1 TEV 蛋白酶热稳定性突变体的理性设计 Rational design of TEV protease mutants with enhanced thermostability G05D 刘逸珩 2021.11.23
小组成员 组长 : 康锦瑞 2001110555@stu.pku.edu.cn 李展 2001110464@stu.pku.edu.cn 张萃雯 2001110467@stu.pku.edu.cn 刘逸珩 2001111582@stu.pku.edu.cn 2
3 小组成员 编号姓名导师研究方向 G05A 康锦瑞李毅水稻的抗病毒机制 G05B 张萃雯范六民逆境小体形成的分子机制 G05C 李展李磊 mirna 和铜稳态 G05D 刘逸珩王忆平生物固氮 合成生物学
背景 TEV 蛋白酶 (TEVp) TEVp 来源于烟草蚀纹病毒 TEV, 其基因组全长为 9500bp, 编码一个 3054 氨基酸的多肽, 在感染细胞后经过三种病毒蛋白酶加工成 10 个成熟产物 TEVp 的最适温度为 30, 当温度达到或高于 37 时, 其酶活性会急剧下降 F. Cesaratto, O. R. Burrone, G. Petris, Tobacco Etch Virus protease: A shortcut across biotechnologies. J. Biotechnol. 231, 239-249 (2016). 4
5 背景 应用 : 蛋白质纯化 蛋白质纯化过程常需要一些亲和标签, 如 GST-Tag His-Tag 等
背景 应用 : 定化学计量比多组分表达系统 J. Yang et al., Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E8509-E8517 (2018). 6
7 背景 应用 : 定化学计量比多组分表达系统 将 Klebsiella oxytoca 原本的 18 个基因融合为 5 个巨型基因, 且能够维持原本表达量的化学计量比值 J. Yang et al., Polyprotein strategy for stoichiometric assembly of nitrogen fixation components for synthetic biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E8509-E8517 (2018).
背景 脯氨酸效应 : 现象 脯氨酸在寡聚 -1,6 葡萄糖苷酶中的占比与来源菌株的偏好温度呈现显著的正相 关关系 来源菌株 生境特征 Proline % Bacillus cereus ATCC 7064 嗜温菌 2.37 Bacillus coagulans ATCC 7050 兼性嗜温菌 4.63 Bacillus sp. KP 1071 嗜热菌 5.67 Bacillus thermoglucosidasius KP 1006 专性嗜热菌 6.79 Bacillus flavocaldarius KP 1288 极端嗜热菌 8.52 Y. Suzuki, K. Oishi, H. Nakano, T. Nagayama, A strong correlation between the increase in number of proline residues and the rise in thermostability of five Bacillus oligo-1,6-glucosidases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26, 546-551 (1987). 8
背景 脯氨酸效应 : 原理 脯氨酸具有较强的刚性, 在合适位点引入脯氨酸突变能够稳定蛋白结构, 是一种常用的蛋白质工程策略 脯氨酸可限制蛋白质未折叠形式的柔性, 将未折叠形式的熵优势降低 ~1.2 kcal/mol 脯氨酸突变在 β- 转角 无规卷曲以及 α- 螺旋和 β- 折叠的 N 端等位点容忍性 通常较好 J. Huang, B. J. Jones, R. J. Kazlauskas, Stabilization of an alpha/beta-hydrolase by Introducing Proline Residues: Salicylic Acid Binding Protein 2 from Tobacco. Biochemistry 54, 4330-4341 (2015). R. S. Prajapati et al., Thermodynamic effects of proline introduction on protein stability. Proteins 66, 480-491 (2007). 9
背景 脯氨酸效应 : 应用 通过序列比对以及分子动力学模拟, 确定潜在的突变位点后, 通过定点引入脯 氨酸突变的方式将烟草的 SABP 蛋白的 T 1/2 15min 提升了 25.7 J. Huang, B. J. Jones, R. J. Kazlauskas, Stabilization of an alpha/beta-hydrolase by Introducing Proline Residues: Salicylic Acid Binding Protein 2 from Tobacco. Biochemistry 54, 4330-4341 (2015). 10
背景 脯氨酸效应 : 应用 通过引入 2 个脯氨酸, 将抗原 S 蛋白稳定在活性构象, 从而激发更高效更持久的免疫反应 ( 在辉瑞及 Moderna 的疫苗生产中已应用 ) 两名共一 :Daniel Wrapp 王年爽 D. Wrapp et al., Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 367, 1260-1263 (2020). 11
