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1 1 第 一 篇 化 学 实 验 基 础 1 化 学 实 验 室 基 本 知 识 1.1 化 学 实 验 的 误 差 与 数 据 处 理 1.2 实 验 室 守 则 实 验 室 守 则 实 验 室 的 工 作 细 则 1.3 实 验 室 安 全 规 则 及 防 护 措 施 实 验 室 安 全 规 则 化 学 危 险 品 储 存 要 求 实 验 室 中 一 些 剧 毒 强 腐 蚀 性 药 品 知 识 安 全 防 护 措 施 1.4 化 学 实 验 室 意 外 事 故 处 理 化 学 灼 伤 处 理 割 伤 和 烫 伤 毒 物 与 毒 气 误 入 口 鼻 内 感 到 不 舒 服 时 和 处 理 触 电 处 理 起 火 处 理 中 毒 1.5 实 验 室 制 气 净 化 和 钢 瓶 取 气 气 体 钢 瓶 的 标 识 气 体 钢 瓶 的 使 用 规 则 气 体 钢 瓶 减 压 阀 的 原 理 与 使 用 方 法 1.6 化 学 实 验 室 三 废 处 理 三 废 处 理 规 章 制 度 实 验 室 三 废 处 理 办 法 2 化 学 实 验 基 本 操 作 2.1 玻 璃 仪 器 的 洗 涤 与 干 燥 分 类 : 按 用 途 : 容 器 类 和 其 他 器 皿 类 洗 液 简 介 ( 简 要 介 绍 配 制 方 法 ) 玻 璃 器 皿 的 洗 涤 方 法 : 玻 璃 器 皿 的 干 燥 2.2 溶 液 的 配 制 试 剂 的 取 用 溶 液 的 配 制

2 酸 碱 标 准 溶 液 的 配 制 和 标 定 常 用 化 学 生 物 试 剂 的 配 制 生 物 化 学 常 用 缓 冲 液 的 配 制 免 疫 细 胞 化 学 常 用 试 剂 配 制 2.3 固 液 分 离 与 加 热 固 液 分 离 的 方 法 加 热 3 仪 器 的 使 用 与 维 护 3.1 电 子 天 平 的 正 确 使 用 与 维 护 电 子 天 平 及 其 分 类 选 购 及 使 用 注 意 事 项 天 平 的 使 用 方 法 与 称 量 电 子 天 平 的 使 用 与 保 养 3.2 常 用 ph 计 的 正 确 使 用 与 维 护 正 确 使 用 与 保 养 电 极 ph 的 正 确 校 准 3.3 移 液 枪 的 使 用 操 作 移 液 器 的 操 作 方 法 移 液 器 的 使 用 注 意 事 项 3.4 恒 温 槽 的 安 装 与 调 节 恒 温 槽 的 组 成 元 件 恒 温 槽 的 安 装 与 调 节 恒 温 技 术 原 理 恒 温 槽 的 使 用 操 作 恒 温 槽 的 灵 敏 度 及 其 测 定 3.5 超 声 波 仪 的 使 用 与 维 护 概 述 超 声 波 仪 的 使 用 须 知 超 声 波 仪 的 清 洗 方 法 清 洗 器 的 使 用 3.6 离 心 机 的 操 作 离 心 机 类 型 操 作 注 意 事 项 离 心 机 常 见 故 障

3 离 心 机 的 维 护 与 保 养 3.7 旋 转 蒸 发 仪 的 使 用 与 维 护 4 光 学 仪 器 的 基 础 知 识 ( 包 括 原 理 及 各 自 的 优 缺 点, 用 途 ) 4.1 傅 立 叶 红 外 光 谱 傅 立 叶 红 外 光 谱 仪 的 基 本 原 理 傅 立 叶 红 外 光 谱 的 发 展 与 应 用 4.2 紫 外 和 可 见 光 光 谱 光 谱 原 理 光 吸 收 定 律 4.3 荧 光 光 度 分 析 荧 光 原 理 荧 光 分 光 光 度 法 的 应 用 4.4 原 子 光 谱 原 理 原 子 吸 收 光 谱 分 析 的 优 点 第 二 篇 生 物 实 验 基 础 1. 生 物 实 验 基 本 知 识 1.1 生 物 实 验 室 工 作 细 则 1.2 实 验 室 动 物 卫 生 防 疫 1.3 生 物 实 验 室 用 仪 器 清 洗 与 清 洁 1.4 生 物 实 验 室 中 意 外 事 故 处 理 2. 生 物 实 验 室 基 本 操 作 2.1 电 泳 操 作 规 程 及 注 意 事 项 ( 蛋 白 质 DNA RNA, 霍 海 玲 协 助 ) 电 泳 操 作 的 基 本 特 点 影 响 电 泳 分 离 的 主 要 因 素 本 实 验 室 电 泳 房 的 注 意 事 项 2.2 常 用 生 物 试 剂 的 保 存 与 配 制 常 用 生 物 试 剂 的 保 存 常 用 生 物 试 剂 的 配 制 2.3 灭 菌 方 法 及 注 意 事 项 物 理 方 法 化 学 方 法 2.4 细 胞 培 养 及 注 意 事 项 2.5 核 酸 的 分 离 与 纯 化 及 注 意 事 项

4 核 酸 的 分 离 与 纯 化 核 酸 纯 化 系 统 程 序 操 作 注 意 事 项 2.6 抗 原 抗 体 反 应 什 么 是 抗 原 抗 体 反 应 抗 原 抗 体 反 应 的 原 理 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点 抗 原 抗 体 反 应 的 影 响 因 素 2.7 蛋 白 质 的 修 饰 氨 基 酸 的 分 类 蛋 白 质 侧 链 基 团 修 饰 反 应 2.8 PR 技 术 PR 技 术 的 基 本 原 理 PR 反 应 体 系 与 反 应 条 件 PR 反 应 操 作 步 骤 PR 反 应 特 点 注 意 事 项 2.9 细 胞 总 RNA 提 取 2.10 基 因 组 DNA 的 提 取 DNA 提 取 的 几 种 方 法 从 动 物 组 织 提 取 基 因 组 DNA 细 菌 基 因 组 DNA 的 制 备

5 5 第 一 篇 化 学 实 验 基 础 1. 化 学 实 验 室 基 本 知 识 1.1 化 学 实 验 的 误 差 与 数 据 处 理 误 差 与 有 效 数 字 1 真 值 (μ) 客 观 存 在, 但 是 μ 不 可 能 通 过 测 量 得 到, 因 为 任 何 测 量 都 不 可 避 免 地 存 在 着 误 差, 即 使 在 同 一 条 件 下 对 同 一 对 象 进 行 多 次 重 复 测 量 ( 平 行 测 量 ) 也 不 能 够 得 到 完 全 一 致 的 结 果 平 均 值 也 只 是 μ 的 近 似 值 2 数 据 的 准 确 度 : 用 误 差 表 RE = E x μ 100 % RE = 100 % μ μ 示, 反 映 的 是 单 次 测 量 值 与 真 实 值 的 符 合 程 度 绝 对 误 差 (E) E = x μ 相 对 误 差 (RE) 根 据 误 差 的 性 质 和 来 源, 误 差 分 为 三 类 : 系 统 误 差 : 系 统 误 差 可 以 消 除 或 校 正 ; 过 失 误 差 : 过 失 应 当 避 免 随 机 误 差 : 随 机 误 差 是 不 可 避 免 的, 增 加 平 行 测 量 次 数 取 平 均 值 表 示 结 果 可 减 小 随 机 误 差 3 数 据 的 精 密 度 : 用 偏 差 表 示 指 在 确 定 条 件 下, 反 复 多 次 测 量, 所 得 结 果 的 一 致 性 和 程 度 平 行 测 量 n 次, x1, x2, x3,, xn ( 绝 对 ) 偏 差 : 单 次 测 量 值 xi 与 测 定 平 均 值 之 间 的 差 平 均 偏 差 : 表 一 组 数 的 分 散 程 度 d = 2 标 准 ( 偏 ) 差 : ( x i x ) S = n 1 d n i d i = x i x S RSD = 100% 相 对 标 准 差 : x 4 数 据 的 可 靠 性 用 精 密 度 和 准 确 度 来 表 达 精 密 度 是 保 证 准 确 度 的 前 提, 但 是 高 的 精 密 度 不 一 定 能 保 证 高 的 准 确 度, 因 为 可 能 存 在 系 统 误 差 A B D 5 有 效 数 字 和 测 量 ( 及 结 果 计 算 ) 有 关, 自 然 存 在 准 确 度 的 问 题 有 效 数 字 就 是 实 际 测 得 的 数 字, 其

6 6 位 数 保 留 的 原 则 在 仪 器 最 小 刻 度 后 再 估 读 一 位 即 末 位 是 估 计 值, 余 各 位 都 是 准 确 的 有 效 数 字 的 位 数 反 映 了 测 量 ( 及 结 果 ) 的 准 确 度, 不 可 随 意 增 加 或 减 少 实 验 中 所 测 得 的 数 据, 因 测 量 的 精 度 不 同, 而 导 致 其 有 效 数 字 的 位 数 也 可 能 不 同 6 如 果 结 果 是 经 过 一 系 列 测 量, 再 按 一 定 的 公 式 计 算 出 来 的 间 接 测 量 结 果, 各 测 量 值 的 误 差 必 将 传 递 到 最 后 结 果 中 误 差 的 传 递 大 误 差 环 节 对 结 果 准 确 度 的 影 响 有 举 足 轻 重 的 作 用 因 此, 对 于 有 效 数 字 位 数 较 多 ( 误 差 较 小 ) 的 测 量 值, 应 将 多 余 的 数 字 舍 弃 有 效 数 字 的 修 约 有 效 数 字 的 运 算 1. 加 减 法 : 几 个 数 的 和 ( 差 ) 的 有 效 数 字 取 决 于 其 中 绝 对 误 差 最 大 者 先 以 小 数 点 后 位 数 最 少 的 数 据 为 基 准, 将 其 他 数 据 进 行 修 约 先 计 算 后 修 约 ) 先 修 约 后 计 算 通 常 采 用 的 方 法 是 安 全 数 字, 最 后 修 约 到 应 有 的 位 数 ) 先 修 约 到 多 一 位 计 算, 再 修 约 乘 除 法 : 几 个 数 的 积 ( 商 ) 的 有 效 数 字 的 位 数 取 决 于 其 中 相 对 误 差 最 大 者 一 般 以 有 效 数 字 位 数 最 少 的 为 标 准 进 行 修 约 后, 再 乘 除 3. 对 数 运 算 : 十 进 制 对 数 运 算 中, 对 数 尾 数 的 位 数 应 当 与 真 数 的 有 效 数 字 位 数 相 同 ph=4.74 [H+]= [H+]= K= logk=5.26 K= logk=5.255 运 算 时 若 遇 到 常 数 如 π,e 和 手 册 上 查 到 的 常 数 等, 可 按 需 取 适 当 的 数 字 ; 对 些 乘 除 因 子 如 1/2, 及 开 根 号 的 数 字, 识 为 有 效 数 字 无 穷 多, 不 必 进 行 修 约 1.2 实 验 室 守 则 实 验 室 守 则 1. 遵 守 纪 律, 不 迟 到, 不 早 退 保 持 室 内 安 静 2. 在 小 组 学 术 指 导 老 师 统 一 指 导 下 进 行 学 术 研 究 实 验 中 要 认 真 操 作, 仔 细 观 察 各 种

