脊 尾 白 虾 精 子 体 外 保 存 的 研 究 1, 2, 2, 2, 1, 2 (1., 210095; 2., 222005) 摘 要 : 采 用 精 子 存 活 率 和 顶 体 酶 活 力 两 种 评 价 精 子 质 量 方 法, 研 究 了 不 同 稀 释 剂 与 抗 冻 保 护 剂 对 脊 尾 白 虾 (Exopalaemon carinicauda) 精 子 体 外 保 存 效 果 的 影 响 结 果 表 明 : 稀 释 剂 Ⅰ- 壬 氏 液 为 脊 尾 白 虾 精 子 体 外 保 存 的 最 佳 稀 释 剂, 4 下 保 存 4 d 后, 稀 释 剂 Ⅰ 组 精 子 存 活 率 为 71.50 %, 顶 体 酶 活 力 为 1.803 μ IU/10 6, 两 种 指 标 值 均 高 于 其 他 实 验 组, 各 组 精 子 存 活 率 与 顶 体 酶 活 力 之 间 相 关 性 显 著 γ=0.846(p<0.05); 在 液 氮 -196 下 保 存 2 d 后, 稀 释 剂 Ⅰ 组 精 子 存 活 率 达 83.50 %, 顶 体 酶 活 力 为 2.507 μiu/10 6, 两 种 指 标 值 均 高 于 其 他 各 组 以 及 4 下 稀 释 剂 Ⅰ 组 同 期 保 存 效 果, 各 组 精 子 存 活 率 与 顶 体 酶 活 力 之 间 相 关 性 极 显 著, γ=0.862 (P<0.01) 15%DMSO 为 脊 尾 白 虾 精 子 超 低 温 保 存 的 最 佳 抗 冻 保 护 剂, 此 条 件 下 超 低 温 保 存 2 d 后, 精 子 存 活 率 为 81.32%, 顶 体 酶 活 力 为 1.385μIU/10 6, 各 组 精 子 存 活 率 与 顶 体 酶 活 力 之 间 相 关 性 极 显 著, 相 关 系 数 γ=0.864(p<0.01) 关 键 词 : 脊 尾 白 虾 (Exopalaemon carinicauda); 精 子 ; 体 外 保 存 ; 稀 释 剂 ; 抗 冻 剂 中 图 分 类 号 : Q959.223 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 1000-3096(2013)03-0095-07 (Exopalaemon carinicauda), (Crustacea), (Malacostraca), (Eumalacostraca), (Decapoda), (Palaemonidae),, 3,,,,,, (Fenneropenaeus chinensis)(penaeus japonicus),, [1] [2-3] [3] [4-6] [5-6] [7],,,,,,,, 1 材 料 与 方 法 1.1 脊 尾 白 虾 来 源 及 精 子 的 采 集 2011 10,, (5.90 0.57)cm, (2.76 0.78)g,, (: NaCl 21.63 g, NaOH 0.19 g, KCl 1.12 g, MgSO 4 7H 2 O 4.93 g, H 3 BO 3 0.53 g, 1 000 ml),, 200, 1 000 r/min 5 min,, 4 1.2 主 要 试 剂 Ficoll : 0.12 mol/l NaCl, 0.025 mol N-2 -N-2- (Hepes) 11 400 (Ficoll), ph 7.5 0.1% Ficoll : 0.055 mol/l NaCl, 0.055 mol/l : 2012-01-06; : 2012-12-20 : (2011BAD13B03) : (1987-),,,,, E-mail: puyunhui@yahoo.com.cn;,, E-mail: yanbinlun@yahoo.com.cn Marine Sciences / Vol. 37, No. 3 / 2013 95
Hepes 0.01 Triton X-100, ph 8.0, 0.1% 500 mmol 2 : 23 mmol/l Nα- -DL- -P- (BAPNA), (DMSO), : BAPNA/DMSO 9: 1 : 1 表 1 稀 释 剂 成 分 Tab. 1 The composition of diluting solutions ( 1 000 ml) : [8] NaCl 7.8 g, KCl 0.2 g, CaCl 2 0.21g, NaHCO 3 0.021 g : Kurokura extender [9] NaCl 7.5 g, KCl 0.2 g, CaCl 2 0.16 g, NaHCO 3 0.02 g : D-20 [10] NaCl 8.0 g, KCl 1.0 g, 15 g [11] [12] [13] [14] NaCl 21.63 g, NaOH 0.19g, KCl 1.12 g, MgSO4 7H 2 O 4.93 g, H 3 BO 3 0.53 g NaCl 25.0 g, Na 2 SO 4 3.9 g, KCl 0.37 g, MgCl2 6H 2 O 10.7g, NaHCO 3 0.23 g NaCl 25.0, KCl 0.6 g, CaCl 2 0.25 g, MgCl2 0.35 g, NaHCO 