分 析 检 测 食 品 科 学 21, Vol. 31, No. 2 271 近 年 来, 瘦 肉 精 克 伦 特 罗 常 被 发 现 非 法 添 加 在 动 物 饲 料 中 以 增 加 饲 料 报 酬 率, 导 致 严 重 的 瘦 肉 精 中 [1-3] 毒 事 件 时 有 发 生, 政 府 监

27 21, Vol. 31, No. 2 食 品 科 学 分 析 检 测 ELISA 王 保 玲 1,2, 袁 利 鹏 2, 雷 红 涛 2, *, 徐 振 林 2, 杨 金 易 2, 孙 远 明 2, 丁 武 1, 庞 杰 3 (1. 西 北 农 林 科 技 大 学 食 品 科 学 与 工 程 学 院, 陕 西 杨 凌 7121;2. 广 东 省 食 品 质 量 安 全 重 点 实 验 室, 华 南 农 业 大 学 食 品 学 院, 广 东 广 州 51642;3. 福 建 农 林 大 学 食 品 科 技 学 院, 福 建 福 州 352) : 建 立 沙 丁 胺 醇 的 直 接 竞 争 ELISA(dcELISA) 快 速 检 测 方 法, 采 用 高 碘 酸 钠 法 制 备 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 沙 丁 胺 醇 单 克 隆 抗 体, 棋 盘 滴 定 法 确 定 包 被 抗 原 质 量 浓 度 和 抗 体 稀 释 倍 数, 通 过 单 因 素 试 验, 考 察 反 应 体 系 中 表 面 活 性 剂 离 子 浓 度 甲 醇 体 积 分 数 ph 值 因 素 对 dcelisa 性 能 的 影 响, 确 定 最 优 检 测 条 件, 同 时 考 察 方 法 的 特 异 性 结 果 表 明 : 酶 标 抗 体 克 分 子 比 为 2.1 时 偶 合 物 的 滴 度 最 高, 最 佳 反 应 条 件 为 包 被 抗 原 质 量 浓 度 1μg/mL, 酶 标 抗 体 稀 释 256 倍,.1mol/L ph7.4 的 磷 酸 盐 抗 体 稀 释 液 (PBS) 中 含 体 积 分 数.5% 的 Tween-2.5mol/L NaCl 溶 液 和 体 积 分 数 5% 的 甲 醇 时 dcelisa 具 有 最 高 的 灵 敏 度 和 最 好 的 稳 定 性, 所 建 立 方 法 的 IC5 为 1.3ng/mL, 检 测 限 为.49ng/mL, 线 性 范 围.3~76.3ng/mL, 批 内 变 异 系 数 13.8%, 批 间 变 异 系 数 为 22.38%, 与 克 伦 特 罗 交 叉 反 应 率 为 321.18%, 与 溴 布 特 罗 交 差 反 应 率 为 29.9%, 与 其 他 结 构 类 似 物 没 有 明 显 交 叉 反 应 本 研 究 所 建 立 的 dcelisa 可 用 于 沙 丁 胺 醇 和 克 伦 特 罗 的 多 残 留 检 测 : 沙 丁 胺 醇 ; 酶 标 抗 体 ; 直 接 竞 争 ELISA Direct Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Rapid Determination of Salbutamol WANG Bao-ling 1,2,YUAN Li-peng 2,LEI Hong-tao 2, *,XU Zhen-lin 2,YANG Jin-yi 2, SUN Yuan-ming 2,DING Wu 1,PANG Jie 3 (1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 7121, China;2. Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 51642, China ;3. College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 352, China) Abstract:A direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dcelisa) was developed for rapidly determining salbutamol. Horseradish peroxidase-labeled salbutamol monoclonal antibodies were synthesized by sodium periodate method. The optimal coating concentration and antibody dilution were determined by chequerboard