12 使用完整序列预测结构 发现 RCSB PDB 中 TEVp 的结构存在部分片段的缺失 (1Q31) 使用 I-TASSER Sever 预测完整的序列结构, 补全缺失部分 用 Swiss-PdbViewer 将预测结果与 1Q31 做拟合
分子动力学模拟 利用力场能量迭代求解蛋白质分子和溶剂分子中原子的牛顿运动方程, 记录构象在模拟中发生的改变 根据热力学定律, 系统往往会趋向于其自由能较低的状态, 也就是稳定的状态 可用来解决的问题 : 1. 蛋白质的折叠问题, 获得稳定构象 2. 配体与蛋白质的对接 3. 蛋白质的稳定性问题 软件 :Gromacs 2020.3 - MODIFIED 13
流程图 14
M. R. Smaoui, J. Waldispuhl, Computational re-engineering of Amylin sequence with reduced amyloidogenic potential. BMC Struct Biol 15, 7 (2015). 15 根据 PDB 坐标生成拓扑文件 命令 :gmx pdb2gmx -f TEVp-I_TASSER.pdb -o conf.gro -p topol.top -ignh 力场 :GROMOS96 53a6 溶剂模型 :SPC
16 加立方体模拟盒子 命令 :gmx editconf -f conf.gro -bt cubic -d 2.5 -c -o cubic_tevp.gro
17 加溶剂 命令 :gmx solvate -cp cubic_tevp.gro -o cubic_tevp.pdb -p topol.top
18 能量最小化 命令 :gmx grompp -f em.mdp -c cubic_tevp.pdb -p topol.top -o em_tevp
19 加 7 个 Cl 用于平衡电荷 命令 :gmx genion -s em_tevp.tpr -o ION.gro -p topol.top -nn 7 -nname CL
20 再次能量最小化, 并记录轨迹 命令 :gmx grompp -f em.mdp -c ION.gro -p topol.top -o em_tevp.tpr gmx mdrun -s em_tevp.tpr -deffnm cold v
21 查看能量降低情况 命令 :gmx energy -f cold.edr -o cold.xvg 选择 Potential( 势能 ) -1000000-1500000 势能 -2000000-2500000 -3000000 0 500 1000 步数
体系升温, 查看升温情况 命令 :gmx grompp -f upgrade.mdp -c cold.gro -p topol.top -o em_tevp_hot.tpr gmx mdrun -s em_tevp_hot.tpr -v -deffnm hot gmx energy -f hot.edr -o hot.xvg 温度 (K) 时间 (ps) 22
23 体系升温过程采样 命令 :gmx grompp -f sample.mdp -c hot.gro -p topol.top -o em_tevp_hot_sample.tpr gmx mdrun -s em_tevp_hot_sample.tpr -v -deffnm hot_sample
24 计算 RMSD 命令 :gmx rms -s em_tevp_hot_sample.tpr -f hot_sample.trr -o rmsd.xvg 发现 150 ps 时暂未达到热力学稳态, 应继续模拟至 RMSD 值较稳定 RMSD (nm) 时间 (ps)
25 计算 RMSF 命令 :gmx rmsf -s em_tevp_hot_sample.tpr -f hot_sample.trr -o rmsf.xvg -res 可见, 各氨基酸残基 RMSF 值相对大小与 I-TASSER Server 预测的 B-factor 基本一致 RMSF (nm) 残基
26 确定候选突变位点 选择 RMSF 值较高的区域, 要求尽量不在底物结合位点或者活性中心位置 选定 T119P K120P M122P 位于 β- 转角位置
27 M122P MISSENSE3D 预测 该突变会造成结构的 改变, 因此排除
28 K120P MISSENSE3D 预测该突变不造成结构的改变, 但会导致突变后该分子在突变位点减少一个氢键, 不利于提高热稳定性, 因此排除
29 T119P 无结构的改变, 无氢键数目的改变, 因此初步定为较理想的突变位点
30 分子动力学模拟 T119P 对结构的稳定效果 使用 I-TASSER Server 对突变后的蛋白结构做预测, 用于分子动力学模拟 在同样的参数设置下, 模拟结果显示,T119P 的分子在 120 附近的柔性较 WT 减弱, 整体刚性增强, 稳定性增强 RMSF(nm) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 50 100 150 200 WT T119 P 残基
31 WT 与 T119P 的结构比对 预测 T119P 的结构, 发现仍然能够与 WT 有较高的拟合度 WT T119P
后续工作 延长模拟时间, 获得更为准确的模拟结果 ; 对其他潜在的柔性较高的位点进行同样的突变模拟 ; 计算突变位点对整体结构热力学稳定性的贡献 ; 实验验证热稳定性 ( 包括最适温度 变性温度等 ) 是否有提升 ; 实验验证突变后蛋白质的活性 溶解性等其他生化参数是否发生改变 32
33 谢谢! G05 TEV 蛋白酶热稳定性突变体的理性设计 Rational design of TEV protease mutants with enhanced thermostability