冻 等, 用 量 在 0.1%~0.5% 高 粱 红 色 素 是 取 自 紫 黑 色 或 红 棕 色 高 粱 种 子 的 外 果 皮, 主 要 成 分 是 芹 菜 素 和 槲 皮 黄 苷 高 粱 红 对 光 热 稳 定, 在 酸 性 和 碱 性 条 件 下 均 可 呈 红 棕 色, 染 色 力 强, 是 食 用 红 棕 色 色 素, 因 其 性 质 稳 定, 故 应 用 广 泛 另 外 国 际 上 已 开 发 应 用 的 花 青 素 类 色 素 花 生 衣 红 色 素 落 葵 红 黑 加 仑 红 天 然 苋 菜 红 紫 玉 米 色 素 桑 葚 红 色 素 红 米 红 ( 黑 米 红 ) 紫 苏 色 素 红 球 甘 蓝 色 素 蓝 锭 果 红 等 花 青 素 类 色 素 在 酸 性 环 境 中 呈 现 红 色, 色 泽 亮 丽, 并 且 对 光 热 氧 稳 定 性 好 ( 葡 萄 皮 色 素 除 外 ), 是 日 用 品 调 色 的 最 佳 天 然 色 素 之 一 而 国 内 除 红 球 甘 蓝 色 素 紫 苏 色 素 蓝 锭 果 红 紫 玉 米 色 素 未 得 到 批 准 之 外, 其 他 的 都 得 到 了 广 泛 的 应 用 未 来 有 潜 力 的 花 青 素 类 色 素 广 泛 存 在 于 葡 萄 血 橙 红 球 甘 蓝 蓝 莓 茄 子 皮 樱 桃 红 橙 红 莓 草 莓 桑 葚 山 楂 皮 紫 苏 紫 甘 薯 黑 ( 红 ) 米 牵 牛 花 等 植 物 的 组 织 中 20 世 纪 80 年 代, 日 本 就 从 红 球 甘 蓝 的 叶 子 中 提 取 分 离 出 4 种 花 青 素, 并 将 其 作 为 食 品 着 色 剂 ( 红 至 红 紫 色 ), 广 泛 用 于 糖 果 果 汁 汽 水 冰 淇 淋 话 梅 的 生 产 上 紫 苏 色 素 主 要 成 分 是 紫 苏 素 紫 苏 宁, 是 存 在 于 紫 苏 科 中 具 有 紫 色 叶 的 品 种 的 天 然 红 色 素, 日 本 在 1993 年 就 规 定 其 为 食 品 添 加 剂, 并 用 于 口 香 糖 果 汁 饮 料 等, 认 为 其 具 有 预 防 过 敏 防 龉 齿 消 炎 等 作 用 紫 苏 是 我 国 传 统 药 用 植 物, 是 我 国 卫 生 部 卫 防 字 (1987)57 号 文 公 布 的 第 二 部 分 33 个 药 食 两 用 的 品 种 之 一 近 年 来 从 紫 甘 薯 中 提 取 花 青 素 成 为 国 际 上 热 门 研 究 项 目, 因 为 紫 甘 薯 产 量 高,
容 易 栽 培, 是 经 济 地 获 取 花 青 素 的 理 想 途 经, 尤 其 是 高 花 青 素 紫 甘 薯 品 种 的 育 成, 为 规 模 化 生 产 花 青 素 提 供 了 优 质 原 料! 随 着 研 究 的 不 断 深 入, 通 过 人 工 酰 基 化 以 提 高 花 青 素 稳 定 性 的 工 作 也 取 得 很 大 进 展 另 外, 植 物 组 织 培 养 技 术 也 可 以 用 于 花 青 素 类 色 素 的 其 他 生 产 2.5 原 花 青 素 发 展 现 状 及 市 场 需 求 随 着 研 究 的 不 断 深 入 及 对 原 花 青 素 功 能 的 认 识 的 发 展, 原 花 青 素 在 营 养 保 健 化 妆 品 食 品 医 药 等 领 域 中 所 具 有 的 意 义 越 来 越 突 出 现 代 毒 理 试 验 的 研 究 也 表 明, 原 