titration. The effects of surfactants, ion concentration, methanol content and ph on the sensitivity of dcelisa were investigated by single-factor experiments. The results showed that the optimal molar ratio of enzyme-labeled antibody was 2.1. The optimized assay conditions for both the highest sensitivity and the best stability were as follows: coating antigen concentration, 1μg/mL; and dilution fold of antibodyenzyme conjugate in.1 mol/l ph 7.4 PBS dilution containing.5 % Tween-2,.5 mol/ml NaCl, and 5% methanol, 256. The developed method presented an IC5 of 1.3 ng/ml, a detection limit of.49 ng/ml, a linear range of.3 to 76.3 ng/ml, with an intra-batch CV of 13.8 % and an inter-batch CV of 22.38%, and 321.18% and 29.9% cross-reactivity rates with clenbuterol and brombuterol, respectively, without notable cross-reactivity with other structural analogues of salbutamol. This study provides valuable experimental data for developing a commercial immunoassay kit for the rapid determination of multiresidues of salbutamol and clenbuterol. Key words:salbutamol;enzyme-labeled antibody;direct competitive ELISA 中 图 分 类 号 :S859.84 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :12-663(21)2-27-5 收 稿 日 期 :21-1-6 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (287729;37663); 十 一 五 国 家 科 技 支 撑 计 划 项 目 (26BAD27B2-5); 广 东 省 科 技 计 划 项 目 (29B452;zgzhzd88) 作 者 简 介 : 王 保 玲 (1984 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 食 品 质 量 与 安 全 E-mail:wbl1326@foxmail.com * 通 信 作 者 : 雷 红 涛 (1973 ), 男, 副 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 食 品 安 全 生 物 分 析 化 学 E-mail:hongtao@scau.edu.cn

分 析 检 测 食 品 科 学 21, Vol. 31, No. 2 271 近 年 来, 瘦 肉 精 克 伦 特 罗 常 被 发 现 非 法 添 加 在 动 物 饲 料 中 以 增 加 饲 料 报 酬 率, 导 致 严 重 的 瘦 肉 精 中 [1-3] 毒 事 件 时 有 发 生, 政 府 监 管 力 度 也 因 此 不 断 加 强, 为 逃 避 监 管, 不 法 者 不 断 寻 找 新 的 瘦 肉 精 替 代 品 沙 丁 胺 醇 (salbutamol,sal) 是 一 种 类 似 克 伦 特 罗 的 β- 肾 上 腺 素 兴 奋 剂, 在 临 床 上 常 用 于 防 治 哮 喘 和 支 气 管 痉 挛, 但 摄 入 过 量 则 会 导 致 心 悸 头 疼 目 眩 恶 心 [4] 甚 至 损 害 肝 肾, 其 残 留 严 重 危 害 着 人 们 的 身 体 健 康 和 生 命 安 全 