7 7 现 象, 将 实 验 中 的 现 象 和 数 据 如 实 记 在 报 告 本 上 根 据 原 始 记 录, 认 真 地 分 析 问 题, 处 理 数 据, 写 出 实 验 报 告 3. 实 验 过 程 中, 随 时 注 意 保 持 工 作 环 境 ( 实 验 室 和 实 验 桌 面 ) 的 整 洁, 火 柴 纸 张 和 废 品 等 必 须 丢 入 废 物 缸 内 4. 使 用 仪 器 要 小 心 谨 慎, 若 有 损 坏 应 及 时 填 写 仪 器 损 坏 单, 若 不 按 操 作 规 程 致 仪 器 损 坏, 要 折 价 赔 偿, 节 约 用 水 电 5. 使 用 试 剂 药 品 时 :a. 按 量 取 药 ; b. 公 用 试 剂 放 在 指 定 的 位 置, 不 得 擅 自 拿 走, 用 剩 的 药 品 应 还 给 老 师 ; c. 对 于 配 套 使 用 的 仪 器, 如 试 剂 瓶 的 滴 管 磨 口 瓶 塞 滴 定 管 分 液 漏 斗 等 的 塞 子 等, 用 后 应 放 回 原 处, 避 免 混 淆 ; d. 要 遵 守 正 确 的 试 剂 使 用 方 法 6. 实 验 完 毕 后, 将 玻 璃 仪 器 洗 净, 公 用 仪 器 放 回 原 处, 把 实 验 台 和 药 品 架 整 理 干 净, 清 扫 实 验 室 最 后 应 检 查 门 窗 水 电 煤 气 是 否 关 好 实 验 室 工 作 细 则 实 验 室 的 任 何 东 西 都 有 它 最 应 该 放 的 地 方 切 记, 哪 里 拿 的 放 回 哪 里 1. 实 验 室 区 域 划 分 : 实 验 室 分 公 用 区 域 和 个 人 实 验 区 域 个 人 使 用 区 主 要 为 指 定 的 实 验 桌 和 试 剂 架, 指 定 的 坐 位, 指 定 的 4 和 -20 使 用 区, 冷 库 使 用 区 ; 公 用 区 域 包 括 细 胞 室 大 小 摇 床 大 小 离 心 机 PR 仪 称 量 区 HPL 室 动 物 箱 破 菌 机 成 像 系 统 核 酸 电 泳 区 和 蛋 白 质 电 泳 区 灭 菌 室 RNA 实 验 区 冷 库 生 活 区 浴 室 等 所 有 公 用 区 需 要 保 持 清 洁 和 空 闲, 不 能 因 为 个 人 样 品 不 收 拾 而 影 响 别 人 的 正 常 使 用 2. 试 剂 是 实 验 室 的 血 液 任 何 试 剂 接 近 用 完 时, 或 有 特 殊 试 剂 需 求 时, 必 须 先 向 实 验 室 负 责 试 剂 定 购 的 人 员 提 出, 必 要 时 向 实 验 室 负 责 人 商 量 定 购 事 宜 3. 正 确 的 标 签, 是 保 证 实 验 室 正 常 运 转 的 最 低 要 求 标 签 必 须 写 明 4 个 要 素 : 试 剂 名 称 浓 度 ( 及 ph) 人 名 日 期 如 果 高 温 灭 菌 过, 也 请 注 明 严 格 禁 止 使 用 个 人 编 号 只 要 是 使 用 时 间 在 一 天 以 上, 就 要 具 体 写 清 楚 这 4 个 要 素 要 像 小 狗 见 了 电 线 杆 一 样, 多 多 留 下 你 的 标 签 强 烈 建 议 所 使 用 的 试 剂 一 定 要 自 己 配 4. 器 皿 洗 涤 : 个 人 使 用 的 玻 璃 和 塑 料 器 皿, 需 要 各 自 负 责 清 洗 凉 干 玻 璃 器 皿 橱 灭 菌 室 门 仪 器 室 门 要 始 终 保 持 关 闭 状 态 如 果 你 相 信 只 由 你 一 个 人 使 用 的 物 品, 可 以 存 放 在 你 自 己 的 抽 屉 1.3 实 验 室 安 全 规 则 及 防 护 措 施 实 验 室 安 全 规 则 在 进 行 化 学 实 验 时, 需 经 常 使 用 水 电 煤 气, 并 常 碰 到 一 些 有 毒 有 腐 蚀 性 或 者 易 燃 易 爆 的 物 质 不 正 确 和 不 经 心 的 操 作 以 及 忽 视 操 作 中 必 须 注 意 的 事 项 都 能 够 造 成 火 灾 爆 炸

8 8 和 其 它 不 幸 的 事 故 发 生 发 生 事 故 不 仅 危 害 个 人, 还 会 危 害 周 围 同 学, 使 国 家 财 产 受 到 损 失, 影 响 工 作 的 正 常 进 行 因 此, 重 视 安 全 操 作, 熟 悉 一 般 的 安 全 知 识 是 非 常 必 要 的 我 们 必 须 从 思 想 上 重 视 安 全, 决 不 要 麻 痹 大 意, 但 也 不 能 盲 目 害 怕 而 缩 手 缩 脚, 不 敢 大 胆 做 实 验 为 了 保 证 实 验 的 顺 利 进 行, 必 须 熟 悉 和 注 意 以 下 安 全 规 则 : 1 必 须 熟 悉 实 验 室 及 其 周 围 环 境 和 水 电 煤 气 灭 火 器 的 位 置 ; 不 要 用 湿 手 湿 物 接 触 电 源, 水 电 气 用 完 毕 后 立 即 关 闭 2 一 切 有 毒 的 恶 臭 气 体 的 实 验, 都 应 在 通 风 橱 内 进 行 ; 嗅 闻 气 体 时, 应 用 手 轻 拂 气 体, 把 掌 少 量 的 气 体 扇 向 自 己 再 闻 4 具 有 易 挥 发 和 易 燃 物 质 ( 如 酒 精 丙 酮 乙 醚 ) 易 爆 物 质 ( 如 氯 酸 钾 ) 的 实 验, 应 在 远 离 火 源 的 地 方 进 行, 用 完 后 应 及 时 将 易 燃 易 爆 物 加 盖 存 放 阴 凉 的 地 方 操 作 易 燃 物 质 时, 加 热 应 在 水 浴 中 进 行 5 为 了 防 止 药 品 腐 蚀 皮 肤 和 进 入 体 内, 不 能 用 手 直 接 拿 取 物 品, 要 用 药 勺 或 指 定 的 容 器 取 用 取 用 一 些 强 腐 蚀 性 的 药 品, 如 氢 氟 酸, 溴 水 等, 或 有 毒 试 剂 ( 如 氰 化 物 汞 盐 钡 盐 铅 盐 重 铬 酸 钾 砷 的 化 合 物 等 ), 必 须 戴 上 橡 皮 手 套 决 不 允 许 用 舌 头 尝 药 品 的 味 道 6 洗 液 浓 酸 浓 碱 具 有 强 腐 蚀 性, 应 避 免 溅 落 在 皮 肤 衣 服 书 本 上, 更 应 防 止 溅 入 眼 睛 内 实 验 用 过 的 废 液 应 倒 入 指 定 的 废 液 缸 中 7 禁 止 任 意 混 合 各 种 试 剂 药 品, 以 免 发 生 意 外 事 故 8 经 常 检 查 煤 气 开 关 和 用 气 系, 如 时 有 泄 漏, 应 立 即 熄 灭 室 内 火 源, 打 开 门 窗, 用 肥 皂 水 查 漏, 若 估 计 一 时 难 以 查 出, 应 关 闭 煤 气 总 阀, 立 即 报 告 老 师 9 实 验 室 内 严 禁 吸 烟 饮 食, 或 把 食 具 带 进 实 验 室 实 验 完 毕, 必 须 洗 净 双 手 10 禁 止 穿 拖 鞋 高 跟 鞋 背 心 短 裤 ( 裙 ) 进 入 实 验 室 化 学 危 险 品 储 存 要 求 1. 化 学 危 险 品 应 当 分 类 分 项 存 放, 相 互 之 间 保 持 安 全 距 离 ; 2. 遇 火 遇 潮 容 易 燃 烧 爆 炸 或 产 生 有 毒 气 体 的 化 学 危 险 品, 不 得 在 露 天 潮 湿 漏 雨 和 低 洼 容 易 积 水 的 地 点 存 放 ; 3. 受 阳 光 照 射 易 燃 烧 易 爆 炸 或 产 生 有 毒 气 体 的 化 学 危 险 品 和 桶 装 罐 装 等 易 燃 液 体 气 体 应 当 在 阴 凉 通 风 地 点 存 放 ; 4. 化 学 性 质 防 护 和 灭 火 方 法 相 互 抵 触 的 化 学 危 险 品, 不 得 在 同 一 仓 库 或 同 一 储 存 室 内 存 放 ; 5. 存 放 剧 毒 物 品 的 部 门 必 须 备 有 保 险 箱, 存 放 剧 毒 物 品 的 保 险 箱 钥 匙 应 安 全 保 存 ; 6. 化 学 危 险 品 的 存 放 区 域 应 设 置 醒 目 的 安 全 标 志 实 验 室 中 一 些 剧 毒 强 腐 蚀 性 药 品 知 识 化 学 危 险 物 品, 是 指 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 常 用 危 险 化 学 物 品 的 分 类