3 0.2 g NaCl 8.7 g, KCl 7.2 g, CaCl 2 0.23 g, MgCl2 0.1 g, NaHCO 3 1.0 g, NaH 2 PO 4 0.3 g, 1g 1.3 方 法 1.3.1 1.1, 7 10 6 /ml, 4, 0 1 2 3 4 d 1.3.2 1.3.1, 10%DMSO,,, 0 1 2 d 1.3.3, DMSO, 10 : ~ (V/ V) 5% 10% 15% 20%; ~ (Dimethyl sulfoxide, DMSO) (V / V) 5% 10% 15% 20%; DMSO 10%; DMSO 20%, 4 30 min, :, 40, 1.3.4 1,, 2% B () 3~4 min,,, 200, 4, 50, 1.3.5 Kennedy [15], (1) 1.5 ml, 250 L; (2), 0.5 m L Ficoll 1.5 ml, Ficoll ; (3), 3 400 r/min 30 min; (4) Ficoll, 100 L Ficoll ; (5) 100 L, ; (6)( ) 1 ml, ; (7) 25 3 h, ; (8) 3 h, 100 μl ( ); (9) 3 400 r/min 30 min, ; (10) 410 nm ; (11) :, 25 1 mol Nα- -DL- -P- (Nα-Benzoyl- DL-arginine-P-nitroanilide hydrochloride, BAPNA) /min : IU /10 6 = 平 均 ( OD实 验 - OD 对 照 ) 10 6 {1485 精 子 数 (10 )} 6 96 / 2013 / 37 / 3
1.4 数 据 处 理 3,, SPSS16.0, (One-way ANOVA), LSD(Least Significant Difference) Duncan 2 结 果 2.1 不 同 稀 释 剂 对 精 子 低 温 保 存 的 影 响 4 d, 2 93.18%,, 4 30 min,, 85%,, 89.63%,, 76.86%, 1 2 d,,,, 4 d, 71.50%,,,, 41.71% 表 2 不 同 稀 释 剂 对 低 温 保 存 的 脊 尾 白 虾 精 子 存 活 率 的 影 响 Tab. 2 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under hypothermic preservation with different diluting solutions (%) 93.18±0.46 93.18±0.46 93.18±0.46 93.18±0.46 93.18±0.46 93.18±0.46 93.18±0.46 4 30 min (%) 89.63 0.62 e 82.11 1.12 b 87.74 0.70 cd 87.16 0.69 c 88.95 0.40 de 88.42 0.69 cde 76.86 1.63 a 1 d (%) 82.85 0.18 f 67.77 0.86 b 68.76 0.42 b 71.61 0.88 c 78.66 0.60 e 76.83 0.39 d 65.83 0.49 a 2 d (%) 80.53 1.17 e 63.98 0.84 a 64.77 0.80 a 67.29 1.06 b 77.54 1.23 d 75.31 0.57 c 62.95 1.15 a 3 d (%) 73.69 0.60 f 56.61 0.73 b 61.60 0.68 c 63.78 1.00 d 66.79 1.03 e 64.08 0.11 d 53.01 0.80 a 4 d (%) 71.50 0.57 f 53.70 1.00 b 55.88 0.69 c 56.39 1.16 c 61.44 0.93 e 59.05 1.03 d 51.47 0.69 a (%) 21.68 39.48 37.3 36.79 31.74 34.13 41.71 : (One-way ANOVA) Duncan, (P<0.05), 3 4 1,, 4 30 min, Ⅰ 1 Fig.1 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under hypothermic preservation with different diluting solutions, Ⅴ Ⅵ, Ⅶ 4 d, Ⅰ, 1.803 μiu/10 6, 2 1,,,, Ⅴ, Ⅶ4 d,, γ=0.846 (P<0.05) 2.2 稀 释 剂 对 精 子 超 低 温 保 存 的 影 响 3 92.54%,, 4,, 85%,, 90.23%,, 86.53%, 1 d, 2 d, Marine Sciences / Vol. 37, No. 3 / 2013 97