花 青 素 无 致 畸 致 突 变 作 用, 大 鼠 和 小 鼠 口 服 OPC S 的 LDs0 均 在 4000mg/Kg 以 上, 大 鼠 口 服 60mg /(Kg d)6 个 月 犬 口 服 相 同 剂 量 12 个 月 均 无 任 何 身 体 副 作 用 且 耐 受 性 良 好, 属 安 全 无 毒 级 ( 戚 向 阳 等,2003) 因 此 欧 美 日 等 国 以 葡 萄 籽 银 杏 等 植 物 资 源 为 原 料, 开 发 出 多 种 含 原 花 青 素 的 药 品 保 健 品 和 化 妆 品, 用 于 预 防 和 治 疗 眼 科 疾 病, 改 善 微 循 环, 消 炎 和 抗 辐 射 2.5.1 原 花 青 素 预 防 和 治 疗 心 血 管 疾 病 及 抗 衰 老 在 80 年 代 初 原 花 青 素 对 心 血 管 疾 病 的 治 疗 价 值 即 已 被 世 人 所 承 认 在 法 国 用 葡 萄 籽 原 花 青 素 制 成 的 专 利 产 品 用 于 治 疗 微 循 环 疾 病, 包 括 眼 睛 与 外 周 毛 细 血 管 通 透 性 疾 病 及 静 脉 与 淋 巴 功 能 不 全 法 国 Bormaure 等 发 明 以 原 花 青 素 低 聚 体 或 单 体 为 活 性 成 分 (0.1%) 的 治 疗 牙 周 病 的 制 剂 并 获 专 利 保 护 ; 法 国 Sanofi 公 司 用 葡 萄 籽 原 花 青 素 与 大 豆 卵 磷 脂 制 成 复 合 物, 用 作 血 管 保 护 剂 和 抗 炎 剂 ; 法 国 Vermat 等 还 制 成 含 80% 原 花 青 素 的 高 剂 量 片 此 外, 德 国 的 Berkhman 等 研 制 了 用 于 治 疗 酒 精 中 毒 的 原 花 青 素 制 剂 并 获 专 利 保 护 我 国 的 程 彦 杰 也 申 请 了 原 花 青 素 类 化 合 物 用 于 制 备 解 酒 保 肝 产 品 方 面 的 专 利 ( 专 利 号 : 02104039.7) 在 罗 马 尼 亚, 一 种 商 品 名 为 Endotelon 的 原 花 青 素 制 剂 已 上 市 用 于 治 疗 毛 细 管 疾 病 我 国 的 范 明 远 申 请 了 抗 衰 老 食 品 泡 腾 片 及 其 制 备 方 法 的 专 利, 其 中 的 活 性 成 分 包 括 甜 茶 原 花 青 素 绞 股 蓝 果 寡 糖 等, 具 有 防 病 健 体 养 生 益 寿 抗 过 敏 养 颜 生 发 及 促 进 肠 道 双 歧 杆 菌 活 化 和 增 殖 等 多 种 功 效, 长 期 饮 用 可 调 节 血 脂 调 节 血 压 抗 自 由 基 抗 肿 瘤 等 ( 专 利 号 :00107488.1) 有 的 则 直 接 制 成 原 花 青 素 茶 ( 专 利 号 :01106645.8) 或 与 抗 坏 血 酸 膳 食 纤 维 一 起 制 成 胶 囊 剂 ( 专 利 号 :02159540.2) 太 极 集 团 有 限 公 司 申 请 的 一 种 中 药 保 健 药 物 的 专 利 配 方 中 包 括 原 花 青 素 和 西 洋 参 或 人 参 ( 专 利 号 :02131251.6) 近 两 年 来, 以 OPC s 为 主 要 原 料 制 成 的 保 健 品, 如 美 国 的 葡 乐 安 英 国 的 碧 萝 芷, 已 打 入 国 内 市 场 2.5.2 原 花 青 素 在 化 妆 品 方 面 的 应 用 原 花 