9 9 及 标 志 中 所 列 的 爆 炸 品 压 缩 气 体 和 液 化 气 体 易 燃 液 体 易 燃 固 体 自 燃 物 品 和 遇 湿 易 燃 物 品 氧 化 剂 和 有 机 过 氧 化 物 有 毒 品 和 腐 蚀 品 七 大 类 物 品 化 学 危 险 品 从 其 生 产 购 买 运 输 和 使 用 都 有 其 特 殊 地 要 求 1. 氰 化 物 和 氢 氰 酸 氰 化 钾 氰 化 钠 丙 烯 腈 等, 系 烈 性 毒 品, 进 入 人 体 50 毫 克 即 可 致 死, 与 皮 肤 接 触 经 伤 口 进 入 人 体, 即 可 引 起 严 重 中 毒 这 些 氰 化 物 遇 酸 产 生 氢 氰 酸 气 体, 易 被 吸 入 人 体 而 中 毒 在 使 用 氰 化 物 时, 严 禁 用 手 接 触 大 量 使 用 这 类 药 品 时, 应 带 上 口 罩 和 橡 皮 手 套 含 有 氰 化 物 的 废 液, 严 禁 倒 入 酸 缸, 应 先 加 入 硫 酸 亚 铁 使 之 转 变 为 毒 性 较 小 的 亚 铁 氰 化 物, 然 后 倒 入 水 槽, 再 用 大 量 水 冲 洗 贮 放 该 器 皿 和 水 槽 2. 汞 和 汞 的 化 合 物 汞 的 可 溶 性 化 合 物 如 氯 化 汞, 硝 酸 汞 都 是 剧 毒 物 品 实 验 中 应 特 别 注 意 金 属 汞 ( 如 使 用 温 度 计 压 力 计 汞 电 极 等 ) 使 用, 因 金 属 汞 易 蒸 发, 蒸 气 剧 毒, 又 无 气 味, 吸 入 人 体 具 有 积 累 性, 容 易 引 起 慢 性 中 毒, 所 以 切 不 可 麻 痹 大 意 汞 的 比 重 很 大 ( 约 为 水 的 13.6 倍 ), 作 压 力 计 时, 应 用 厚 玻 璃 管, 贮 汞 容 器 必 须 坚 固, 且 应 用 厚 壁 的, 并 且 只 应 存 放 少 量 汞 而 不 能 盛 满, 以 免 容 器 破 裂 或 脱 底 而 使 汞 流 失 在 装 置 汞 的 仪 器 下 面 应 放 一 搪 瓷 盘, 以 免 不 慎 将 汞 洒 在 地 上 为 减 少 室 内 的 汞 蒸 汽, 贮 汞 容 器 应 是 紧 密 封 闭, 汞 表 面 加 水 复 盖, 以 防 蒸 汽 逸 出 3. 砷 的 化 合 物 砷 和 砷 的 化 合 物 都 有 剧 毒, 常 使 用 的 是 三 氧 化 二 砷 ( 砒 霜 ) 和 亚 砷 酸 钠 这 类 物 质 的 中 毒 一 般 由 于 口 服 引 起 当 用 盐 酸 和 粗 锌 作 用 制 备 氢 气 时, 也 会 产 生 一 些 剧 毒 的 砷 化 氢 气 体, 应 加 以 注 意 一 般 将 产 生 的 氢 气 经 过 高 锰 酸 钾 洗 涤 后 再 使 用 砷 的 解 毒 剂 是 二 巯 基 丙 醇, 由 肌 肉 注 射 即 可 解 毒 4. 硫 化 氢 硫 化 氢 是 极 毒 的 气 体, 有 臭 鸡 蛋 味, 它 能 麻 痹 人 的 嗅 觉, 以 致 不 闻 其 臭, 所 以 特 别 危 险 使 用 硫 化 氢 或 者 由 酸 与 硫 化 物 反 应 时, 应 在 通 风 橱 中 进 行 5. 一 氧 化 碳 煤 气 中 含 有 一 氧 化 碳, 使 用 煤 炉 或 煤 气 时, 一 定 要 提 高 警 惕, 防 止 中 毒 煤 气 中 毒, 轻 者 头 痛 眼 花 恶 心 ; 重 者 昏 迷 对 中 毒 的 人 应 立 即 移 出 中 毒 房 间, 呼 吸 新 鲜 空 气, 进 行 人 工 呼 吸, 保 暖, 及 时 送 医 院 治 疗 5. 有 毒 的 有 机 化 合 物 常 用 的 有 机 化 合 物 有 苯 二 硫 化 碳 硝 基 苯 苯 胺 甲 醇 等, 人 们 常 用 作 溶 剂, 容 易 引 起 中 毒, 特 别 是 慢 性 中 毒, 使 用 时 应 特 别 注 意 和 加 强 防 护 6. 溴 溴 为 棕 色 液 体, 易 蒸 发 成 红 色 蒸 汽, 强 烈 地 刺 激 眼 睛 催 泪, 能 损 伤 眼 睛 气 管 和 肺 触 及 皮 肤, 轻 者 剧 烈 的 灼 痛, 重 者 溃 烂, 长 久 不 愈 使 用 溴 时 应 加 强 防 护, 带 橡 皮 手 套

10 10 7. 氢 氟 酸 氢 氟 酸 与 氟 化 氢 都 具 有 剧 毒 强 腐 蚀 性 灼 伤 肌 体, 轻 者 剧 痛 难 忍 重 者 肌 肉 腐 烂, 透 入 体 内, 如 不 及 时 抢 救, 就 会 造 成 死 亡 因 此 在 使 用 氢 氟 酸 时, 应 特 别 注 意, 操 作 必 须 在 通 风 橱 内 进 行, 并 带 上 橡 皮 手 套 8. 其 它 剧 毒 腐 蚀 性 无 机 物 还 很 多, 如 磷 铍 的 化 合 物, 可 溶 性 钡 盐 铅 盐 浓 硝 酸 碘 蒸 汽 等, 使 用 时 都 应 注 意, 这 里 不 一 一 介 绍 安 全 防 护 措 施 化 学 实 验 室 是 消 防 重 点 单 位, 也 是 容 易 发 生 事 故 的 场 所, 安 全 始 终 是 第 一 位 的 化 学 实 验 中 发 生 事 故 的 原 因, 从 主 观 上 讲 有 两 个 方 面 : 一 是 安 全 意 识 不 强, 一 是 对 化 学 实 验 室 的 情 况 不 了 解 或 知 之 甚 少 所 谓 安 全 主 要 指 三 防, 即 防 止 中 毒, 防 止 爆 炸 和 燃 烧, 防 止 腐 蚀 化 学 灼 烧 烫 伤 和 割 伤 1. 防 毒 大 多 数 化 学 药 品 都 有 不 同 程 度 的 毒 性 有 毒 化 学 药 品 可 通 过 呼 吸 道 消 化 道 和 皮 肤 进 入 人 体 而 发 生 中 毒 现 象 如 HF 侵 入 人 体, 将 会 损 伤 牙 齿 骨 骼 造 血 和 神 经 系 统 ; 烃 醇 醚 等 有 机 物 对 人 体 有 不 同 程 度 的 麻 醉 作 用 ; 三 氧 化 二 砷 氰 化 物 氯 化 高 汞 等 是 剧 毒 品, 吸 入 少 量 会 致 死 防 毒 注 意 事 项 实 验 前 应 了 解 所 用 药 品 的 毒 性 性 能 和 防 护 措 施 ; 使 用 有 毒 气 体 ( 如 H2S, l2, Br2, N2, Hl, HF) 应 在 通 风 橱 中 进 行 操 作 ; 苯 四 氯 化 碳 乙 醚 硝 基 苯 等 蒸 汽 经 常 久 吸 会 使 人 嗅 觉 减 弱, 必 须 高 度 警 惕 ; 有 机 溶 剂 能 穿 过 皮 肤 进 入 人 体, 应 避 免 直 接 与 皮 肤 接 触 ; 剧 毒 药 品 如 汞 盐 镉 盐 铅 盐 等 应 妥 善 保 管 ; 实 验 操 作 要 规 范, 离 开 实 验 室 要 洗 手 2. 防 火 防 止 煤 气 管 煤 气 灯 漏 气, 使 用 煤 气 后 一 定 要 把 阀 门 关 好 ; 乙 醚 酒 精 丙 酮 二 硫 化 碳 苯 等 有 机 溶 剂 易 燃, 实 验 室 不 得 存 放 过 多, 切 不 可 倒 入 下 水 道, 以 免 集 聚 引 起 火 灾 ; 金 属 钠 钾 铝 粉 电 石 黄 磷 以 及 金 属 氢 化 物 要 注 意 使 用 和 存 放, 尤 其 不 宜 与 水 直 接 接 触 ; 万 一 着 火, 应 冷 静 判 断 情 况, 采 取 适 当 措 施 灭 火 ; 可 根 据 不 同 情 况, 选 用 水 沙 泡 沫 2 或 l4 灭 火 器 灭 火 3. 防 爆

11 11 化 学 药 品 的 爆 炸 分 为 支 链 爆 炸 和 热 爆 炸 氢 乙 烯 乙 炔 苯 乙 醇 乙 醚 丙 酮 乙 酸 乙 酯 一 氧 化 碳 水 煤 气 和 氨 气 等 可 燃 性 气 体 与 空 气 混 合 至 爆 炸 极 限, 一 旦 有 一 热 源 诱 发, 极 易 发 生 支 链 爆 炸 ; 过 氧 化 物 高 氯 酸 盐 叠 氮 铅 乙 炔 铜 三 硝 基 甲 苯 等 易 爆 物 质, 受 震 或 受 热 可 能 发 生 热 爆 炸 防 爆 措 施 对 于 防 止 支 链 爆 炸, 主 要 是 防 止 可 燃 性 气 体 或 蒸 气 散 失 在 室 内 空 气 中, 保 持 室 内 通 风 良 好 当 大 量 使 用 可 燃 性 气 体 时, 应 严 禁 使 用 明 火 和 可 能 产 生 电 火 花 的 电 器 ; 对 于 预 防 热 爆 炸, 强 氧 化 剂 和 强 还 原 剂 必 须 分 开 存 放, 使 用 时 轻 拿 轻 放, 远 离 热 源 4. 防 灼 伤 除 了 高 温 以 外, 液 氮 强 酸 强 碱 强 氧 化 剂 溴 磷 钠 钾 苯 酚 醋 酸 等 物 质 都 会 灼 伤 皮 肤 ; 应 注 意 不 要 让 皮 肤 与 之 接 触, 尤 其 防 止 溅 入 眼 中 汞 是 化 学 实 验 室 的 常 用 物 质, 毒 性 很 大, 且 进 入 体 内 不 易 排 出, 形 成 积 累 性 中 毒 ; 高 汞 盐 ( 如 Hgl2) g 可 致 人 死 命 ; 室 温 下 汞 的 蒸 汽 压 为 mmhg 柱, 比 安 全 浓 度 标 准 大 100 倍 安 全 使 用 汞 的 操 作 规 定 : (1) 汞 不 能 直 接 露 于 空 气 中, 其 上 应 加 水 或 其 他 液 体 覆 盖 (2) 任 何 剩 余 量 的 汞 均 不 能 倒 入 下 水 槽 中 ; (3) 储 汞 容 器 必 须 是 结 实 的 厚 壁 器 皿, 且 器 皿 应 放 在 瓷 盘 上 ; (4) 装 汞 的 容 器 应 远 离 热 源 ; (5) 万 一 汞 掉 在 地 上 台 面 或 水 槽 中, 应 尽 可 能 用 吸 管 将 汞 珠 收 集 起 来, 再 用 能 形 成 汞 齐 的 金 属 片 (Zn, u, Sn 等 ) 在 汞 溅 处 多 次 扫 过, 最 后 用 硫 磺 粉 覆 盖 ; (6) 实 验 室 要 通 风 良 好 ; 手 上 有 伤 口, 切 勿 接 触 汞 5. 安 全 用 电 人 身 安 全 防 护 实 验 室 常 用 电 为 频 率 50 Hz, 200 V 的 交 流 电 人 体 通 过 1 ma 的 电 流, 便 有 发 麻 或 针 刺 的 感 觉,10 ma 以 上 人 体 肌 肉 会 强 烈 收 缩,25 ma 以 上 则 呼 吸 困 难, 就 有 生 命 危 险 ; 直 流 电 对 人 体 也 有 类 似 的 危 险 为 防 止 触 电, 应 做 到 : (1) 修 理 或 安 装 电 器 时, 应 先 切 断 电 源 ; (2) 使 用 电 器 时, 手 要 干 燥 (3) 电 源 裸 露 部 分 应 有 绝 缘 装 置, 电 器 外 壳 应 接 地 线 ; (4) 不 能 用 试 电 笔 去 试 高 压 电 ; (5) 不 应 用 双 手 同 时 触 及 电 器, 防 止 触 电 时 电 流 通 过 心 脏 ;