, 83.50%,, 55.66%,,,, 18.63% 4 表 3 不 同 稀 释 剂 对 超 低 温 保 存 的 脊 尾 白 虾 精 子 存 活 率 的 影 响 Tab. 3 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different diluting solutions (%) 92.54 0.53 92.54 0.54 92.54 0.55 92.54 0.56 92.54 0.57 92.54 0.58 92.54 0.59 92.54 0.60 (%) 83.23 4.38 a 90.23 1.39 b 87.37 1.49 ab 87.61 2.76 ab 88.09 1.93 b 89.16 2.60 b 88.44 1.46 b 86.53 1.35 ab 1 d (%) 73.45 2.92 a 87.52 1.62 c 86.52 1.84 c 85.07 1.55 c 85.37 4.48 c 83.05.4.86 bc 81.89 1.87 bc 79.40 2.65 b 2 d (%) 55.66 3.20 a 83.50 1.08 c 75.68 4.54 b 76.74 2.51 b 76.90 1.72 b 77.13 2.98 b 77.71 0.93 b 73.91 1.69 b (%) 36.88 9.04 16.86 15.80 15.64 15.41 14.83 18.63 2,, 4 30 min, Ⅰ, 3.760μIU/10 6, Ⅴ Ⅵ, Ⅶ 2 d, Ⅰ, 2.507μIU/10 6,, 0.919μIU/10 6 2 Fig. 2 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different dilution solutions 3 2,,, Ⅶ, 4, γ=0.862 (P<0.01) 2.3 抗 冻 剂 对 精 子 超 低 温 保 存 的 影 响 4 92.36%,, 1 d,,, 85.11%, 2 d,,, 81.32%,, 42.84% 4,,, 20%, DMSO 5% 15%,, 15%, 20% 10% 10%DMSO 3 30 min,,, 1 d,,,, 2 d 1 d, 1.385 IU/10 6 4 3,, DMSO,,,, γ=0.864(p<0.01) 98 / 2013 / 37 / 3
表 4 不 同 抗 冻 剂 对 低 温 保 存 的 脊 尾 白 虾 精 子 存 活 率 的 影 响 Tab. 4 Survival rate of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different cryoprotectants (%) (%) 83.14 0.87 a 86.63 0.85 a 86.29 1.17 bc 89.51 0.67 d 85.78 2.05 b 86.59±0. 30 bc 87.93±0. 68 cd 89.78±0. 78 d 87.49 1.59 bc 86.55 1.01 bc 83.49 0.43 a 1d (%) 54.10 0.44 a 59.97 1.71 b 78.01 1.41 d 78.29 1.57 d 74.71 1.63 c 80.56 0.82 de 81.18 2.93 e 85.11 0.78 f 77.81 1.22 d 80.23 1.03 de 62.23 1.39 b 2d (%) 42.84 0.63 a 56.40 1.22 b 73.84 0.61 d 74.59 0.90 d 71.08 1.19 c 76.45 1.45 de 77.81 0.66 e 81.32 2.01 f 71.42 0.79 d 76.33 0.52 de 57.97 2.18 b (%) 49.52 35.96 18.52 17.77 21.28 15.91 14.55 11.04 20.94 16.03 34.39 3 Fig. 3 Acrosin activities of spermatozoa of Exopalaemon carinicauda under cryopreservation with different cryoprotectants 3 讨 论 3.1 精 子 保 存 质 量 的 评 价 方 法 [16],, [17-19],, 2% B,,,,,,,,, 3.2 稀 释 剂 对 精 子 保 存 效 果 的 影 响 [17,19-21], 7, ph Na + K + Ca 2+ Mg 2+, K + Na + [22] K + Ca 2+ K + Na +, Ca 2+ [23-24] [25] 7 (),, 3 NaCl KCl NaHCO 3 3,,, K +,,,,, [23-24] D-20() Marine Sciences / Vol. 37, No. 3 / 2013 99
