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1 6 3 Vol. 6 o Journal of Food Safety and Quality Mar., 2015 * 熊波, 吴胜泽, 苏焕斌, 张燕, 刘辉 (, ) 摘要 : 目的 (sildenafil, SD) 方法 (SDH) (SDH-BSA),, SD, 结果 SD, , 0.02~3.8 ng/ml,, 结论 SD, SD 关键词 : ; ; Preparation and specificity analysis of sildenafil polyclonal antibody XIG Bo, WU Sheng-Ze, SU Huan-Bin, ZHAG Yan, LIU Hui * (Guangdong Provincial Product Quality Supervision and Inspection Institute, Shunde , China) ABSTRACT: bjective To prepare high sensitivity and specificity polyclonal antibody against sildenafil (SD). Methods Sildenafil hapten (SDH) and Sildenafil antigen (SDH-BSA) were prepared by artificial methods. Then, through immunized rabbits the SD polyclonal antibody was prepared. Results After immunity, the polyclonal antibody against SD was generated. The titer of the antibody was The linear detection of the polyclonal antibody was ranged from 0.02 ng/ml to 3.8 ng/ml. The polyclonal antibody had a high cross reaction rate to vardenafil, but had a low response rate to hongdenafil and calais. Conclusion SD polyclonal antibody had a high specificity and sensitivity, and it could be applied to the development of SD rapid detection kit. KEY WRDS: sildenafil; polyclonal antibody; ELISA 1 引言 (sildenafil, SD) FDA1998 (erectile dysfunction, ED), 5, cgmp GMP, cgmp,,, ED [1-3], [4],,,, 基金项目 : (2013B ) Fund: Supported by Guangdong Province Science and Technology Plan Project (2013B ) * 通讯作者 :,, [email protected] *Corresponding author: LIU Hui, Engineer, Guangdong Provincial Product Quality Supervision and Inspection Institute, Shunde , China. [email protected]

2 3, : 1023,, SD, - [5-7],, SD, SD, SD 2 材料与方法 2.1 材料与试剂 2,, 3 kg, ; Freund, - (DMF) - (HS) (DCC) (BSA) (VA) 3, 3, 5, 5 - (TMB) Sigma ; Alfa Aesar ; 2.2 仪器与设备 HP1100 (, Agilent); Multiskan MK3 (, Thermo ); Wellwash MK2 (, Thermo ) 2.3 实验方法 SD 半抗原的合成 4.75 g (4.75 g, 10 mmol), 30 ml DMF, 520 mg 60 1 h, 2.34 g, 15 min, h, DMF, 20 ml,,,,,, 6 ml, 3 ml (TFA), 2 h, TLC,, SDH, 人工抗原制备与鉴定 [8] SDH-BSA, SDH-VA 0.1 mmol 0.5 ml DMF, 0.2 mmol DCC 0.2 mmol HS,, (4000 r/min, 5 min),, BSA VA( BSA VA 60:1)pH 9.6, 4 h,,, 2, 0.8%, SDH Fig. 1 The synthesis of SDH hapten

3 ~400 nm,, (BSA VA) [9] [10] 多克隆抗体的制备 3 kg, 0.5mg 2 ml 2 ml 3,,, ELISA, 10 d, (4000 r/min, 5 min), 抗体特异性分析 SD, SD 3 结果与分析 3.1 SD 半抗原的鉴定 - (LC-MS), 2 3, [M+H] +, SDH 533.4[M+H] +, 3.2 SD 抗原的制备及鉴定 4 SDH BSA VA SDH-BSA SDH-VA,, SDH-BSA 276~277 nm, D, 245 nm, D, 300~320 nm ; SDH-VA 276~277 nm, D, 248 nm, D, SDH BSA VA, SDH BSA VA,,, SDH 3.3 抗体效价的测定及其标准曲线的绘制 icelisa,,, A 450nm 1.0 [11], (D) 1.0, 0.25 μg/ml, Fig. 2 2 SDH The mass spectrogram of SDH intermediate

4 3, : 1025 Fig. 3 3 SDH The mass spectrogram of SDH hapten Fig. 4 4 SDH UV spectrum of SDH artificial antigens and haptens 5 ELISA Fig. 5 The icelisa standard curve of SD, riginlab 7.5 ELISA S, SDH-VA, ELISA 5, IC ng/ml, (IC 20 ~IC 80 ) 0.02~3.8 ng/ml 3.4 SD 多克隆抗体特异性分析 icelisa, icelisa, SD, SD