12 12 (6) 一 旦 有 人 触 电, 应 首 先 切 断 电 源, 然 后 抢 救 仪 器 设 备 的 安 全 用 电 一 切 仪 器 应 按 说 明 书 装 接 适 当 的 电 源, 需 要 接 地 的 一 定 要 接 地 ; 若 是 直 流 电 器 设 备, 应 注 意 电 源 的 正 负 极, 不 要 接 错 ; 若 电 源 为 三 相, 则 三 相 电 源 的 中 性 点 要 接 地, 这 样 万 一 触 电 时 可 降 低 接 触 电 压 ; 接 三 相 电 动 机 时 要 注 意 正 转 方 向 是 否 符 合, 否 则, 要 切 断 电 源, 对 调 相 线 ; 接 线 时 应 注 意 接 头 要 牢, 并 根 据 电 器 的 额 定 电 流 选 用 适 当 的 连 接 导 线 ; 接 好 电 路 后 应 仔 细 检 查 无 误 后, 方 可 通 电 使 用 ; 仪 器 发 生 故 障 时 应 及 时 切 断 电 源 使 用 辐 射 源 仪 器 的 安 全 防 护 化 学 实 验 室 的 辐 射, 主 要 是 指 X-ray, 长 期 反 复 接 受 X-ray 照 射, 会 导 致 疲 倦, 记 忆 力 减 退, 头 痛, 白 血 球 降 低 等 防 护 的 方 法 就 是 避 免 身 体 各 部 位 ( 尤 其 是 头 部 ) 直 接 受 到 X-ray 照 射, 操 作 时 需 要 屏 蔽 和 缩 时, 屏 蔽 物 常 用 铅 铅 玻 璃 等 1.4 化 学 实 验 室 意 外 事 故 处 理 化 学 灼 伤 处 理 ⑴ 受 强 酸 的 腐 蚀 : 先 用 大 量 水 冲 洗, 然 后 涂 上 碳 酸 氢 钠 油 膏 如 受 氢 氟 酸 腐 蚀 受 伤, 应 迅 速 用 水 冲 洗, 再 用 稀 苏 打 溶 液 ( 碳 酸 氢 钠 饱 和 溶 液 或 1%~2% 乙 酸 溶 液 ) 冲 洗, 然 后 浸 泡 在 冰 冷 的 饱 和 硫 酸 镁 溶 液 中 半 小 时, 最 后 涂 敷 氧 化 锌 软 膏 ( 或 硼 酸 软 膏 ) 伤 势 严 重 时, 应 立 即 送 医 院 急 救 当 酸 溅 入 眼 睛 时, 首 先 用 大 量 水 冲 洗 眼 睛, 然 后 用 稀 的 碳 酸 氢 钠 溶 液 冲 洗, 最 后 再 用 清 水 洗 眼. ⑵ 受 强 碱 腐 蚀 : 立 即 用 大 量 水 冲 洗, 然 后 用 1% 柠 檬 酸 或 3% 硼 酸 溶 液 冲 洗 当 碱 液 溅 入 眼 睛 时, 先 用 水 冲 洗, 再 用 饱 和 的 硼 酸 溶 液 冲 洗, 最 后 滴 入 蓖 麻 油 ( 然 后 用 蒸 馏 水 冲 洗 ) ⑶ 碱 金 属 氰 化 物 氢 氰 酸 灼 伤 皮 肤 用 高 锰 酸 钾 溶 液 洗, 再 用 硫 化 铵 溶 液 漂 洗, 然 后 用 水 冲 洗 ⑷ 溴 灼 伤 皮 肤, 立 即 用 乙 醇 洗 涤, 然 后 用 水 冲 净, 涂 上 甘 油 或 烫 伤 油 膏 (5) 苯 酚 灼 伤 皮 肤 先 用 大 量 水 冲 洗, 然 后 用 4:1 的 乙 醇 (70%)- 氯 化 铁 (1mol L -1 ) 的 混 合 液 进 行 洗 涤

13 割 伤 和 烫 伤 ⑴ 割 伤 ( 玻 璃 或 铁 器 刺 伤 等 ) 若 伤 口 内 有 异 物, 先 取 出 异 物, 如 轻 伤 可 用 蒸 馏 水 生 理 盐 水 或 硼 酸 液 擦 洗 伤 处, 然 后 涂 上 红 药 水 ( 或 紫 药 水 ), 必 要 时 撒 些 消 炎 粉, 并 用 消 毒 纱 布 包 扎, 或 贴 创 口 贴 ; 伤 势 较 重 时, 则 先 用 酒 精 在 伤 口 周 围 清 洗 消 毒, 再 用 纱 布 按 住 伤 口 压 迫 止 血, 并 立 即 送 往 医 院 ⑵ 烫 伤 立 即 涂 上 烫 伤 膏 ( 可 用 10% 的 KMn4 溶 液 擦 洗 灼 伤 处 ); 若 伤 势 较 重, 撒 上 消 炎 粉 或 烫 伤 药 膏, 用 油 纱 绷 带 包 扎 切 勿 用 冷 水 冲 洗 ; 更 不 能 把 烫 起 的 水 泡 戳 破! 毒 物 与 毒 气 误 入 口 鼻 内 感 到 不 舒 服 时 的 处 理 ⑴ 毒 物 误 入 口 立 即 内 服 5~10ml 稀 us4 温 水 溶 液, 再 用 手 伸 入 咽 喉 促 使 呕 吐 毒 物 ⑵ 刺 激 性 有 毒 气 体 吸 入 误 吸 入 煤 气 等 有 毒 气 体 时, 应 立 即 在 室 外 呼 吸 新 鲜 空 气 ; 误 吸 入 溴 蒸 气 氯 气 等 有 毒 气 体 时, 立 即 吸 入 少 量 酒 精 和 乙 醚 的 混 合 蒸 气, 以 便 解 毒, 同 时 应 到 室 外 呼 吸 新 鲜 空 气 触 电 处 理 触 电 后 应 立 即 拉 下 电 闸, 尽 快 地 用 绝 缘 物 ( 干 燥 的 木 棒 竹 杆 ) 将 触 电 者 与 电 源 隔 离 必 要 时 进 行 人 工 呼 吸 ; 当 发 生 的 事 情 较 严 重 时, 做 了 上 述 急 救 后 速 送 医 院 治 疗 起 火 处 理 一 般 有 机 物, 特 别 是 有 机 溶 剂, 大 都 容 易 着 火, 它 们 的 蒸 气 或 其 他 可 燃 性 气 体 固 体 粉 末 等 ( 如 氢 气 一 氧 化 碳 苯 油 蒸 气 面 粉 ) 与 空 气 按 一 定 比 例 混 合 后, 当 有 火 花 时 ( 点 火 电 火 花 撞 击 火 花 ) 就 会 引 起 燃 烧 或 猛 烈 爆 炸 由 于 某 些 化 学 反 应 放 热 而 引 起 燃 烧, 如 金 属 钠, 钾 等 遇 水 燃 烧 甚 至 爆 炸 有 些 物 品 易 自 燃 ( 如 白 磷 遇 空 气 就 自 行 燃 烧 ), 由 于 保 管 和 使 用 不 善 而 引 起 燃 烧 有 些 化 学 试 剂 相 混 在 一 起, 在 一 定 的 条 件 下 会 引 起 燃 烧 和 爆 炸 ( 如 将 红 磷 与 氯 酸 钾 混 在 一 起, 磷 就 会 燃 烧 爆 炸 ) 万 一 发 生 着 火, 要 沉 着 快 速 处 理, 首 先 要 切 断 热 源 电 源, 把 附 近 的 可 燃 物 品 移 走, 再 针 对 燃 烧 物 的 性 质 采 取 适 当 的 灭 火 措 施 但 不 可 将 燃 烧 物 抱 着 往 外 跑, 因 为 跑 动 时 空 气 更 流 通, 火 会 烧 得 更 猛 常 用 的 灭 火 措 施 有 以 下 几 种, 使 用 时 要 根 据 火 灾 的 轻 重, 燃 烧 物 的 性 质, 周 围 环 境 和 现 有 条 件 进 行 选 择 : (1) 石 棉 布 : 适 用 于 小 火 用 石 棉 布 盖 上 以 隔 绝 空 气, 就 能 灭 火 如 果 火 很 小, 用 湿 抹 布 或 石 棉 板 盖 上 就 行

14 14 (2) 干 沙 土 : 一 般 装 于 砂 箱 或 砂 袋 内, 只 要 抛 洒 在 着 火 物 体 上 就 可 灭 火 适 用 于 不 能 用 水 扑 救 的 燃 烧, 但 对 火 势 很 猛, 面 积 很 大 的 火 焰 欠 佳 砂 土 应 该 用 干 的 (3) 水 : 是 常 用 的 救 火 物 质 它 能 使 燃 烧 物 的 温 度 下 降, 但 一 般 有 机 物 着 火 不 适 用, 因 溶 剂 与 水 不 相 溶, 又 比 水 轻, 水 浇 上 去 后, 溶 剂 还 漂 在 水 面 上, 扩 散 开 来 继 续 燃 烧 但 若 燃 烧 物 与 水 互 溶 时, 或 用 水 没 有 其 他 危 险 时 方 可 用 水 灭 火 在 溶 剂 着 火 时, 先 用 泡 沫 灭 火 器 把 火 扑 灭, 再 用 水 降 温 是 有 效 的 救 火 方 法 (4) 泡 沫 灭 火 器 : 是 实 验 室 常 用 的 灭 火 器 材, 使 用 时, 把 灭 火 器 倒 过 来, 往 火 场 喷 由 于 它 生 成 二 氧 化 碳 及 泡 沫, 使 燃 烧 物 与 空 气 隔 绝 而 灭 火, 效 果 较 好, 适 用 于 除 电 流 起 火 外 的 灭 火 (5) 二 氧 化 碳 灭 火 器 : 在 小 钢 瓶 中 装 入 液 态 二 氧 化 碳, 救 火 时 打 开 阀 门, 把 喇 叭 口 对 准 火 场, 喷 射 出 二 氧 化 碳 以 灭 火, 在 工 厂 和 实 验 室 都 很 适 用, 它 不 损 坏 仪 器, 不 留 残 渣, 对 于 通 电 的 仪 器 也 可 使 用, 但 金 属 镁 燃 烧 不 可 使 用 它 来 灭 火 (6) 四 氯 化 碳 灭 火 器 : 四 氯 化 碳 沸 点 较 低, 喷 出 来 后 形 成 沉 重 而 惰 性 的 蒸 气 掩 盖 在 燃 烧 物 体 周 围, 使 它 与 空 气 隔 绝 而 灭 火 它 不 导 电, 适 于 扑 灭 带 电 物 体 的 火 灾 但 它 在 高 温 时 分 解 出 有 毒 气 体, 故 在 不 通 风 的 地 方 最 好 不 用 另 外, 在 有 钠 钾 等 金 属 存 在 时 不 能 使 用, 因 为 有 引 起 爆 炸 的 危 险 除 了 以 上 几 种 常 用 的 灭 火 器 外, 近 年 来 生 产 了 多 种 新 型 的 高 效 能 的 灭 火 器 如 1211 灭 火 器, 它 在 钢 瓶 内 装 有 一 种 药 剂 二 氟 一 氯 溴 甲 烷, 灭 火 效 率 很 高 又 如 干 粉 灭 火 器 是 将 二 氧 化 碳 和 一 种 干 粉 剂 配 合 起 来 使 用, 灭 火 速 度 很 快 (7) 水 蒸 气 : 在 有 水 蒸 气 的 地 方 把 水 蒸 气 对 火 场 喷, 也 能 隔 绝 空 气 而 起 灭 火 作 用 (8) 石 墨 粉 : 当 钾 钠 或 锂 着 火 时, 不 能 用 水 泡 沫 灭 火 器 二 氧 化 碳 四 氯 化 碳 等 灭 火, 可 用 石 墨 粉 扑 灭 (9) 电 路 或 电 器 着 火 时, 扑 救 的 关 键 首 先 要 切 断 电 源, 防 止 事 态 扩 大 电 器 着 火 的 最 好 灭 火 器 是 四 氯 化 碳 和 二 氧 化 碳 灭 火 器 在 着 火 和 救 火 时, 若 衣 服 着 火, 千 万 不 要 乱 跑, 因 为 这 会 由 于 空 气 的 迅 速 流 动 而 加 剧 燃 烧, 应 当 躺 在 地 下 滚 动, 这 样 一 中 毒 生 化 实 验 室 常 见 的 化 学 致 癌 物 有 : 石 棉 砷 化 物 铬 酸 盐 溴 乙 锭 等 剧 毒 物 有 : 氰 化 物 砷 化 物 乙 腈 甲 醇 氯 化 氢 汞 及 其 化 合 物 等 中 毒 的 原 因 主 要 是 由 于 不 慎 吸 入 误 食 或 由 皮 肤 渗 入 中 毒 的 预 防 : 1 保 护 好 眼 睛 最 重 要, 使 用 有 毒 或 有 刺 激 性 气 体 时, 必 须 配 戴 防 护 眼 镜, 并 应 在 通 风 橱 内 进 行 ; 2 取 用 毒 品 时 必 须 配 戴 橡 皮 手 套 ; 3 严 禁 用 嘴 吸 移 液 管, 严 禁 在 实 验 室 内 饮 水 进 食 吸 烟, 禁 止 赤 膊 和 穿 拖 鞋 ;