,,,,, D-20() 3.3 抗 冻 保 护 剂 对 精 子 保 存 效 果 的 影 响 Chow [26] 10%, [27] 6%DMSO [20] 10%DMSO 5%~10%, 60%,, 59%, DMSO DMSO,,, ;, [28] DMSO, DMSO, DMSO DMSO (0~60 ) [29] [30] DMSO DMSO, 35, DMSO,,,, 40, DMSO,, 15%DMSO, 20%,,,, : [1],,,. [J]., 2010, 34 (10): 53-56. [2],,,. [J]., 2004, 25(2): 39-40. [3]. Exopalaemon carinicauda(holthuis) [J]., 2005, 20(5): 23-26. [4],,,. [J]., 2008, 28(4): 34-37. [5],,. [J]., 2010, 38(7): 3512-3515, 3544. [6],,. [J]., 2006, 27(3): 17-19. [7],,,. [J]., 2008, 25(5): 1-3. [8] Chen S L, Ji X S, Yu G C, et al. Cryopreservation of spermatozoa from turbot ( Scophthalmus maximus ) and application to large-scale fertilization[j]. Aquaculture, 2004, 236: 547-556. [9] Routray P, Choudhary A K, Dash S N, et al. Cryopreservation of dead fish spermatozoa several hours after death of Indian major carp, Labeo rohita and its successful utilization in fish production[j]. Aquaculture, 2006, 261: 1204-1211. [10] Maria A N, Viveiros A T M, Freitas R T F, et al. Extenders and cryoprotectants for cooling and freezing of piracanjuba (Bryconor bignyamus)semen,an endangered Brazilian teleost fish[j]. Aquaculture, 2006, 260: 298-306. [11] Leung T J R, Lawrence A L. Observation on the decline in sperm quality of Penaeus setiferus under laboratory conditions[j]. Aquaculture, 1987, 65 : 363-370. [12] Tereza G C V, Halccrow K. Influence of some external factors on the acrosome reation in the spermatozoa of Homarus americanus Milne Edwards 1837[J]. Journal of Crustacean Biology, 1988, 8(3): 317-321. [13] Chao N H. Cryopreservation of finfish and shellfish sperms[j]. Taiwan Fisheries Research, 1996, 4(2): 157-170. [14]. [J]., 1999, 19(4) : 7-10. [15] Kennedy W P, Kaminski J M, Van der Ven H H, et al. A simple, clinical assay to evaluate the acrosine activity of human spermatozoa[j]. Journal of Andrology, 1989, 10: 221-231. [16],. [J]., 1997, 21(1): 59-63. [17] Anchordoguy T J, Crogwe J H, Griffin F J, et al. Cryopreservation of sperm from the marine shrimp Sicyonia ingentis[j]. Cryobiology, 1988, 25: 238-243. [18] Wang Q Y, Misamore M, Jiang C Q, et al. Egg water induced reaction and biostain assay of spermfrom marine shrimp Penaeus vannamer :dietary effects on sperm quality[j]. Journal of the World Aquaculture Society, 1995, 26: 261-271. [19] Bhavanishankar S, Subramoniam T. Cryopreservation of spermatozoa of the edible mud crab Scylla serrata (Forskal)[J]. Journal of Experimental Zoology, 1997, 277: 326-336. 100 / 2013 / 37 / 3
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