青 素 应 用 在 化 妆 品 方 面 进 展 很 快, 原 花 青 素 可 抑 制 参 与 形 成 雀 斑 的 黑 色 素 的 酰 氨 酸 酶 的 活 性, 能 抑 制 黑 色 素 和 紫 外 线 引 起 的 色 素 沉 着, 从 而 达 到 皮 肤 增 白 的 作 用 1990 年 法 国 Masquelier 专 门 对 已 上 市 ( 包 括 未 上 市 ) 的 原 花 青 素 制 剂 在 皮 肤 学 方 面 的 应 用 进 行 了 研 究 原 花 青 素 的 治 疗 作 用 与 其 清 除 自 由 基 的 能 力 密 切 相 关, 而 环 境 对 皮 肤 粘 膜 和 毛 发 的 刺 激 引 起 的 腊 质 蛋 白 质 与 核 酸 的 衰 退 过 程 均 与 自 由 基 分 不 开 法 国 已 开 发 出 用 Markush sta'ucture 原 花 青 素 低 聚 体 制 成 的 脂 质 体 微 胶 囊 的 晚 霜 发 乳 和 嗽 口 水 ; 为 了 使 活 性 成 分 便 于 通 过 皮 肤 角 质 层, 意 大 利 的 Indena 公 司 研 制 成 功 了 以 磷 脂 ( 天 然 磷 脂 或 合 成 磷 脂 ) 力 载 体 的 功 能 性 化 妆 品, 商 品 名 为 Phylosome 此 产 品 含 5% 银 杏 原 花 青 素 二 聚 体, 用 于 皮 肤 消 炎 和 改 善 微 循 环
并 有 较 好 防 护 紫 外 线 伤 害 作 用 (Bombardelli E,et al,1994); 日 本 Yaraaskosh 研 制 了 含 1% 原 花 青 索 低 聚 体 的 可 使 皮 肤 亮 洁 的 油 性 化 妆 品 ; 日 本 Afiga 等 还 开 发 了 用 作 化 妆 品 抗 氧 剂 的 原 花 青 素, 并 获 专 利 保 护 ( 国 植 和 徐 莉,1996) 2.5.3 原 花 青 素 在 食 品 方 面 的 应 用 由 于 原 花 青 素 的 保 健 功 能 与 其 临 床 实 验 的 安 全 性, 使 原 花 青 素 在 食 品 工 业 上 得 到 非 常 广 泛 的 应 用 例 如 : 2.5.3.1 用 于 维 生 素 类 可 防 止 维 生 素 B 族 中 某 些 维 生 素, 如 维 生 素 B2 的 光 氧 化 变 质 在 维 生 素 B2 溶 液 中 添 加 O.002% 的 原 花 青 素, 在 荧 光 灯 照 射 下, 防 止 光 氧 化 分 解 的 效 果 十 分 显 著 2.5.3.2 用 于 色 素 类 可 防 止 β 胡 萝 卜 素 等 的 变 质 β 胡 萝 卜 素 在 光 照 射 下 易 氧 化 分 解 褪 色 在 0.005%β 胡 萝 卜 素 水 溶 液 中, 添 加 葡 萄 籽 提 取 物, 经 过 光 照 射 后, 测 定 β 胡 萝 卜 素 的 残 留 量 结 果 表 明, 原 花 青 素 防 止 β 胡 萝 卜 素 光 氧 化 分 解 效 果 显 著 3. 