15 15 4 不 要 用 乙 醇 等 有 机 溶 剂 擦 洗 溅 洒 在 皮 肤 上 的 药 品 中 毒 急 救 的 方 法 主 要 有 : 1 误 食 了 酸 或 碱, 不 要 催 吐, 可 先 立 即 大 量 饮 水, 误 食 碱 者 再 喝 些 牛 奶, 误 食 酸 者, 饮 水 后 再 服 Mg(H)2 乳 剂, 最 后 饮 些 牛 奶 ; 2 吸 入 了 毒 气, 立 即 转 移 室 外, 解 开 衣 领, 休 克 者 应 施 以 人 工 呼 吸, 但 不 要 用 口 对 口 法 ; 3 砷 和 汞 中 毒 者 应 立 即 送 医 院 急 救 1.5 实 验 室 钢 瓶 取 气 操 作 气 体 钢 瓶 的 标 识 化 学 实 验 常 用 到 高 压 储 气 钢 瓶 和 一 般 受 压 的 玻 璃 仪 器, 使 用 不 当, 会 导 致 爆 炸, 需 掌 握 有 关 常 识 和 操 作 规 程 气 体 钢 瓶 的 识 别 ( 颜 色 相 同 的 要 看 气 体 名 称 ) 氧 气 瓶 天 蓝 色 ; 氢 气 瓶 深 绿 色 ; 氮 气 瓶 黑 色 ; 纯 氩 气 瓶 灰 色 ; 氦 气 瓶 棕 色 ; 压 缩 空 气 黑 色 ; 氨 气 瓶 黄 色 ; 二 氧 化 碳 气 瓶 黑 色 气 体 钢 瓶 的 使 用 规 则 高 压 气 瓶 的 安 全 使 用 气 瓶 应 专 瓶 专 用, 不 能 随 意 改 装 ; 气 瓶 应 存 放 在 阴 凉 干 燥 远 离 热 源 的 地 方, 易 燃 气 体 气 瓶 与 明 火 距 离 不 小 于 5 米 ; 氢 气 瓶 最 好 隔 离 ; 气 瓶 搬 运 要 轻 要 稳, 放 置 要 牢 靠 ; 各 种 气 压 表 一 般 不 得 混 用 ; 氧 气 瓶 严 禁 油 污, 注 意 手 扳 手 或 衣 服 上 的 油 污 ; 气 瓶 内 气 体 不 可 用 尽, 以 防 倒 灌 ; 开 启 气 门 时 应 站 在 气 压 表 的 一 侧, 不 准 将 头 或 身 体 对 准 气 瓶 总 阀, 以 防 万 一 阀 门 或 气 压 表 冲 出 伤 人 气 体 钢 瓶 减 压 阀 的 原 理 与 使 用 方 法 在 物 理 化 学 实 验 中, 经 常 要 用 到 氧 气 氮 气 氢 气 氩 气 等 气 体 这 些 气 体 一 般 都 是 贮 存 在 专 用 的 高 压 气 体 钢 瓶 中 使 用 时 通 过 减 压 阀 使 气 体 压 力 降 至 实 验 所 需 范 围, 再 经 过 其 它 控 制 阀 门 细 调, 使 气 体 输 入 使 用 系 统 最 常 用 的 减 压 阀 为 氧 气 减 压 阀, 简 称 氧 气 表

16 16 1. 氧 气 减 压 阀 的 工 作 原 理 氧 气 减 压 阀 的 外 观 ( 见 图 和 1-5-2) 及 工 作 原 理 YL-20 系 列 抗 腐 蚀 双 级 钢 瓶 减 压 阀 YL-3 系 列 高 压 经 济 型 铜 钢 瓶 减 压 阀 氧 气 减 压 阀 的 高 压 腔 与 钢 瓶 连 接, 低 压 腔 为 气 体 出 口, 并 通 往 使 用 系 统 高 压 表 的 示 值 为 钢 瓶 内 贮 存 气 体 的 压 力 低 压 表 的 出 口 压 力 可 由 调 节 螺 杆 控 制 使 用 时 先 打 开 钢 瓶 总 开 关, 然 后 顺 时 针 转 动 低 压 表 压 力 调 节 螺 杆, 使 其 压 缩 主 弹 簧 并 传 动 薄 膜 弹 簧 垫 块 和 顶 杆 而 将 活 门 打 开 这 样 进 口 的 高 压 气 体 由 高 压 室 经 节 流 减 压 后 进 入 低 压 室, 并 经 出 口 通 往 工 作 系 统 转 动 调 节 螺 杆, 改 变 活 门 开 启 的 高 度, 从 而 调 节 高 压 气 体 的 通 过 量 并 达 到 所 需 的 压 力 值 减 压 阀 都 装 有 安 全 阀 它 是 保 护 减 压 阀 并 使 之 安 全 使 用 的 装 置, 也 是 减 压 阀 出 现 故 障 的 信 号 装 置 如 果 由 于 活 门 垫 活 门 损 坏 或 由 于 其 它 原 因, 导 致 出 口 压 力 自 行 上 升 并 超 过 一 定 许 可 值 时, 安 全 阀 会 自 动 打 开 排 气 2. 氧 气 减 压 阀 的 使 用 方 法 (1) 按 使 用 要 求 的 不 同, 氧 气 减 压 阀 有 许 多 规 格 最 高 进 口 压 力 大 多 为, 最 低 进 口 压 力 不 小 于 出 口 压 力 的 2.5 倍 出 口 压 力 规 格 较 多, 一 般 为, 最 高 出 口 压 力 为 (2) 安 装 减 压 阀 时 应 确 定 其 连 接 规 格 是 否 与 钢 瓶 和 使 用 系 统 的 接 头 相 一 致 减 压 阀 与 钢 瓶 采 用 半 球 面 连 接, 靠 旋 紧 螺 母 使 二 者 完 全 吻 合 因 此, 在 使 用 时 应 保 持 两 个 半 球 面 的 光 洁, 以 确 保 良 好 的 气 密 效 果 安 装 前 可 用 高 压 气 体 吹 除 灰 尘 必 要 时 也 可 用 聚 四 氟 乙 烯 等 材 料 作 垫 圈 (3) 氧 气 减 压 阀 应 严 禁 接 触 油 脂, 以 免 发 生 火 警 事 故 (4) 停 止 工 作 时, 应 将 减 压 阀 中 余 气 放 净, 然 后 拧 松 调 节 螺 杆 以 免 弹 性 元 件 长 久 受 压 变 形 (5) 减 压 阀 应 避 免 撞 击 振 动, 不 可 与 腐 蚀 性 物 质 相 接 触 3. 其 它 气 体 减 压 阀 有 些 气 体, 例 如 氮 气 空 气 氩 气 等 永 久 性 气 体, 可 以 采 用 氧 气 减 压 阀 但 还 有 一 些 气 体, 如 氨 等 腐 蚀 性 气 体, 则 需 要 专 用 减 压 阀 市 面 上 常 见 的 有 氮 气 空 气 氢 气 氨 乙 炔

17 17 丙 烷 水 蒸 气 等 专 用 减 压 阀 这 些 减 压 阀 的 使 用 方 法 及 注 意 事 项 与 氧 气 减 压 阀 基 本 相 同 但 是, 还 应 该 指 出 : 专 用 减 压 阀 一 般 不 用 于 其 它 气 体 为 了 防 止 误 用, 有 些 专 用 减 压 阀 与 钢 瓶 之 间 采 用 特 殊 连 接 口 例 如 氢 气 和 丙 烷 均 采 用 左 牙 螺 纹, 也 称 反 向 螺 纹, 安 装 时 应 特 别 注 意 1.6 化 学 实 验 室 三 废 处 理 规 章 制 度 1. 化 学 实 验 室 大 多 数 废 气 废 液 废 渣 都 是 有 毒 物 质, 其 中 还 有 些 是 剧 毒 物 质 和 致 癌 物 质, 如 果 直 接 排 放, 就 会 污 染 环 境, 损 害 人 体 健 康 所 以 必 须 经 过 适 当 的 处 理 后 才 能 排 放 2. 少 量 有 毒 气 体 可 通 过 排 风 设 备 排 出 室 外, 被 空 气 稀 释 毒 气 量 大 时 必 须 经 过 吸 收 处 理, 然 后 才 能 排 出 3. 可 燃 性 有 机 毒 物 可 于 燃 烧 炉 中 供 给 充 分 的 氧 气 使 其 完 全 燃 烧, 生 成 二 氧 化 碳 和 水 对 于 较 纯 的 有 机 溶 剂 ( 含 有 少 量 其 它 试 剂 和 被 测 物 ) 应 回 收 利 用 4. 有 毒 致 癌 废 液 不 能 直 接 排 入 下 水 道, 要 经 过 处 理, 降 低 毒 性 后, 方 可 稀 释 排 出 5. 有 毒 固 体 废 物 不 能 直 接 倒 入 垃 圾 桶, 要 经 过 处 理 后 方 能 排 出 6. 做 完 实 验 后 应 将 所 有 的 废 物 收 回 废 物 桶, 经 适 当 的 处 理 后 方 可 排 出 实 验 室 三 废 处 理 办 法 1. 常 用 的 废 气 处 理 办 法 (1) 有 废 气 产 生 的 实 验 要 开 启 通 风 装 置 后 才 能 进 行 (2) 有 特 殊 要 求 的 实 验 项 目 要 在 通 风 橱 中 进 行 (3) 放 射 性 废 气 排 放 时 应 确 保 不 污 染 周 围 空 气, 否 则 应 做 净 化 处 理 溶 液 吸 收 法 : 常 用 的 液 体 吸 收 剂 有 : 水 碱 性 溶 液 酸 性 溶 液 氧 化 剂 溶 液 和 有 机 溶 液 ; 可 用 于 净 化 S2 NX HF Si4 Hl l2 NH3 汞 蒸 汽 酸 雾 沥 青 烟 和 各 种 组 分 有 机 物 蒸 汽 的 废 气 固 体 吸 收 法 : 主 要 用 于 净 化 废 气 中 低 浓 度 的 污 染 物 2. 常 用 的 废 液 处 理 办 法 (1) 中 和 法 酸 含 量 小 于 3%~5% 的 酸 性 废 水 碱 含 量 小 于 1%~3% 的 碱 性 废 液, 按 其 化 学 性 质, 分 别 进 行 中 和 后 处 理 无 硫 化 物 酸 性 废 水, 用 浓 度 相 当 的 碱 性 废 水 中 和 ; 含 重 金 属 的 酸 性 废 水, 可 通 过 加 入 碱 性 试 剂 如 NaH Na23 进 行 中 和 (2) 萃 取 法 采 用 与 水 不 互 溶 但 能 良 好 溶 解 污 染 物 的 萃 取 剂, 使 其 与 废 水 充 分 混 合, 提 取 污 染 物, 达 到 净 化 废 水 的 目 的 例 如 : 含 酚 废 水 就 可 采 用 二 甲 苯 做 萃 取 剂 (3) 化 学 沉 淀 法 可 用 氢 氧 化 物 沉 淀 法 处 理 含 重 金 属 离 子 的 废 水 ; 用 含 硫 化 物 的 沉 淀 剂