5 Table 1 表 1 SD 与结构类似物或功能类似物的交叉反应率结果 (n=3) Cross reactivity of polyclonal antibody with analogous compound of SD (n=3) IC 50 (ng/ml) S H S H CH3 H <0.01 H <0.01, 50%, [12] 100 IC50 (SD) CR(%) IC (cross - reactant) 50 cgmp PDE-5 PcAb-SDH-BSA, (72.7%), (<0.01%) SD, SD, SD, SD,, 4 讨论, [13], [14], [15] SD, SD, SD, SD, 0.01%, 72.7%,, SD 参考文献 [1] Behr-Roussel D, udot A, Caisey S, et al. Daily treatment with sildenafil reverses endothelial dysfunction and oxidative stress in an animal model of insulin resistance [J]. European urology, 2008, 53(6): [2] Fleshner, Harvey M, Adomat H, et al. Evidence for contamination of herbal erectile dysfunction products with phosphodiesterase type-5 inhibitors [J]. Urology, 2005, 174(2): 636. [3],,. [J]., 1999, 21(6): Wang J, Ren J, Wang ZG. Mode of Action of Sildenafil [J] Acta Acad Med Sinicae, 1999, 21(6): [4] McCulley TJ, Luu JK, Marmor MF, et al. Effects of sildenafil citrate (Viagra) on choroidal congestion [J]. phthalmologica, 2002, 216 (6): [5],. [J]., 2008, 28(8): Pang XX, Lv HC. Fast detection method of sildenafil in Chinese patent drug and traditional Chinese medicine health care products

6 3, : 1027 [J]. Chin J Hosp Pharm, 2008, 28(8): [6],,. [J]., 2007, 6(3): Lu J, Yang DJ, Fang CR. Determination of sildenafil citrate in health food by high-performance liquid chromatography [J]. Chin J Public Health Eng, 2007, 6(3): [7],,,. - [J]., 2007, 29(9): Zhang CY, Li ZG, Xu JL, et al. Determination of sildenafil citrate illegally mixed into traditional Chinese medicinal preparation by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Chin Tradit Patent Med, 2007, 29(9): [8] Cho YA, Seok JA, Lee HS, et al. Synthesis of haptens of organophosphorus pesticides and development of immunoassays for fenitrothion [J]. Anal Chim Acta, 2004, 522(2): [9] Singh K V, Kaur J, Varshney G C, et al. Synthesis and characterization of hapten-protein conjugates for antibody production against small molecules[j]. Bioconjugate Chem, 2004, 15(1): [10],,,. [J]., 2009, 30(11): Xie GM, Sun YM, Xu ZL, et al. Design of Generic Haptens for, -Diethyl phosphorothioate pesticides and recognition [12],,,. [J]., 2011, 27(9): Cao H, Ji Fang, Wang XY, et al. Synthesis and identification of the hapten and complete antigens for Zearalenone [J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2011, 27(9): [13]. ELISA [D]. :, Hu Y. Preparation of Monoclonal Antibodies Against Salbutamol and the Establishment of an Indirect ELISA Method for Detection[D]. Yangzhou: Yangzhou University, [14],,. [J]., 2010, 38(8): Song J, Wang RM, Wang YQ. Hapten design, modification and preparation of artificial antigens [J]. Chin J Analytical Chem, 2010, 38(8): [15],. [J]., 2008, 10(2): Shi HY, Wang MH. Effect of Hapten Space Arm Length on immune recognition [J]. Chin J Pestic Sci, 2008, 10(2): 作者简介 ( 责任编辑 : 白洪健 ) 熊波, 硕士, 主要研究方向为食品质量安全 xiongbo @126.com properties of antibodies [J]. Chem J Chin Univ, 2009, 30(11): [11] Abad A, Moreno MJ, Montoya A. Development of monoclonal antibody-based immunoassays to the -methylcarbamate pesticide Carbofuran [J]. J Agric Food Chem, 1999, 47: 刘辉, 博士, 食品质量工程师, 主要研究方向为食品安全与营养 [email protected]

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