作 为 一 种 潜 在 的 瘦 肉 精 替 代 品, 很 有 必 要 加 强 沙 丁 胺 醇 的 监 控 目 前 国 内 外 对 沙 丁 胺 醇 残 留 的 检 测 主 要 采 用 仪 器 分 [5-8] 析 方 法 仪 器 设 备 检 测 虽 然 准 确 灵 敏, 但 设 备 昂 贵, 样 品 前 处 理 复 杂, 需 要 专 业 人 员 才 可 操 作, 不 适 于 大 量 样 品 的 筛 选 检 测 免 疫 分 析 方 法 操 作 简 便 快 捷 高 通 量 灵 敏 度 高, 目 前 已 经 成 为 食 品 安 全 快 速 [9] [1] 筛 选 检 测 的 主 要 方 法 之 一 Pou 等 和 Collins 等 分 别 建 立 沙 丁 胺 醇 放 射 免 疫 分 析, 其 检 测 限 可 以 达 到.1ng/mL 和.4ng/g, 但 由 于 放 射 免 疫 分 析 的 特 殊 性, 使 这 一 技 术 无 法 得 到 普 遍 的 应 用 尽 管 已 有 沙 丁 胺 醇 ELISA 的 研 [11-13] 究 报 道, 但 都 为 间 接 竞 争 法, 至 今 国 内 外 尚 未 见 采 用 酶 标 抗 体 模 式 的 沙 丁 胺 醇 的 直 接 竞 争 ELISA(dcELISA) 报 道 本 实 验 通 过 研 究 酶 标 抗 体 克 分 子 比, 优 化 dcelisa 检 测 条 件, 建 立 一 种 酶 标 抗 体 直 接 竞 争 的 沙 丁 胺 醇 ELISA 检 测 方 法 1 材 料 与 方 法 1.1 试 剂 与 仪 器 硫 酸 沙 丁 胺 醇 ( 纯 度 99.5%) 华 南 农 业 大 学 兽 药 厂 ; 克 伦 特 罗 ( 纯 度 99.5%) 莱 克 多 巴 胺 ( 纯 度 99.5%) 美 国 Sigma 公 司 ; 异 丙 肾 上 腺 素 ( 纯 度 99%) 溴 布 特 罗 ( 纯 度 99%) 去 甲 肾 上 腺 素 ( 纯 度 99%) 广 州 伟 伯 化 工 有 限 公 司 ; 沙 丁 胺 醇 单 克 隆 抗 体 本 实 验 室 制 备 ; 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ; 高 碘 酸 钠 ( 分 析 纯 ) 硼 氢 化 钠 乙 二 醇 广 州 化 学 试 剂 厂 ; 硫 酸 铵 广 州 台 山 粤 桥 化 工 厂 ;Tween-2( 进 口 分 装 ) 广 州 市 医 药 公 司 ; 四 甲 基 联 苯 胺 (TMB) 国 药 集 团 化 学 试 剂 公 司 ; 其 他 均 为 国 产 分 析 纯 96 孔 可 拆 酶 标 板 厦 门 运 鹏 科 技 有 限 公 司 ; Multiskan MK3 酶 标 仪 Wellwash MK2 洗 板 机 美 国 Thermo 公 司 方 法.1 酶 标 记 抗 体 [14] 采 用 高 碘 酸 钠 法, 用 HRP 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 沙 丁 胺 醇 单 克 隆 抗 体.2 dcelisa 操 作 步 骤 包 被 液 (CBS) 稀 释 液 (PBS) 洗 涤 液 (PBST) 封 闭 液 TMB 底 物 溶 液 终 止 液 均 按 文 献 [14] 方 法 配 制 用 包 被 液 稀 释 SAL-OVA 到 质 量 浓 度 为 1μg/mL, 加 到 酶 标 板 孔 中,1μL/ 孔,4 冰 箱 过 夜 ; 甩 干 孔 中 液 体, 用 蒸 馏 水 洗 涤 4 次, 甩 干 每 孔 加 入 3g/1mL 脱 脂 奶 粉 ( 用 包 被 液 溶 解 )2μL,37 温 箱 中 孵 育 3h, 甩 干 孔 中 液 体 用 蒸 馏 水 洗 涤 1 次, 置 37 烘 箱 中 2h 备 用 ; 称 量 皿 称 取 SAL 2mg, 用 1mL 抗 体 稀 释 液 溶 解, 连 续 1 倍 稀 释 成 2 1 6 2 1 5 2 1 4 2 1 3 2 1 2 2 1 1 2 2 1-1 2 1-2 ng/ml; 抗 体 稀 释 液 稀 释 256 倍 ; 每 孔 加 入 SAL 标 准 液 和 HRP- McAb 各 5μL, 轻 摇 混 合,37 温 箱 中 孵 育 1h, 蒸 馏 水 洗 涤 4 次, 甩 干, 加 显 色 液,37 温 箱 中 显 色 15min, 加 入 终 止 液, 测 A 45nm 值.3 数 据 分 析 采 用 Origin 7.5 软 件 的 四 参 数 对 数 函 数 进 行 曲 线 拟 合, 见 式 (1) A - D y= (1) [1+(x/C) B ] + D 式 中 :y 为 45nm 