18 18 除 汞 砷 ; 用 Ba3 或 Bal2 沉 淀 法 去 除 废 水 中 的 r 等 (4) 氧 化 还 原 法 常 用 氧 化 剂 主 要 是 : 漂 白 粉, 用 于 含 氮 废 水 含 硫 废 水 含 酚 废 水 及 仿 氨 氮 废 水 的 处 理 ; 常 用 的 还 原 剂 有 :FeS4 或 Na2S3, 用 于 还 原 6 价 铬 ; 铁 屑 铜 屑 锌 粒 等 用 于 除 支 良 水 中 的 汞 等 (2) 有 机 等 废 液 集 中 后, 进 行 回 收 转 化 燃 烧 等 处 理 (3) 放 射 性 废 液 采 用 放 置 法 稀 释 法 等 处 理, 达 到 排 放 标 准 时 才 能 排 放 (4) 尽 量 不 使 用 或 少 使 用 含 有 重 金 属 的 化 学 试 剂 进 行 实 验 3. 常 用 的 废 渣 处 理 办 法 (1) 无 毒 废 物 按 垃 圾 处 理 (2) 能 够 自 然 降 解 的 有 毒 废 物, 集 中 深 埋 处 理 (3) 不 能 自 然 降 解 的 有 毒 废 物, 集 中 到 焚 化 炉 焚 烧 处 理 (4) 放 射 性 固 体 废 物, 先 集 中 在 专 用 的 废 物 桶 内, 再 根 据 具 体 情 况 采 用 放 置 焚 化 等 方 法 处 理 2 化 学 实 验 基 本 操 作 2.1 玻 璃 仪 器 的 洗 涤 与 干 燥 对 不 同 的 污 染 物 性 质 和 沾 污 程 度 选 择 不 同 的 海 浪 和 洗 涤 方 法, 不 同 的 性 质 食 品 选 择 不 同 的 干 燥 方 法 分 类 按 用 途 : 容 器 类 和 其 他 器 皿 类 按 能 否 受 势 : 可 加 热 和 不 宜 加 热 两 类 ; 量 器 类 是 不 能 受 热 的, 不 能 量 取 热 的 液 体 可 受 热 : 烧 杯 锥 形 瓶 试 管 烧 瓶 类 不 可 受 热 : 量 器 类, 如 量 筒 量 杯 移 液 管 滴 定 管 等 漏 斗 砂 钵 等

19 洗 液 简 介 1. 铬 酸 洗 液 浓 H2S4+K2r27 是 暗 红 色, 强 氧 化 性, 对 有 机 物 和 油 污 的 去 污 能 力 特 别 强 铬 有 致 癌 作 用, 因 此 配 制 和 使 用 洗 液 时 要 极 为 小 心, 常 用 两 种 配 制 方 法 如 下 : (1) 取 100mL 工 业 浓 硫 酸 置 于 烧 杯 内, 小 心 加 热, 然 后 慢 慢 加 入 5g 重 铬 酸 钾 粉 末, 边 加 边 搅 拌, 待 全 部 溶 解 并 缓 慢 冷 却 后, 贮 存 在 磨 口 玻 璃 塞 的 细 口 瓶 内 (2) 称 取 5g 重 铬 酸 钾 粉 末, 置 于 250mL 烧 杯 中, 加 5mL 水 使 其 溶 解, 然 后 慢 慢 加 入 100mL 浓 硫 酸, 溶 液 温 度 将 达 80, 待 其 冷 却 后 贮 存 于 磨 口 玻 璃 瓶 内 注 :1 加 样 顺 序 不 能 错 ;2 可 反 复 使 用 ;3 易 吸 潮, 随 时 盖 紧 瓶 塞 ;4 洗 液 变 成 绿 色 时 表 示 已 失 效 如 不 慎 洒 在 皮 肤 衣 服 或 实 验 台 上, 应 立 即 用 水 冲 洗 再 生 : 将 洗 液 在 120 左 右 浓 缩, 冷 却 至 室 温 后 以 1L 浓 缩 液 加 10g 的 KMN4 粉 末 的 比 例, 边 加 边 搅 拌 至 微 紫 色 炎 止, 然 后 加 热 至 有 S3 出 现, 停 止 加 热, 停 加 热, 稍 冷 后 用 下 班 砂 漏 斗 过 滤, 滤 液 冷 却 后 析 出 约 色 R3 沉 淀, 加 入 适 量 的 浓 H2S4, 使 r3 溶 解, 得 可 继 续 使 用 洗 液 2. 碱 性 高 锰 酸 钾 洗 液 4g KMn7 溶 于 水 中, 慢 慢 加 入 100ml,10%NaH 溶 液 3. 酸 性 草 酸 洗 涤 液 10g 草 酸 溶 于 100ml20% 的 HL 溶 液 4. 其 他 洗 涤 液 (1) 工 业 浓 盐 酸 : 可 洗 去 水 垢 或 某 些 无 机 盐 沉 淀 (2)5% 草 酸 溶 液 : 用 数 滴 硫 酸 酸 化, 可 洗 去 高 锰 酸 钾 的 痕 迹 (3)5%~10% 磷 酸 三 钠 (Na3P4 12H2) 溶 液 : 可 洗 涤 油 污 物 (4)30% 硝 酸 溶 液 : 洗 涤 二 氧 化 碳 测 定 仪 及 微 量 滴 管 (5)5%~10% 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (EDTA-Na2) 溶 液 : 加 热 煮 沸 可 洗 脱 玻 璃 仪 器 内 壁 的 白 色 沉 淀 物 (6) 尿 素 洗 涤 液 : 为 蛋 白 质 的 良 好 溶 剂, 适 用 于 洗 涤 盛 过 蛋 白 质 制 剂 及 血 样 的 容 器 (7) 有 机 溶 剂 : 如 丙 酮 乙 醚 乙 醇 等 可 用 于 洗 脱 油 脂 脂 溶 性 染 料 污 痕 等, 二 甲 苯 可 洗 脱 油 漆 的 污 垢 (8) 氢 氧 化 钾 的 乙 醇 溶 液 和 含 有 高 锰 酸 钾 的 氢 氧 化 钠 溶 液 : 这 是 两 种 强 碱 性 的 洗 涤 液, 对 玻 璃 仪 器 的 侵 蚀 性 很 强, 可 清 除 容 器 内 壁 污 垢, 洗 涤 时 间 不 宜 过 长, 使 用 时 应 小 心 慎 重 玻 璃 器 皿 的 洗 涤 方 法 (1) 刷 洗 : 尘 土, 不 溶 性 物 质 和 不 可 溶 性 物 质

20 20 残 留 Na2S4 NaHS4 加 热 溶 解 后 ( 或 用 沸 水 使 其 溶 解 ) 趁 热 倒 掉 (2) 用 去 污 粉 或 肥 皂, 合 成 洗 涤 剂 刷 洗 油 垢, 有 机 物 质, 不 溶 于 水 的 污 物 (3) 用 洗 液 洗 地 埚 称 量 瓶 洗 瓶 容 量 瓶 移 液 管 滴 定 管 等 宜 用 洗 液 洗 涤, 必 要 时 先 把 洗 液 加 热, 并 浸 泡 一 段 时 间 氧 化 性 污 物 ( 如 :Mn2 铁 锈 等 ) 浓 盐 酸 草 酸 洗 液 高 锰 酸 钾 污 垢 酸 性 草 酸 溶 液 粘 附 的 硫 磺 : 煮 沸 的 石 灰 水 处 理 瓷 砂 钵 内 的 污 迹 用 少 量 NaL 在 砂 钵 内 研 磨 后 倒 掉, 再 用 不 洗, 被 有 机 物 染 色 的 比 色 皿 体 积 比 为 1:2 的 盐 酸 酒 精 液 处 理 Ag.u HN3. 碘 用 KI 溶 液 浸 泡, 温 热 的 稀 NaH 或 用 Na2S23 溶 液 处 理 (4) 去 离 子 水 荡 洗 刷 洗 或 洗 涤 剂 洗 过 后, 再 用 水 连 续 淋 洗, 最 后 用 去 离 子 水 或 蒸 馏 水 荡 洗 2-3 次 玻 璃 器 皿 的 干 燥 1. 干 燥 的 一 般 要 求 1 一 般 的 仪 器, 倒 置 凉 干 2 严 格 要 求 无 水, 凉 干 后, 放 烘 箱 中 烘 干, 但 容 量 器 不 能 在 烘 箱 中 烘 干 3 立 即 使 用 或 大 仪 器, 用 丙 酮 或 乙 醇 摇 洗, 再 用 电 吹 风 吹 干 : 等 角 和 冷 风 吹 1-2min, 当 大 部 分 溶 剂 挥 发 后 再 用 热 风 吹, 吹 干 后 再 用 冷 风 吹 冷 2 干 燥 器 的 使 用 易 吸 潮 灼 烧 后 的 坩 埚, 或 需 较 长 时 间 保 持 干 燥 的 样 品 2.2 溶 液 的 配 制 试 剂 的 取 用 固 体 试 剂 的 取 用 称 量 取 用 : 专 匙 专 用 用 后 立 即 洗 涤 ; 称 量 ; 放 在 干 净 的 纸 上 表 面 皿 上 对 腐 蚀 性 或 易 吸 潮 的 固 体, 必 须 放 在 表 面 皿 上 或 玻 璃 容 器 内 液 体 的 取 用 液 体 试 剂 的 取 用 打 开 液 体 试 剂 瓶 后, 右 手 手 心 朝 向 标 签 处 握 住 试 剂 瓶 ( 以 免 倾 注 液 体 时 弄 脏 标 签 ), 左 手 拿 偏 住 盛 接 的 容 器 小 口 容 器 : 小 心 将 容 器 倾 斜 并 靠 近 试 剂 瓶, 再 缓 缓 进 行 倾 倒, 最 后 一 滴 可 用 容 器 轻 触 ; 若 是 大 口 容 器, 则 可 用 玻 棒 引 流, 以 免 液 体 溅 出 取 用 量 少 时, 可 将 液 体

