Ni NTA Magarose Beads 目录 1. 产品介绍...1 2. 注意事项...2 3. 纯化流程...2 4. 订购信息及相关产品.5 1. 产品介绍 Ni NTA Magarose Beads 是专为高效 / 快速纯化组氨酸标签蛋白而设计的新型磁性微球产品, 可以在磁场作用下直接从生物样品中一步纯化出高纯度的目标蛋白, 极大的简化了纯化工艺和提高纯化效率, 适合科研和工业客户高通量地进行组氨酸标签蛋白的纯化 与传统的柱层析方法相比, 使用 Ni NTA Magarose Beads 无需控制上样流速, 更不需要昂贵的层析设备和离心设备, 样品与磁珠的结合以及目的蛋白与磁珠的分离变的非常简单 快捷, 而且更容易实现高通量 自动化的蛋白纯化方法 Ni NTA Magarose Beads 是以 4% 琼脂糖凝胶为基质, 通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸 (NTA), 螯合镍离子 (Ni 2+ ) 后, 可以形成非常稳定的八面体结构, 镍离子处于八面体的中心, 这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻 ( 产品结构见图 1 所示, 三种产品结构的区别 ), 更加稳定, 具体性能见表 1 COO - coo - 间隔臂 N Ni 2+ H 2 O Magarose Beads COO - H 2 O Ni NTA Magarose Beads 图 1. Ni NTA Magarose Beads 产品化学结构示意图 表 1. Ni NTA Magarose Beads 产品性能 项目 性能 基质 磁性琼脂糖微球 载量 (/ml 磁珠 ) >10 mg 6XHis-tagged protein 磁珠粒径 (μm) 30-100 磁珠比例 磁珠悬浮于保护液中, 含量为 20%(V/V) 保护液缓冲液 含 20% 乙醇的 1XPBS 储存温度 2 C-8 C 1 / 5 常州天地人和生物科技有限公司
表 2. Ni NTA Magarose Beads 试剂耐受情况试剂种类浓度还原剂 5 mm DTE 1 mm DTT 20 mm β-mercaptoethanol 5 mm TCEP 10 mm reduced glutathione 变性剂 8 M urea 6 M Gua-HCl 去污剂 2% Triton X-100 (nonionic) 2% Tween 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) 其他类 500 mm imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mm Na 2 SO 4 1.5 M NaCl 1 mm EDTA 60 mm citrate 缓冲液 50 mm sodium phosphate, ph 7.4 100 mm Tris-HCl, ph 7.4 100 mm Tris-acetate, ph 7.4 100 mm HEPES, ph 7.4 100 mm MOPS, ph 7.4 100 mm sodium acetate, ph 4 2. 注意事项 1) 使用本产品前, 请仔细阅读产品说明书 2) 磁珠保存过程中应避免冷冻 / 干燥和高速离心等操作, 否则会破坏磁珠的结构, 严重影响 蛋白结合能力 3) 在使用磁珠前, 请温和的 充分的震荡, 使磁珠保持均匀的悬浮状态 4) 使用过的磁珠重复使用时, 建议纯化同一种的蛋白, 纯化不同种蛋白时, 建议使用新的 磁珠, 以避免交叉污染 3. 纯化流程 3.1 缓冲液的准备 缓冲液可使用下列推荐缓冲液, 也可根据自己的使用习惯配置不同的缓冲液体系, 基本原理 就是低咪唑上样, 高咪唑洗脱, 或者高 ph 上样, 低 ph 洗脱 Buffer 在使用前最好用 0.22μm 或者 0.45 μm 滤膜过滤除菌 因为 Ni NTA Magarose Beads 可以用于可溶蛋白和包涵体 蛋白的纯化, 两种方法所需 Buffer 不同, 具体配置方法见表 3 和表 4 表 3. 可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方 名称 体积 配方 Binding Buffer 50 mm NaH 2 PO 4 (6.90 g NaH 2 PO 4 H 2 O) 10 mm imidazole (0.68 g imidazole) 2 / 5 常州天地人和生物科技有限公司
Wash Buffer 50 mm NaH 2 PO 4 (6.90 g NaH 2 PO 4 H 2 O) 20 mm imidazole(1.36 g imidazole) Elution Buffer 50 mm NaH 2 PO 4 (6.90 g NaH 2 PO 4 H 2 O) 250 mm imidazole (17.0 g imidazole) 上述缓冲体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化, 在 Binding Buffer 中添加一定浓度的咪 唑可以降低非特异性结合, 提高目的蛋白的纯度 初次使用的客户, 可以采用推荐的缓冲液, 再根据实验结果进行调整缓冲液中的咪唑的浓度 表 4. 