波 长 处 的 吸 光 度 ;x 为 沙 丁 胺 醇 的 质 量 浓 度 ;A 为 曲 线 渐 进 线 最 大 值, 沙 丁 胺 醇 浓 度 等 于 时 的 吸 光 度, 即 A max;b 为 曲 线 回 折 点 处 的 斜 率, 即 5% 的 在 曲 线 上 对 应 点 的 斜 率 ;C 为 曲 线 回 折 点 对 应 的 x 值, 等 于 5% 的 所 对 应 的 沙 丁 胺 醇 质 量 浓 度, 即 IC5;D 为 曲 线 渐 进 线 最 小 值, 等 于 背 景 值 绘 制 出 竞 争 性 ELISA 检 测 曲 线 后, 通 过 比 较 和 IC5 以 及 /IC5 评 价 曲 线 性 能 [15-16].4 理 化 因 素 影 响 采 用 棋 盘 滴 定 法 确 定 出 不 同 包 被 抗 原 质 量 浓 度 下 的 酶 标 抗 体 工 作 质 量 浓 度, 然 后 比 较 不 同 包 被 抗 原 质 量 浓 度 下 的 dcelisa 曲 线 参 数, 筛 选 出 最 适 工 作 质 量 浓 度 通 过 单 因 素 试 验, 考 察 稀 释 液 中 不 同 含 量 的 Tween-2 NaCl 溶 液 有 机 溶 剂 甲 醇 溶 液 以 及 ph 值 对 dcelisa 检 测 性 能 的 影 响.5 沙 丁 胺 醇 dcelisa 特 异 性 分 析 以 交 叉 反 应 率 (CR) 评 价 方 法 的 特 异 性 沙 丁 胺 醇 的 IC5 CR/%= 1 (2) 各 结 构 类 似 物 的 IC5 2 结 果 与 分 析 2.1 酶 标 抗 体 筛 选 表 1 酶 标 抗 体 克 分 子 比 对 滴 度 的 影 响 Table 1 Effect of molar ratio of enzyme-labeled antibody on its titer 酶 标 抗 体 结 合 物 中 酶 结 合 物 中 的 IgG 量 /(mg/ml) 酶 量 /(mg/ml) 克 分 子 比 滴 度 1.46 1.134 1.4 6 2.718 1.322 2.1 3 3.622.935 2.7 8

272 21, Vol. 31, No. 2 食 品 科 学 分 析 检 测 一 般 酶 标 抗 体 克 分 子 比 在 1.5~2. 活 性 最 好, 过 低 过 高 都 有 可 能 影 响 酶 活 或 抗 体 结 合 亲 和 力 本 实 验 制 备 3 种 不 同 结 合 比 的 酶 标 抗 体, 分 别 与 包 被 抗 原 反 应, 活 性 鉴 定 ( 表 1) 发 现, 克 分 子 比 为 2.1 的 偶 联 物 的 滴 度 最 高, 可 达 3, 明 显 高 于 克 分 子 比 1.4 和 2.7 的 酶 标 抗 体, 因 此, 最 终 采 用 抗 体 克 分 子 比 为 2.1 的 酶 标 记 抗 体 进 行 随 后 实 验 文 献 报 道 克 分 子 比 在 1.5~2. 时 效 果 最 好, 本 研 究 结 果 与 其 报 道 基 本 一 致 2.2 包 被 抗 原 质 量 浓 度 的 筛 选 图 1 包 被 抗 原 质 量 浓 度 对 A max IC5 和 A max/ic5 的 影 响 Fig.1 Effect of coating concentration on, IC5 and /IC5 包 被 抗 原 质 量 浓 度 会 影 响 标 准 曲 线 的 灵 敏 度, 包 被 的 质 量 浓 度 越 小, 与 游 离 抗 原 的 竞 争 力 就 会 减 弱, 这 样 会 使 曲 线 的 灵 敏 度 增 加, 但 是 包 被 质 量 浓 度 太 小, 就 会 影 响 A max 和 曲 线 的 稳 定 性 由 图 1 可 知,A max 和 IC5 在 包 被 抗 原 质 量 浓 度.5~2μg/mL 呈 现 逐 渐 增 大 的 趋 势,2 μ g/ml 达 最 大, 以 后 又 明 显 降 低 A max/ic5 在 1.μg/mL 达 最 大 值 由 于 1.μg/mL 包 被 抗 原 质 量 浓 度 时 IC5 值 较 小, 且 A max/ic5 最 大, 表 明 该 包 被 抗 原 质 量 浓 度 下 灵 敏 度 最 高 因 此, 在 以 后 的 实 验 中 选 择 包 被 抗 原 质 量 浓 度 1μg/mL 2.3 Tween-2 体 积 分 数 对 反 应 的 影 响 2.8 2.4 IC5 /IC5 1 8 6 2. 