21 21 试 剂 盛 于 滴 瓶 中, 再 用 滴 管 取 用 滴 管 加 入 时, 要 将 接 收 容 器 倾 斜, 滴 管 竖 直, 使 液 滴 沿 器 壁 流 下, 不 可 将 滴 管 伸 入 接 收 容 器 内, 滴 管 口 不 得 接 触 容 器 壁 溶 液 的 配 制 1. 一 般 溶 液 的 配 制 配 制 试 剂 溶 剂 时, 要 树 立 量 的 概 念, 掌 握 精 细 严 松 四 个 字 根 据 浓 度 的 准 确 要 求 来 进 行 试 剂 : 溶 液 可 分 为 一 般 试 剂 溶 液 和 标 准 溶 液 一 般 步 骤 : 根 据 所 需 配 制 的 浓 度 和 溶 液 量 算 出 所 需 固 体 量, 称 取 后 置 于 容 器 内, 加 少 量 水, 搅 拌 溶 解, 必 要 时 可 加 热, 然 后 再 加 水 溶 解 饱 和 溶 液 的 配 制 : 所 称 固 体 量 应 稍 多 于 计 算 量, 加 热 溶 解, 冷 却, 待 结 晶 析 出 后 再 用, 这 样 可 保 证 溶 液 处 于 饱 和 状 态 2. 放 热 溶 解 应 首 先 在 烧 杯 中 进 行 配 制 3. 易 水 解 盐 溶 液 的 配 制 必 须 先 将 试 剂 溶 解 在 相 应 的 酸 溶 液 中, 如 L2,Sbl3-Hl 中,Bi(N3)3-HN3 等, 以 防 水 解, 再 稀 释 至 所 需 浓 度 易 氧 化 低 价 金 属 盐 类 : 如 FeS4 Snl4 等 时, 不 仅 需 要 酸 化 溶 液, 而 且 还 应 在 该 溶 液 中 加 入 相 应 的 金 属 如 (Fe,Sn 等 ), 以 防 低 价 金 属 离 子 被 氧 化 4. 注 意 事 项 : 1 见 光 易 分 解 和 易 挥 发 的 试 剂, 应 盛 放 在 棕 色 瓶 中, 并 避 光 保 存 ; 2 对 玻 璃 有 腐 蚀 性 的 溶 液 : 应 放 在 聚 乙 烯 瓶 中 ; 3 对 配 制 的 溶 液 及 时 带 加 以 保 护 上 溶 液 的 名 称, 浓 度 配 制 日 期 的 标 签, 标 签 外 蜡 封 或 贴 透 明 胶 酸 碱 标 准 溶 液 的 配 制 和 标 定 酸 碱 滴 定 中, 常 用 HL NaH 等 溶 液 作 为 标 准 溶 液 浓 HL 易 挥 发, 浓 度 也 随 之 改 变 ; NaH 具 有 很 强 的 吸 湿 性, 易 吸 收 空 气 中 的 水 分 和 2, 且 由 于 其 本 身 会 有 少 量 的 硫 酸 盐 氯 化 物 和 二 氧 化 硅 故 它 们 一 般 不 能 直 接 配 得 标 准 溶 液, 而 是 将 他 们 配 成 近 似 浓 度, 然 后 选 用 适 当 的 基 准 物 进 行 标 定, 确 定 其 浓 度 a. HL 溶 液 的 标 定 : 常 用 的 基 准 物 有 无 水 Na23 和 硼 砂 等 无 水 Na23 基 准 物 的 优 点 : 易 提 纯 价 格 便 宜,(P=3~3.5, 甲 基 液 甲 基 橙 ) 但 其 质 量 较 小, 易 吸 湿 硼 砂 解 为 基 准 物 的 优 点 是 : 吸 湿 性 小, 易 制 备 成 纯 品, 质 量 较 大, 但 由 于 其 含 结 晶 水, 易 风 化 失 水 等 2HL + Na23 = 2 Nal H2(P=3~3.5, 甲 基 液 甲 基 橙 ) Na2B47 10H2 + 2HL = 4H3B3 + 2Nal + 5H2 (PH=5.1 可 选 甲 基 液 )

22 22 b. NaH 溶 液 的 标 定 常 用 的 基 准 物 有 草 酸, 邻 苯 二 甲 酸 氢 钾 等 含 容 量 分 析 仪 的 使 用 :1 对 于 准 确 度 要 求 高 的 分 析 工 作 2 滴 定 分 析 中 用 到 的 三 种 准 确 量 器 滴 定 管 移 液 管 和 容 量 瓶, 由 于 温 度 的 变 化, 试 剂 的 侵 蚀 以 及 出 厂 的 质 量 等 原 因, 其 容 积 与 它 所 标 识 的 体 积 并 非 完 全 一 致, 因 此, 在 准 确 度 要 求 高 的 分 析 工 作 中, 必 须 对 三 种 量 器 进 行 标 定 常 用 化 学 生 物 试 剂 的 配 制 1. 含 0.5mol/L 氯 化 钠 的 0.5mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 组 份 浓 度 0.5mol/L 氯 化 钠 0.5mol/L 氢 氧 化 钠 配 制 量 1L 配 置 方 法 :(1) 准 确 量 取 氯 化 钠 29.3g (2) 准 确 量 取 氢 氧 化 钠 20g (3) 用 去 离 子 水 稀 释 至 1L 注 意 : 此 溶 液 供 回 收 纤 维 素 时 使 用 2.0.2% 葡 萄 糖 标 准 溶 液 组 份 浓 度 0.2% 配 制 量 1L 配 置 方 法 :(1) 称 取 葡 萄 糖 2.5g 置 于 称 量 瓶 中, 在 70 干 燥 2 小 时 (2) 干 燥 器 中 冷 却 至 室 温, 重 复 干 燥, 冷 却 至 恒 重 (3) 准 确 称 取 葡 萄 糖 2.000g (4) 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 容 至 1L 5. 于 4 保 存 3 250μg/mL 牛 血 清 白 蛋 白 标 准 液 组 份 浓 度 250μg/mL 配 制 量 2L 配 置 方 法 (1) 准 确 称 取 250mg 标 准 牛 血 清 白 蛋 白 (2) 用 0.03mol/LpH7.8 的 磷 酸 缓 冲 液 溶 解 并 定 容 至 1L (3)4 保 存 4 Folin 试 剂 甲 配 置 方 法 : (1) 称 取 10g 氢 氧 化 钠 溶 于 400mL 去 离 子 水 中, 加 入 50g 无 水 碳 酸 钠, 溶 解, 待 用 (2) 称 取 0.5g 酒 石 酸 钾 钠, 溶 于 80mL 去 离 子 水 中, 加 入 0.25g 硫 酸 铜 5 水, 溶 解 (3) 将 1:2: 去 离 子 水 按 20:4:1 的 比 例 混 合 即 可 4. 4 保 存, 可 用 一 周 5 Folin 试 剂 乙 配 置 方 法 : (1) 在 500mL 的 磨 口 回 流 装 置 内 加 入 钨 酸 钠 2 水 g, 钼 酸 钠 2 水 g, 去 离 子 水 175mL,85% 磷 酸 12.5mL, 浓 盐 酸 25mL, 充 分 混 合

23 23 (2) 回 流 10 小 时, 再 加 硫 酸 锂 37.5g, 去 离 子 水 12.5mL 及 数 滴 溴 (3) 然 后 开 口 沸 腾 15min, 以 驱 除 过 量 的 溴, 冷 却 后 定 容 到 250mL (4) 于 棕 色 瓶 中 保 存, 可 使 用 多 年 注 意 : 上 述 制 备 地 Folin 试 剂 乙 地 贮 备 液 浓 度 一 般 在 2mol/L 左 右, 几 种 操 作 方 案 都 是 把 Folin 试 剂 乙 稀 释 至 1mol/L 的 浓 度 作 为 应 用 液, 我 们 这 时 是 把 贮 备 液 于 使 用 前 稀 释 18 倍, 使 之 浓 度 为 0.1mol/L 略 高 这 种 稀 释 18 倍 后 的 Folin 试 剂 乙 就 是 上 文 称 之 为 的 应 用 液 Folin 试 剂 乙 贮 备 液 浓 度 的 标 定, 一 般 是 以 酚 酞 为 指 示 剂 用 Folin 试 剂 乙 去 滴 定 1mol/L 左 右 的 标 准 氢 氧 化 钠 溶 液, 当 溶 液 颜 色 由 红 变 为 紫 灰, 再 突 然 变 成 墨 绿 即 为 终 点, 如 果 用 氢 氧 化 钠 去 滴 定 Folin 试 剂 乙, 终 点 不 太 好 掌 握, 溶 液 地 颜 色 是 由 浅 黄 变 为 浅 绿, 再 变 为 灰 紫 色 为 终 点 6 DNS 试 剂 (3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 试 剂 ) 配 置 方 法 : (1) 取 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 10g, 加 入 2mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 200mL (2) 将 3,5- 二 硝 基 水 杨 酸 溶 解, 然 后 加 入 酒 石 酸 钾 钠 300g (3) 待 其 完 全 溶 解, 用 去 离 子 水 稀 释 至 2000mL, 棕 色 瓶 保 存 7 5% 蔗 糖 溶 液 组 份 浓 度 5% 配 制 量 1L 配 置 方 法 : 称 取 蔗 糖 50g, 用 去 离 子 水 溶 解 定 容 至 1L 8 0.1mol/L 蔗 糖 溶 液 组 份 浓 度 0.1mol/L 配 制 量 1L 配 置 方 法 : 称 取 蔗 糖 g, 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 容 至 1L 9 20% 乙 酸 溶 液 组 份 浓 度 20% 配 制 量 1.2L 配 置 方 法 : 量 取 冰 乙 酸 300mL, 用 去 离 子 水 稀 释 至 1200mL 10 30%(W/V)Acrylamide 组 份 浓 度 30%(W/V)Acrylamide 0.05% 配 制 量 1L 配 置 方 法 : (1) 称 量 下 列 试 剂, 置 于 1L 烧 杯 中 Acrylamide 290g BIS 10g (2) 向 烧 杯 中 加 入 约 600mL 的 去 离 子 水, 充 分 搅 拌 溶 解 (3) 加 入 去 离 子 水 将 溶 液 定 容 至 1L, 用 0.45μm 滤 膜 滤 去 杂 质