花 青 素 制 备 方 法 3.1 制 备 色 素 粗 提 液 植 物 果 实 粉 碎 离 心 酸 化 乙 醇 提 取 3.2 花 青 素 精 制 3.2.1 树 脂 法 : 将 色 素 粗 提 取 液 经 大 孔 树 脂 (AB 8 树 脂 使 用 较 多 ) 静 态 吸 附, 使 用 50% 60% 乙 醇 洗 脱, 再 浓 缩 得 到 精 制 花 青 素 3.2.2 超 滤 法 : 用 柠 檬 酸 的 粗 提 液, 经 树 脂 纯 化, 乙 醇 洗 脱 后, 将 色 素 液 用 超 滤 膜 处 理 除 去 蛋 白 质 淀 粉 等 杂 质 胶 体 物 质, 最 后 再 用 反 渗 透 膜 浓 缩 得 到 色 素 纯 品 3.2.3 醋 酸 铅 沉 淀 法 : 粗 提 取 液 用 少 量 水 溶 解 后, 加 5% 醋 酸 铅 搅 拌 使 色 素 物 质 沉 淀, 将 沉 淀 物 用 盐 酸 化 食 用 酒 精 溶 解 后, 过 滤 除 去 白 色 氯 化 铅 沉 淀, 将 红 色 溶 液 蒸 馏 后 干 燥, 得 精 制 产 品 3.2.4 分 级 醇 沉 法 : 在 提 取 和 纯 化 等 加 工 过 程 中 往 往 会 发 生 天 然 色 素 的 大 量 损 失, 发 达 国 家 多 采 用 真 空 冷 冻 干 燥 法 来 减 少 色 素 损 失 但 对 设 备 的 要 求 高, 同 时 费 用 昂 贵 4. 原 花 青 素 制 备 方 法 无 论 是 原 花 青 素 的 医 疗 价 值 的 发 挥, 还 是 它 在 其 它 领 域 上 的 应 用, 以 及 原 花 青 素 功 能 及 结 构 的 进 一 步 研 究, 都 是 建 立 在 一 个 必 不 可 少 的 步 骤 上, 那 就 是 人 们 早 已 开 始 探 索 的 课 题 一 提 取 与 分 离 随 着 人 们 对 原 花 青 素 功 能 认 识 的 深 入, 对 建 立 更 简 捷 高 效 的 提 纯 方 法 的 需 求 越 来 越 强 烈 葡 萄 籽 提 取 物 原 花 青 素 是 一 种 有 涩 味 的 白 色 粉 末, 溶 于 水 乙 醇 甲 醇 丙 酮, 也 可 溶 于 乙 酸 乙 酯, 不 溶 于 乙 醚 氯 仿 苯 等 根 据 其 在 不 同 有 机 溶 剂 中 的 溶 解 性 能, 常 采 用 溶 剂 萃 取 法 提 取 和 分 离 原 花 青 素 此 外, 超 临 界 萃 取 薄 层 层 析 法 及 柱 层 析 技 术 也 是 常 用 的 方 法 国 外 几 种 分 离 纯 化 原 花 青 索 的 主 要 方 法 是 用 硅 胶 薄 层 层 析 法 Sephadex G 一 25 柱 层 析 BSA-SepharoseCL.4B Sephadex LH-20 Fractogel TSK50(f) 柱 层 析 等, 这 些 方 法 或 过 于 精 细 繁 琐 消 耗 时 间 或 因 要 用 到 精 密 贵 重 的 仪 器 与 试 剂 而 无 法 在 实 际 中 广 泛 使 用, 尤 其 是 在 国 内 一 般 实 验 与 设 备 条 件 下 的 使 用 性 很 有 限 4.1. 溶 剂 萃 职 法 目 前 普 遍 采 用 的 工 艺 是 脱 脂 后 的 溶 剂 提 取 工 艺, 只 是 脱 脂 的 方 法 不 同 对 原 花 青 素 提 取 率 和 质 量 会 产 生 一 定 的 影 响 脱 脂 的 方 法 有 压 榨 法 溶 剂 法 超 临 界 C02 萃 取 法 其 中 超 临