4.5 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 2. IC5 /IC5.1.2.3.4.5 Tween-2 体 积 分 数 /% 8 6 4 2 IC5/(ng/mL).15.1.5 图 2 Tween-2 体 积 分 数 对 IC5 和 /IC5 的 影 响 Fig.2 Effect of Tween-2 amount on, IC5 and /IC5 Tween-2 是 免 疫 分 析 中 一 种 常 用 的 表 面 活 性 剂, 可 以 减 少 非 特 异 性 吸 附, 且 可 以 保 护 抗 体 减 少 失 活, 尤 其 是 可 以 提 高 酶 标 抗 体 的 滴 度 本 研 究 在 稀 释 缓 冲 液 包 被 质 量 浓 度 /(μg/ml) IC5/(ng/mL).8.6.4.2 /IC5 /IC5 中 添 加 不 同 体 积 的 Tween-2, 分 析 其 对 SAL-dcELISA 的 影 响 ( 图 2) 稀 释 液 不 含 Tween-2 时 抗 体 的 效 价 很 低, 灵 敏 度 很 低 Tween-2 体 积 分 数 为.25%~.5% 时, IC5 从 2.ng/mL 降 低 到 1.1ng/mL, 从 1.1 升 高 到, /IC5 从 1.1 大 幅 度 增 加 到 2., 即 Tween-2 体 积 分 数 为.5% 时 达 到 最 大 值, 说 明 此 时 曲 线 的 灵 敏 度 最 高 Tween-2 体 积 分 数.1% 以 上 时, 大 致 呈 上 升 趋 势, 趋 于 平 稳 IC5 变 化 不 大,A max/ic5 开 始 大 幅 度 降 低, 即 灵 敏 度 开 始 降 低 综 合 比 较 后 Tween-2 体 积 分 数 为.5% 时, 灵 敏 度 最 高, 因 此 确 定 稀 释 液 中 Tween-2 体 积 分 数 为.5% 时 为 最 佳 2.4 NaCl 浓 度 对 dcelisa 的 影 响 图 3 NaCl 浓 度 对 IC5 和 /IC5 的 影 响 Fig.3 Effect of NaCl concentration on, IC5 and /IC5 溶 液 的 离 子 浓 度 通 常 会 影 响 抗 体 和 酶 的 活 性, 所 以 会 影 响 抗 原 抗 体 相 互 作 用 为 考 察 离 子 浓 度 对 沙 丁 胺 醇 dcelisa 的 影 响, 本 研 究 选 用 ph7.4 的.1mol/L 的 PBS 配 制 含.5.15.5 1.5mol/L NaCl 的 反 应 体 系 进 行 反 应, 结 果 如 图 3 所 示 在.5~.15mol/L NaCl 浓 度 范 围 内, 随 着 NaCl 浓 度 增 大,A max 值 迅 速 增 大, 这 说 明 在 低 离 子 浓 度 范 围 内, 增 大 离 子 浓 度 有 利 于 抗 原 抗 体 结 合 反 应 ; 在.15~1.5mol/L NaCl 浓 度 范 围 内, 和 IC5 随 着 NaCl 浓 度 增 大 而 呈 现 先 降 低 又 升 高 的 趋 势, 在 1.5mol/L 时 达 到 最 大 /IC5 在.5mol/L 时 达 到 最 大, 此 时 灵 敏 度 最 高, 故 在 以 后 反 应 体 系 中 使 用.5mol/L NaCl 2.5 甲 醇 体 积 分 数 对 dcelisa 的 影 响 1..8 IC5 2 /IC5.6.5 1. 1.5 NaCl 浓 度 /(mol/l) 1.9 1.8 IC5 12 /IC5 1.7 8 1.5 1.4 4 1.3 5 1 15 2 25 甲 醇 体 积 分 数 /% IC5/(ng/mL).6.5.4.3.2.1 图 4 甲 醇 体 积 分 数 对 A max IC5 和 A max/ic5 的 影 响 Fig.4 Effect of methanol amount on, IC5 and /IC5 6 4 IC5/(ng/mL).1.8.6.4.2 /IC5 /IC5

分 析 检 测 食 品 科 学 21, Vol. 31, No. 2 273 甲 醇 经 常 作 为 一 种 促 溶 剂 使 用 在 ELISA 中 本 研 究 考 察 反 应 体 系 中 甲 醇 体 积 分 数 对 沙 丁 胺 醇 dcelisa 的 影 响 ( 图 4) A max 随 着 甲 醇 体 积 分 数 的 增 大 逐 渐 降 低, IC5 的 整 体 表 现 为 先 降 低 又 升 高, 甲 醇 体 积 分 数 为 5% 时 降 到 最 低 点, 此 时 /IC5 在 5% 甲 醇 溶 液 时 达 到 最 大, 在 1.8~1.9 之 间, 吸 光 度 比 较 稳 定, 灵 敏 度 也 较 高, 故 在 以 后 反 应 体 系 中 甲 醇 体 积 分 数 为 5% 2.6 最 适 ph 值 的 确 定 A45nm 2. 