包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方 名称 体积 配方 Binding Buffer 8 M Urea (480.50 g urea) 100 mm Tris Cl (12.10 g Tris Cl) 使用盐酸溶液调节 ph 至 8.0, Wash Buffer 8 M Urea (480.50 g urea ) 100 mm Tris Cl (12.10 g Tris Cl) 使用盐酸溶液调节 ph 至 6.3, Elution Buffer 8 M Urea(480.50 g urea) 100 mm Tris Cl(12.10 g Tris Cl) 使用盐酸溶液调节 ph 至 4.5, 3.2 样品准备 3.2.1 细菌或酵母表达的蛋白 1) 挑取单菌落到培养基中, 根据载体使用说明, 加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间 2) 表达结束后, 将培养液转移到离心杯中,7,000rpm(7,500 g), 离心 15min 收集菌体, 然后按照菌体 :Lysis Buffer=1:10(W/V) 加入 Lysis Buffer, 加入终浓度为 1mM 的 PMSF 加入溶菌酶 ( 工作浓度为 0.2-0.4mg/ml, 如果表达的宿主细胞内含 plyss 或 plyse, 可以不加溶菌酶 ),( 同时也可加入其他蛋白酶抑制剂, 但不能影响目的蛋白与树 脂的结合 ) 3) 将菌体沉淀悬浮起来,( 如果菌液浓度高, 也可考虑加入 10μg/ml RNase A 和 5μg/ml DNase I), 混匀, 放置于冰上, 然后冰上超声破碎细胞, 至菌液基本保持澄清 4) 将澄清的破碎液转移至离心管中,10,000rpm(15,000 g),4 度离心 20-30 分钟 取上 清, 置于冰上备用或 -20 度保存 3.2.2 酵母 昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白 1) 将细胞培养液转移至离心杯,5000rpm(3,800 g), 离心 10min, 收集菌体得上清, 如 3 / 5 常州天地人和生物科技有限公司
上清中不含 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 即可直接加入柱子使用 ; 如含有 EDTA 组氨酸和还原剂等物质, 需用 1 PBS 4 下透析才能加入柱子 2) 对于大量体积的上清, 加入硫酸铵沉淀浓缩后, 蛋白还需用 1XPBS 4 透析后才能使用 3.2.3 包涵体蛋白纯化 ( 变性条件 ) 1) 将培养液转移到离心杯中,7,000rpm(7,500 g), 离心 15min 收集菌体, 去掉上清 2) 按照菌体 :Binding buffer ( 不含 8M 尿素 )=1:10(W/V) 将菌体悬浮起来, 混匀, 冰浴超声破碎 3) 将破碎液转移至离心管中,10,000rpm(15,000 g),4 度离心 20-30 分钟 去掉上清, 步骤 2 和 3 可以重复一次 4) 按照菌体 : binding buffer( 含 8M 尿素 )=1:10(W/V) 将包涵体悬浮起来 5) 变性条件下进行 His 标签蛋白纯化, 具体缓冲液配方见表 4 3.3 样品纯化 1) 磁珠准备将 Ni NTA Magarose Beads 充分混匀, 使用移液器取适量的磁珠悬浮液, 置于离心管中, 将离心管置于磁分离器上, 待溶液变澄清后, 用移液器吸弃清液 2) 磁珠平衡再将离心管从磁分离器上取下来, 加入与悬浮液等体积的 Binding Buffer, 使用枪头反复吹打 5-10 次, 将离心管置于磁分离器上, 待溶液变澄清后, 用移液器吸弃清液, 重复洗涤 2 次 3) 磁珠结合目的蛋白将破碎液加入到处理好的磁珠中, 颠倒混匀 将离心管置于混合仪上, 室温孵育 30min( 如果目标蛋白不稳定, 建议置于 2-8 下孵育 1h) 4) 洗杂将离心管置于磁分离器, 待溶液变澄清后, 用移液器移出上清液, 保留, 以备取样检测 向离心管中加入 2 倍悬浮液体积的 Wash Buffer, 使用枪头反复吹打 5-10 次, 将离心管置于磁分离器上, 待溶液变澄清后, 用移液器吸取上清液, 保留, 以备取样检测 重复上述步骤 3 次以上 5) 洗脱目标蛋白可以根据需要改变洗脱体积从而达到调整目标蛋白浓度的目的 建议将 23-5 倍磁珠体积的 Elution Buffer 加入到离心管中, 使用移液器轻轻吹打 3-5 次, 混匀, 将离心管置于磁分离器上, 待溶液变澄清后, 用移液器吸取上清液, 即为目的蛋白组分 如有需要, 可以重复上述步骤 1 次, 以提高目的蛋白的回收量 6) 磁珠后处理向装有磁珠的离心管中加入 1ml Elution Buffer, 用移液器反复吹打 3-5 次, 使磁珠充分悬浮, 然后, 置于磁分离器, 吸弃上清, 重复该操作 2 次 再向该离心管中加入 1ml 去离子水, 用移液器反复吹打 3-5 次, 使磁珠充分悬浮, 然后, 置于磁分离器, 吸弃上清, 重复该操作 2 次 最后, 加入含 20% 乙醇的 1XPBS, 使总体积等于初始磁珠悬浮液的体积, 保存于 2-8 3.4 SDS-PAGE 检测将使用纯化产品得到的样品以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果 4 / 5 常州天地人和生物科技有限公司
4. 订购信息及相关产品名称 货号 规格 Ni IDA Magarose Beads SM00101 SM00105 SM001C Ni NTA Magarose Beads SM00801 SM00805 SM008C Ni Smart Magarose Beads SM02501 SM02505 SM025C 5 / 5 常州天地人和生物科技有限公司