界 C02 萃 取 法 最 佳, 此 法 无 化 学 溶 剂 残 留, 无 污 染, 可 避 免 萃 取 物 在 高 温 下 的 热 劣 化, 保 护 生 理 活 性 物 质 的 活 性, 不 仅 油 脂 提 取 率 高, 而 且 对 原 花 青 素 的 破 坏 作 用 最 小, 原 花 青 素 质 量 较 好 4.1.1 粗 提 原 花 青 素 的 提 取 纯 化 方 法 国 内 有 溶 剂 提 取 及 分 级 精 制 活 性 炭 吸 附 法, 另 外 还 有 醋 酸 铅 沉 淀 法 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVP) 吸 附 法 等 精 制 方 法 以 溶 剂 法 提 取 的 主 要 工 艺 流 程 为 : 葡 萄 籽 干 燥 粉 碎 葡 萄 籽 油 提 取 ( 压 榨 法 溶 剂 法 SCpc02 法 等 ) 葡 萄 籽 粕 有 机 溶 剂 提 取 提 取 液 蒸 发 脱 溶 干 燥 原 花 青 素 粗 提 物 4.1.2 精 制 4.2 超 临 界 提 取 葡 萄 籽 油 及 原 花 青 素 我 国 有 一 些 用 超 临 界 萃 取 技 术 提 取 葡 萄 籽 油 和 原 花 青 素 的 专 利 如 孙 传 经 采 用 两 步 法 提 取 葡 萄 籽 油 和 原 花 青 素 低 聚 体, 第 一 步 提 取 葡 萄 籽 油, 控 制 萃 取 釜 压 力 为 25~29MPa, 温 度 为 60 ; 第 二 步 是 提 取 剂 C02 加 入 以 丙 酮 比 水 为 70:30 的 改 性 剂,C02 与 改 性 剂 量 比 为 4: 1 提 取 出 青 花 素 两 种 产 品 的 收 率 都 达 到 15% 和 14% 用 同 样 的 方 法, 他 还 提 取 了 银 杏 叶 中 原 花 青 素 和 黑 加 仑 籽 中 的 油 及 原 花 青 素 低 聚 体 ( 专 利 号 :99111574.0;99100588.O: 00103577.O) 4.3 大 孔 吸 附 树 脂 分 离 纯 化 原 花 青 素 目 前 的 研 究 研 究 成 果 已 经 使 大 孔 吸 附 树 脂 广 泛 应 用 于 制 药 及 天 然 植 物 中 活 性 成 分 如 皂 甙 黄 酮 内 脂 生 物 碱 等 大 分 子 化 合 物 的 提 取 分 离, 但 用 该 技 术 吸 附 分 离 原 花 青 素 的 报 道 并 不 多, 如 张 竣 等 人 用 吸 附 层 析 法 制 备 低 聚 原 花 青 素, 以 AB.8 大 孔 吸 附 树 脂 对 葡 萄 籽 原 花 青 素 粗 提 物 进 行 了 分 级 分 离, 所 得 乙 酸 乙 酯 洗 脱 产 物 总 酚 含 量 为 91%, 经 高 效 液 相 色 谱 检 测, 酚 类 物 质 中 单 体 约 为 28%, 低 聚 原 花 青 素 占 64%, 多 聚 体 仅 为 8%( 张 竣, 2002) 其 它 类 似 的 报 道 有 : 李 兆 龙 等 人 用 日 本 产 的 非 极 性 大 孔 吸 附 树 脂 ( 如 Diaion HP.10, HP 20,FIP 一 21) 等 分 离 银 杏 叶 黄 酮, 将 银 杏 叶 粗 粉 经 50% 70% 乙 醇 提 取, 提 取 液 浓 缩 放 冷, 析 出 不 需 要 的 成 分, 滤 液 用 大 孔 吸 附 树 脂 分 离, 用 水 洗 柱, 再 用 60%,70% 醇 水 溶 液 解 吸 被 吸 附 的 提 取 物, 所 得 提 取 物 用 高 效 液 相 色 谱 分 析, 得 黄 酮 类 成 分 大 于 20%, 银 杏 内