1.5 IC5 /IC5 25 2 15 1..5 1 5 5 6 7 8 9 ph 图 5 ph 值 对 A max IC5 和 /IC5 的 影 响 Fig.5 Effect of ph on, IC5 and /IC5 图 6 沙 丁 胺 醇 标 准 曲 线 Fig.6 Standard curve of salbutamol IC5/(ng/mL) 2..8.4.1.1.1 1 1 1 1 1 SAL 质 量 浓 度 /(ng/nl).14.12.1.8.6.4.2 ph 值 主 要 影 响 抗 体 和 酶 的 等 电 点, 从 而 影 响 抗 原 抗 体 的 相 互 作 用 本 研 究 发 现 ( 图 5)A max 随 着 ph 值 增 大 出 现 减 小 的 趋 势, 对 抗 原 抗 体 的 结 合 影 响 较 大 ph 值 在 5.~6. 时 IC5 太 大,A max/ic5 很 小, 表 明 灵 敏 度 较 差 ph 值 大 于 7.4 时, 已 经 明 显 影 响 了 抗 体 和 酶 的 活 性,A max 小 于.7, 不 适 合 ELISA 检 测, 综 合 考 虑, ph7.4 时,IC5 较 低,A max 达 到 1.1, 灵 敏 度 较 好, 故 确 定 反 应 最 佳 的 ph 值 为 7.4 2.7 标 准 曲 线 的 绘 制 根 据 以 上 优 化 的 条 件 建 立 标 准 曲 线 ( 图 6), 该 曲 线 IC5 为 1.3ng/mL, 检 测 限 (9% 结 合 率 时 沙 丁 胺 醇 质 量 浓 度 ) 为.49ng/mL, 检 测 范 围 (2%~8% 结 合 率 时 的 沙 丁 胺 醇 质 量 浓 度 ) 为.23~76.3ng/mL, 批 内 变 异 系 数 13.8%, 批 间 变 异 系 数 为 22.38% 2.8 dcelisa 的 特 异 性 /IC5 交 叉 反 应 药 物 分 子 结 构 IC5/(nmol/mL) 交 叉 反 应 率 /% 沙 丁 胺 醇 HN.42 1 Cl H2N 克 伦 特 罗 Cl N.13 321.18 H Br 溴 布 特 罗 H2N.144 29.9 Br NH 莱 克 多 巴 胺 2.127 1.97 N H 异 丙 肾 上 腺 素 NH 3.72 1.13 去 甲 肾 上 腺 素 NH2 大 于 1 在 几 种 β- 兴 奋 剂 对 SAL 酶 标 记 抗 体 的 交 叉 反 应 曲 线 中, 发 现 SAL 单 克 隆 抗 体 与 克 伦 特 罗 溴 布 特 罗 都 有 高 的 交 叉 反 应 ( 表 2), 其 中 与 克 伦 特 罗 交 叉 反 应 率 为 321.18%, 与 溴 布 特 罗 交 差 反 应 率 为 29.9%, 与 其 他 结 构 类 似 物 几 乎 没 有 明 显 交 叉 反 应 3 讨 论 表 2 沙 丁 胺 醇 的 交 叉 反 应 Table 2 Cross-reactivity of the method 对 于 农 兽 药 小 分 子 的 ELISA 检 测 模 式 一 般 包 括 间 接 竞 争 ELISA 和 直 接 竞 争 ELISA 两 种 模 式 间 接 竞 争 ELISA 模 式 需 要 孵 育 2 次, 洗 板 2 次, 一 般 整 个 过 程 需 要 9~ 12min, 操 作 时 间 偏 长 本 实 验 室 长 期 从 事 农 兽 药 小 分 子 的 免 疫 快 速 检 测 研 究, 已 经 成 功 建 立 多 个 对 象 的 直 接 [18-19] 竞 争 ELISA 方 法 该 方 法 只 需 孵 育 1 次, 洗 板 一 次, 相 对 于 间 接 竞 争 ELISA 的 操 作 时 间 减 少 一 半 以 上, 在 实 际 应 用 中 具 有 显 著 优 势, 非 常 利 于 开 发 商 业 试 剂 盒 ELISA 反 应 条 件 如 包 被 抗 原 质 量 浓 度 抗 体 稀 释 倍 数 离 子 浓 度 ph 值 对 其 灵 敏 度 具 有 重 要 影 响 例 如 非 水 介 质 对 免 疫 反 应 的 影 响 一 直 是 低 水 溶 性 化 合 物 免 [18] 疫 方 法 建 立 过 程 中 的 一 个 重 要 问 题 沙 丁 胺 醇 微 溶 于 水, 较 易 溶 于 甲 醇, 本 实 验 重 点 研 究 样 品 稀 释 液 对 ELISA 检 测 沙 丁 胺 醇 的 影 响, 结 果 表 明 : 甲 醇 体 积 分 数 为 5% 时 可 以 提 高 反 应 的 灵 敏 度 同 时, 研 究 发 现 PBS 中 含.5mol/L NaCl 可 以 增 强 沙 丁 胺 醇 免 疫 分 析 灵 敏 度, 其 主 要 原 因 可 能 是 溶 液 的 离 子 强 度 增 加, 其 疏 水 作 用 增 加, 而 疏 水 作 用 是 抗 原 抗 体 相 互 反 应 的 一 种 主 要 作 用 力 此 前, 已 有 关 于 沙 丁 胺 醇 抗 体 制 备 研 究 报 道 邱 [2] 阳 生 等 所 制 备 沙 丁 胺 醇 单 抗 对 克 伦 特 罗 有 5% 的 抑 制

274 21, Vol. 31, No. 2 食 品 科 学 分 析 检 测 [21] 率, 史 利 军 等 得 到 的 单 抗 对 克 伦 特 罗 交 叉 反 应 率 达 1% 本 实 验 制 备 的 沙 丁 胺 醇 单 抗 对 克 伦 特 罗 交 叉 反 应 率 为 321.18%, 这 种 反 应 性 能 尚 未 在 其 他 沙 丁 胺 醇 反 应 模 式 中 报 道 过 沙 丁 胺 醇 和 克 伦 特 罗 结 构 上 都 具 有 叔 丁 氨 基 团, 这 个 共 有 结 构 叔 丁 氨 基 可 能 是 与 抗 体 结 合 的 特 异 性 表 位 本 研 究 同 时 发 现, 沙 丁 胺 醇 单 克 隆 抗 体 与 莱 克 多 巴 胺 和 异 丙 肾 上 腺 素 几 乎 没 有 交 叉 反 应, 尽 管 莱 克 多 巴 胺 和 异 丙 肾 上 腺 素 的 异 丙 胺 基 与 沙 丁 胺 醇 的 叔 丁 氨 基 很 相 似, 这 表 明 抗 体 的 识 别 能 力 非 常 精 细 本 实 验 所 建 立 的 酶 标 抗 体 直 接 竞 争 模 式 适 合 同 时 检 测 沙 丁 胺 醇 和 克 伦 特 罗, 用 于 两 种 药 物 的 同 时 筛 查 参 考 文 献 : [1] 吴 日 钧. 关 于 瘦 肉 精 检 测 的 几 点 思 考 [J]. 猪 业 科 学, 29, 26(6): 5-51. [2] 庞 苏 纳, 于 芳. 瘦 肉 精 及 其 危 害 简 介 [J]. 新 疆 畜 牧 业, 29(3): 17. [3] 肖 新 李, 黄 飞 平, 臧 清 华. 盐 酸 克 伦 特 罗 引 起 食 物 中 毒 225 例 [J]. 广 东 医 学, 22, 23(1): 14. [4] 刘 宣 兵, 庞 玉 芳, 侯 玉 泽, 等. 沙 丁 胺 醇 的 毒 副 作 用 及 其 残 留 检 测 [J]. 上 海 畜 牧 兽 医 通 讯, 28(4): 83-85. [5] GABIOLA C, CALONGE M A G, PORTILLO M P, et al. Validation of a method for the determination of salbutamol in animal urine by gas chromatography-mass spectrometry and its application to treated lamb samples[j]. Microcolumn Separations, 1996, 8: 361-364. [6] COUPER B R, FIONA J, DRUMMER A D. Gas chromatogra mphicmass spectrometric determination of β2-agonists in post mortem blood: application in forensic medicine[j]. Chromatography Biomedical Scienceand Application, 1996, 685(2): 12-15. [7] ZHANG Yantu, ZHANG Zhujun, SUN Yonghua, et al. Development of analytical method for the determination of β-agonist residues in animal tissues by high-performance liquid chromatography with on-line electrogenerated [Cu(HIO6)2] 5- -luminol chemiluminescence detection[j]. Agriculture and Food Chemistry, 27, 55(13): 4949-4956. [8] SOMSAK S, PROESPICHAYA K. Rapid analysis of clenbuterol, salbutamol, procaterol,and fenoterol in pharmaceuticals and human urine by capillary electrophoresis[j]. Talanta, 