酯 含 量 在 5% 以 上 的 产 品 如 果 在 水 洗 柱 之 后, 用 低 浓 度 的 乙 醇 洗 柱 ( 如 5% 乙 醇 水 溶 液 ) 再 用 60%~70% 乙 醇 水 溶 液 解 吸 提 取 物, 黄 酮 苷 含 量 可 达 24% 以 上 国 产 D101 树 脂 也 可 以 用 于 分 离 银 杏 叶 黄 酮,D101 树 脂 对 银 杏 黄 酮 的 吸 附 量 约 为 29/mL, 产 品 含 总 黄 酮 约 为 38% 卢 锦 花 等 人 则 选 用 了 DM 一 130 为 理 想 的 吸 附 树 脂 纯 化 银 杏 叶 黄 酮 ( 卢 锦 花,2002) 吴 红 等 人 用 大 孔 吸 附 树 脂 (HPD300) 法 分 离 纯 化 了 山 茱 萸 总 皂 甙, 获 得 了 较 理 想 的 结 果 ( 吴 红,2003) 4.4 聚 酰 胺 分 离 纯 化 原 花 青 素 聚 酰 胺 是 由 酰 胺 聚 合 而 成 的 一 类 高 分 子 化 合 物 商 品 名 又 称 为 绵 纶 尼 龙 色 谱 分 离 常 用 聚 己 内 酰 胺 ( 绵 纶 6) 和 聚 己 二 酰 己 二 胺 ( 绵 纶 66) 一 般 认 为, 聚 酰 胺 分 子 内 存 在 的 许 多 酰 胺 基 能 与 酚 类 的 羟 基 酸 类 的 羧 基 及 醌 类 的 醌 基 形 成 氢 键 而 产 生 吸 附, 因 此 聚 酰 胺 色 谱 也 是 一 种 吸 附 色 谱 由 于 原 花 青 素 的 分 子 中 含 有 多 个 羟 基, 故 易 于 与 聚 酰 胺 形 成 氢 键 而 被 吸 附 解 析 过 程 则 利 用 聚 酰 胺 形 成 氢 键 的 能 力 在 有 机 溶 剂 中 较 弱 的 原 理 若 应 用 各 种 溶 剂 在 聚 酰 胺 柱 色 谱 中 作 为 洗 脱 剂, 则 洗 脱 能 力 的 顺 序 如 下 : 水 < 甲 醇 或 乙 醇 < 丙 酮 < 稀 氢 氧 化 钠 液 或 稀 氨 溶 液 < 甲 酰 胺 或 二 甲 基 甲 酰 胺 < 尿 素 水 溶 液 聚 酰 胺 吸 附 原 花 青 素 后, 通 常 采 用 乙 醇 洗 脱 甲 醇 的 洗 脱 效 果 虽 然 也 很 好, 但 考 虑 到 安 全 性 的 缘 故, 因 此 常 选 用 乙 醇 洗 脱 乙 醇 浓 度 由 40%95% 的 范 围 内, 洗 脱 的 效 果 可 随 之 加 强 利 用 聚 酰 胺 分 离 纯 化 原 花 青 素 通 常 采 用 柱 色 谱 进 行 分 离, 在 一 些 国 家, 这 种 分 离 方 法 已 达 到 了 工 业 化 规 模 生 产 的 程 度 4.4 葡 聚 糖 凝 胶 Sephadex LH 20 纯 化 原 花 青 素 分 离 纯 化 原 花 青 素 常 用 葡 聚 糖 凝 胶 LH 20, 又 称 为 交 联 葡 聚 糖, 是 由 Sephadex G 25 和 G 50 中 分 别 加 入 羟 丙 基 基 团 反 应, 形 成 LH 型 烷 基 化 葡 聚 糖 凝 胶, 适 用 于 以 有 机 溶 剂 为 流 动 相, 分 离 脂 溶 性 物 质, 例 如 胆 固 醇 脂 肪 酸 激 素 等 由 于 葡 聚 糖 凝 胶 LH 20 分 子 中 引 入 了 亲 脂 性 基 团, 除 了 能 在 水 中 溶 胀 外, 能 在 许 多 有 机 溶 剂 如 醇 甲 酰 胺 丙 酮 氯 仿 等 溶 剂 中 溶 胀 ( 在 醋 酸 乙 酯 甲 苯 中 溶 胀 不 多 ), 并 在 ph>2 的 无 氧 化 剂 溶 液 中 呈 稳 定 状 态 常 用 于 分 离 一 些 难 溶 于 水 或 具 一 定 程 度 亲 脂 性 的 化 合 物 ( 如 黄 酮 蒽 醌 香 豆 素 等 ) 对 于 固 定 相 为 葡 聚 糖 凝 胶 LH 20 的 凝 胶 色 谱, 洗 脱 剂 可 选 用 各 种 有 机 溶 剂, 这 是 它 与 其 它 葡 聚 糖 凝 胶 的 显 著 不 同 之 处 适 当 控 制 洗 脱 的 速 度, 若 固 定 相 颗 粒 细 或 交 联 度 大, 则 流 速 可 稍 快 洗 脱 液 分 部 收 集, 每 一 流 份 经 检 测 后, 合 并 相 同 组 份 在 一 些 外 文 文 献 中, 该 纯 化 方 法 主 要 用 于 精 密 仪 器 分 析 ( 如 高 效 液 相 色 谱 高 效 液 相 色 谱. 质 谱 联 检, 或 气 相 色 谱. 质 谱 检 测 ) 前 的 试 样 处 理 (DePascual Teresa Sonia'1999), 也 有 的 用 于 测 定 原 花 青 素 片 段 的 平 均 分 子 量 (Atdo Yanagida,1999) 4.5 薄 层 色 谱 定 性 分 析 提 取 的 原 花 青 素 或 纯 化 片 段 的 组 成 薄 层 色 谱 是 一 种 微 量 快 速 简 单 高 效 灵 敏 的 色 谱 分 离 方 法, 其 中 以 吸 附 薄 层 色 谱 应 用 最 广 原 花 青 素 的 薄 层 色 谱 分 离 常 采 用 硅 胶 G 丘 54( 吕 丽 爽,2000, 2001) 根 据 被 分 离 物 质 的 溶 解 性 酸 碱 性 极 性 等 性 质, 选 择 合 适 的 吸 附 剂 和 展 开 剂 是 薄 层 色 谱 分 离 的 关 键, 吕 丽 爽 选 用 了 甲 苯 : 丙 酮 : 乙 酸 =3:3:1 作 为 展 开 剂 4.6 其 它 可 能 用 于 提 取 和 纯 化 原 花 青 素 的 方 法 4.6.1 超 声 提 取 原 花 青 素 4.6.2 膜 分 离 技 术 提 取 原 花 青 素 4.7 原 花 青 素 分 析 方 法 4.7.1 Nucleosil 120 Cls 柱, 柱 温 30, 二 极 管 序 列 检 测 器, 流 动 相 A:4.5% 乙 酸 或 甲 酸,B: 乙 腈 流 速 1mL/min, 在 40min 之 内 A 由 占 流 动 相 的 90% 下 降 至 65%(MarioAlia,2003; VesselaAtanasova,2002) 4.7.2 Sphersorb ODS 一 2 柱, 柱 温 30,280nm 处 紫 外 检 测, 流 动 相 A:2.5% 乙 酸,B: 乙
氰 -A(80:20) 流 速 1 ml/min, 在 40min 之 内 A 由 占 流 动 相 的 95% 下 降 至 40%(Veronique Cheynier,2001:Ruth Murga,2000) 质 谱 条 件 为 : 电 子 轰 击 质 谱, 氮 气 流 速 10mL/min 离 子 化 压 力 276KPa, 温 度 623K, 毛 细 管 电 压 4000V(Ruth Murga,2000) 4.7.3 RP.C1s 柱, 二 极 管 序 列 检 测 器, 流 动 相 A:0.2% 乙 酸,B: 乙 氰 流 速 0 8mLlmin, 在 40min 之 内 A 由 占 流 动 相 的 90% 下 降 至 65%(MarioAIia,2003;Vessela Atanasova,2002) 质 谱 源 电 压 4KV, 毛 细 管 电 压 5KV, 温 度 280,m/z 的 测 量 范 围 为 240~1000 4.7.4 Luna 硅 胶 柱 分 离, 柱 温 37, 荧 光 检 测 器 ( 激 发 波 长 和 发 射 波 长 分 别 为 276nm 和 316rim), 流 动 相 A: 二 氯 甲 烷 ;B: 甲 醇 ;C: 乙 酸. 