28, 76(5): 1194-1198. [9] POU K, ONG H, ADAM A, et al. Combined immunoextraction approach coupled to a chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of trace levels of salbutamol and clenbuterol in tissue samples[j]. Analyst, 1994, 119: 2659-2662. [1] COLLINS S, O'KEEFFE M, SMYTH M R, et al. Mutli-residue analysis for beta-agonists in urine and liver sample using missed phase cloumns with deterrnination by radioimmunoassay[j]. Analysy, 1994, 119(1): 2671-2674. [11] LEI Yichih, TSAI Yifen, TAI Yungte, et al. Development and fast screening of salbutamol residues in swine serum by an enzyme-linked immunosorbent assay in Taiwan[J]. Food Chem, 28, 56(14): 5494-5499. [12] SHEU Shiyuan, LEI Yichih, TAI Yungte, et al. Screening of salbutamol residues in swine meat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan[J]. Analytica Chimica Acta, 29, 654(2): 148-153. [13] MALUCELLI A, ELLENDORFF F, MEYER H H. Tissue distribution and residues of clenbuterol, salbutamol, and terbutaline in tissues of treated broiler chickens[j]. Animal Science, 1994, 72(6): 1555-156. [14] 朱 立 平, 陈 学 清. 免 疫 学 常 用 实 验 方 法 [M]. 北 京 : 人 民 军 医 出 版 社, 2: 351-357. [15] GUO Yongen, CHEN Jiahua, WANG Nengdong, et al. Preparation and application of polyclonal antibody to butachlor[j]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, 22, 38(4): 447-452. [16] MERCADER J V, MONTOYA A. A monoclonal antibody-based ELISA for the analysis of azinphos-methyl infruit juices[j]. J Agric Food Chem, 1997, 47(1): 95-11. 杨 利 国, 胡 少 昶, 魏 平 华, 等. 酶 免 疫 测 定 技 术 [M]. 南 京 : 南 京 大 学 出 版 社, 1998: 7-71. [18] 雷 红 涛, 冯 伟 雯, 沈 玉 栋, 等. 除 草 剂 丁 草 胺 直 接 竞 争 ELISA 检 测 方 法 研 究 [J]. 农 业 环 境 科 学 学 报, 26, 25(4): 118-123. [19] 董 雪, 钟 青 萍, 黄 安 诚, 等. 河 豚 毒 素 直 接 竞 争 ELISA 检 测 方 法 的 研 究 [J]. 现 代 食 品 科 技, 29(8): 977-981. [2] 邱 阳 生, 杨 根 海, 何 方 洋. 沙 丁 胺 醇 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 鉴 定 [J]. 中 国 兽 医 科 学, 22, 32(1): 25-26. [21] 史 利 军, 杨 正 涛, 王 艳, 等. 沙 丁 胺 醇 单 克 隆 抗 体 的 制 备 及 其 免 疫 学 检 测 方 法 的 建 立 [J]. 中 国 兽 医 杂 志, 26, 42(6): 12-14.