水 (1:l,v/v) 其 流 动 相 梯 度 见 下 表 从 HPLC 仪 器 中 流 出 的 洗 脱 液 进 入 到 质 谱 系 统 中, 氮 气 压 力 50Psi, 流 速 10mL/min 温 度 350, 毛 细 管 电 压 3.5KPa,m/z 范 围 150~2200 (LiweiGu,2003;Sheryl A.Lazarus, 1999) 4.7.5 将 原 花 青 素 分 离 提 纯 后 的 片 段 用 苯 甲 硫 醇 或 间 苯 三 酚 处 理 后 用 反 相 HPLC 分 析, Lichrospher C18 柱, 流 动 相 A:pH1.5 的 150raM 磷 酸,B: 甲 醇 洗 脱 流 速 :1mL/min 在 40min 内 A 由 80% 降 至 10%(James AKennedy,2000) 4.7.6 分 离 纯 化 的 样 品 在 Luna 硅 胶 柱 上 进 HPLC 分 析 流 动 相 A: 二 氯 甲 烷,B: 甲 醇,c: 乙 酸 : 水 =l:1(v/v), 流 量 1mL/min 4.7.7 将 样 品 浓 度 为 150~250μg/mL 的 原 花 青 素 用 反 相 HPLC 分 析, 柱 温 35 流 动 相 A: 0.1% 磷 酸 溶 液,B: 乙 腈 :A=1000:1 采 用 荧 光 检 测 器 ( 激 发 波 长 和 发 射 波 长 分 别 为 283nm 和 317nm) 和 二 极 管 序 列 检 测 器 (210nm) 检 测 该 方 法 中, 由 于 磷 酸 在 210rim 有 吸 收 峰, 因 此 该 系 统 需 用 磷 酸 作 基 线 的 校 正 (Ruth Murga,2000) 4.7.8 条 件 : 液 相 色 谱 分 离 柱 ZorbaxXDB(5μm,4.6mm 250mm); 流 动 相 为 甲 醇 - 水 (v/v20:80); 流 速 1mL/min; 进 样 量 20μL 质 谱 扫 描 方 式 为 负 离 子 扫 描, 电 喷 雾 电 离 源 保 留 时 间 8.03min 和 9.58min 峰 的 主 要 质 谱 信 息 为 m/z577, 为 [M-H]-, 其 相 对 分 子 量 为 578; 保 留 时 间 12.21min 和 21.18min 峰 的 主 要 质 谱 信 息 为 m/z289 m/z579, 应 为 [M-H]- [2M-H]-, 其 相 对 分 子 量 为 290; 保 留 时 间 13.83min 峰 的 主 要 质 谱 信 息 为 m/z729, 应 为 [M-H]-, 其 相 对 分 子 量 为 730; 保 留 时 间 15.45min 峰 的 主 要 质 谱 信 息 为 m/z865, 应 为 [M-H]-, 其 相 对 分 子 量 为 866 对 照 原 青 花 素 结 构, 可 以 推 测 提 取 物 的 主 要 组 分 有 6 种 为 原 花 青 素 成 分, 分 别 为 两 种 单 体 (M=290) 两 种 二 聚 体 (M=578) 一 种 三 聚 体 (M=866) 和 一 种 二 聚 单 酯 (M=730)