24 24 (4) 于 棕 色 瓶 中 4 保 存 注 意 : 丙 稀 铣 胺 具 有 很 强 的 神 经 毒 性, 并 可 通 过 皮 肤 吸 收, 其 作 用 有 积 累 性, 配 制 时 应 戴 手 套 等 聚 丙 烯 酰 胺 无 毒, 但 也 应 谨 慎 操 作, 因 为 有 可 能 含 有 少 量 的 未 聚 合 成 份 11 40%(W/V)Acrylamide 组 份 浓 度 40%(W/V)Acrylamide 0.05% 配 制 量 1L 配 置 方 法 : (1) 称 量 下 列 试 剂, 置 于 1L 烧 杯 中 Acrylamide 380g BIS 20g (2) 向 烧 杯 中 加 入 约 600mL 的 去 离 子 水, 充 分 搅 拌 溶 解 3. 加 入 去 离 子 水 将 溶 液 定 容 至 1L, 用 0.45μm 滤 膜 滤 去 杂 质 4. 于 棕 色 瓶 中 4 保 存 注 意 : 丙 稀 铣 胺 具 有 很 强 的 神 经 毒 性, 并 可 通 过 皮 肤 吸 收, 其 作 用 有 积 累 性, 配 制 时 应 戴 手 套 等 聚 丙 烯 酰 胺 无 毒, 但 也 应 谨 慎 操 作, 因 为 有 可 能 含 有 少 量 的 未 聚 合 成 份 12 10%(W/V) 过 硫 酸 铵 组 份 浓 度 10%(W/V) 过 硫 酸 铵 配 制 量 10mL 配 置 方 法 : (1) 称 取 1g 过 硫 酸 铵 (2) 加 入 10mL 的 去 离 子 水 后 搅 拌 溶 解 (3) 贮 存 于 4 注 意 :10% 过 硫 酸 胺 溶 液 在 4 保 存 时 间 可 使 用 2 周 左 右, 超 过 期 限 会 失 去 催 化 作 用 13 考 马 斯 亮 蓝 R-250 染 色 液 组 份 浓 度 0.1%(W/V) 考 马 斯 亮 蓝 R-250,25%(V/V) 异 丙 醇, 10%(V/V) 冰 醋 酸 配 制 量 1L 配 置 方 法 : (1) 称 取 1g 考 马 斯 亮 蓝 R-250, 置 于 1L 烧 杯 中 (2) 量 取 250mL 的 异 丙 醇 加 入 上 述 烧 杯 中, 搅 拌 溶 解 (3) 加 入 100mL 的 冰 乙 醋 酸, 均 匀 搅 拌 (4) 加 入 650mL 的 去 离 子 水, 均 匀 搅 拌 (5) 用 滤 纸 出 去 颗 粒 物 质 后, 室 温 保 存 14 考 马 斯 亮 蓝 染 色 脱 色 液 组 份 浓 度 10%(V/V) 醋 酸,5%(V/V) 乙 醇 配 制 量 1L 配 置 方 法 :(1) 量 取 下 列 溶 液, 置 于 1L 烧 杯 中 醋 酸 100mL 乙 醇 50mL H2850mL (2) 充 分 混 合 后 使 用 15 凝 胶 固 定 液 (SDS-PAGE 银 氨 染 色 用 )

25 25 组 份 浓 度 50%(V/V) 甲 醇,10%(V/V) 醋 酸 配 制 量 100L 配 置 方 法 :(1) 量 取 下 列 溶 液, 置 于 1L 烧 杯 中 甲 醇 500mL 醋 酸 100mL H2 400mL (2) 均 匀 混 合 后 室 温 保 存 16 凝 胶 处 理 液 (SDS-PAGE 银 氨 染 色 用 ) 组 份 浓 度 50%(V/V) 甲 醇,10%(V/V) 戊 二 醛 配 制 量 1L 配 置 方 法 :(1) 量 取 下 列 溶 液, 置 于 1L 烧 杯 中 甲 醇 50mL 戊 二 醛 10mL H2 40mL (2) 均 匀 混 合 后 室 温 保 存 17 凝 胶 染 色 液 (SDS-PAGE 银 氨 染 色 用 ) 组 份 浓 度 0.4%(W/V) 硝 酸 银,1%(V/V) 浓 氨 水,0.04%(W/V) 氢 氧 化 钠 配 制 量 100L 配 置 方 法 (2) 量 取 下 列 试 剂, 加 入 100~200mL 试 剂 瓶 中 20% 硝 酸 银 2mL; (2) 浓 氨 水 1mL 4% 氢 氧 化 钠 1mL H2 96mL 2. 均 匀 混 合 该 溶 液 应 为 无 色 透 明 状 如 氨 水 浓 度 过 低 时 溶 液 会 呈 现 混 浊 状, 此 时 应 补 加 浓 氨 水, 直 至 透 明 (3) 本 染 色 液 应 现 用 现 配, 不 宜 保 存 18 显 影 液 (SDS-PAGE 银 氨 染 色 用 ) 组 份 浓 度 0.005%(V/V) 柠 檬 酸,0.02%(V/V) 甲 醛 配 制 量 1L 配 置 方 法 :(1) 称 取 下 列 试 剂, 置 于 1L 试 剂 瓶 中 柠 檬 酸 50mg 甲 醛 0.2mL (2) 加 入 1L 去 离 子 水 后, 摇 动 混 合 后 溶 解 (3) 室 温 保 存 19 45% 乙 醇 溶 液 组 份 浓 度 45% 配 制 量 1L 配 置 方 法 : 量 取 无 水 乙 醇 450mL, 加 入 去 离 子 水 550mL, 混 匀 20 5% 的 十 二 烷 基 硫 酸 钠 溶 液 (W/V) 组 份 浓 度 5% 配 制 量 0.1L 配 置 方 法 称 取 5.0g 十 二 烷 基 硫 酸 钠, 溶 于 100mL4% 的 乙 醇 溶 液 中 21 三 氯 甲 烷 - 异 戊 醇 混 合 试 剂 配 置 方 法 取 500mL 三 氯 甲 烷 试 剂, 加 入 21mL 异 戊 醇 试 剂, 混 匀 % 乙 醛 溶 液 组 份 浓 度 1.6%

26 26 配 制 量 0.1L 配 置 方 法 取 47% 乙 醛 3.4mL, 用 去 离 子 水 定 容 至 100mL 23 二 苯 胺 试 剂 配 置 方 法 :(1) 称 取 二 苯 胺 试 剂 0.8g, 溶 解 于 180mL 冰 乙 酸 中 ; (2) 再 加 入 8mL 高 氯 酸 混 匀 (3) 临 用 前 加 入 0.8mL 1.6% 乙 醛 溶 液 注 意 : 配 制 完 成 后 试 剂 应 为 无 色 24 15% 三 氯 乙 酸 溶 液 组 份 浓 度 15% 配 制 量 2L 配 置 方 法 称 取 三 氯 乙 酸 300g, 用 去 离 子 水 溶 解 定 容 至 2000mL 25 1% 谷 氨 酸 溶 液 组 份 浓 度 1% 配 制 量 0.5L 配 置 方 法 : (1) 称 取 5g 谷 氨 酸, 先 用 适 量 得 用 去 离 子 水 溶 解 (2) 再 用 氢 氧 化 钾 溶 液 中 和 至 中 性 (3) 最 后 用 去 离 子 水 定 容 至 0.5L 26 1% 丙 酮 酸 溶 液 组 份 浓 度 1% 配 制 量 0.5L 配 置 方 法 : 1. 称 取 5g 丙 氨 酸, 先 用 适 量 得 用 去 离 子 水 溶 解 2. 再 用 氢 氧 化 钾 溶 液 中 和 至 中 性 3. 最 后 用 去 离 子 水 定 容 至 0.5L % 的 碳 酸 氢 钾 溶 液 组 份 浓 度 0.1% 配 制 量 0.5L 配 置 方 法 : 称 取 碳 酸 氢 钾 0.5g, 用 去 离 子 水 溶 解 定 容 至 0.5L % 的 碘 乙 酸 溶 液 组 份 浓 度 0.05% 配 制 量 0.25L 配 置 方 法 称 取 0.125g 碘 乙 酸, 用 去 离 子 水 溶 解 定 容 至 0.25L 29 Locke 氏 溶 液 配 制 量 2L

27 27 配 置 方 法 : 称 取 18g 氯 化 钠,0.84g 氯 化 钾,0.48g 氯 化 钙,0.3g 碳 酸 氢 钠,2g 葡 萄 糖, 用 去 离 子 水 溶 解 定 容 至 2000mL mol/L 的 丁 酸 溶 液 组 份 浓 度 0.2mol/L 配 制 量 1L 配 置 方 法 : 1. 量 取 18mL 正 丁 酸 试 剂 2. 用 1mol/L 的 氢 氧 化 钠 中 和 3. 再 用 去 离 子 水 定 容 至 1L mol/L 的 硫 代 硫 酸 钠 溶 液 组 份 浓 度 0.1mol/L 配 制 量 10L 配 置 方 法 称 g 硫 代 硫 酸 钠, 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 至 10L mol/L 的 碘 溶 液 组 份 浓 度 0.1mol/L 配 制 量 1L 配 置 方 法 : 1. 称 取 碘 12.7g 和 碘 化 钾 25g 2. 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 容 至 1L 3. 用 0.1mol/L 的 硫 代 硫 酸 钠 标 定 33 10% 氢 氧 化 钠 溶 液 组 份 浓 度 10% 配 制 量 2L 配 置 方 法 称 取 200g 氢 氧 化 钠, 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 容 至 2L 34 10% 盐 酸 溶 液 组 份 浓 度 10% 配 制 量 0.2L 配 置 方 法 量 取 浓 盐 酸 49.3mL, 用 去 离 子 水 定 至 0.2mL % 标 准 丙 氨 酸 溶 液 组 份 浓 度 0.1% 配 制 量 0.5L 配 置 方 法 : 称 取 丙 氨 酸 0.5g, 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 容 至 0.5mL % 标 准 谷 氨 酸 溶 液 组 份 浓 度 0.1% 配 制 量 0.5L 配 置 方 法 : 称 取 谷 氨 酸 0.5g, 用 去 离 子 水 溶 解 并 定 容 至 500mL

28 % 水 合 茚 三 酮 乙 醇 溶 液 组 份 浓 度 0.1% 配 制 量 1L 配 置 方 法 : 称 取 1g 水 合 茚 三 酮 试 剂, 溶 于 1000mL 无 水 乙 醇 中 38 酚 溶 液 配 置 方 法 : 在 大 烧 杯 中 加 入 80mL 去 离 子 水, 再 加 入 300g 苯 酚, 在 水 浴 中 加 热 搅 拌 混 合 至 苯 酚 完 全 溶 解 将 该 溶 液 倒 入 盛 有 200mL 去 离 子 水 的 1000mL 分 液 漏 斗 内, 轻 轻 振 荡 混 合, 使 其 成 为 乳 状 液 静 止 7~10 小 时, 乳 状 液 变 成 两 层 透 明 溶 液, 下 层 为 被 水 饱 和 的 酚 溶 液, 放 出 下 层, 贮 存 于 棕 色 瓶 中 备 用 % 淀 粉 溶 液 组 份 浓 度 0.5% 配 制 量 0.1L 配 置 方 法 称 取 淀 粉 0.5g, 用 去 离 子 水 溶 解 定 容 至 0.1L 40 对 羟 基 联 苯 试 剂 配 置 方 法 称 取 对 羟 基 联 苯 1.5g, 溶 于 100mL0.5% 氢 氧 化 钠 溶 液 中, 配 制 成 1.5% 的 溶 液 若 对 羟 基 联 苯 颜 色 较 深, 应 用 丙 酮 或 无 水 乙 醇 重 结 晶, 放 置 时 间 较 长 后, 会 出 项 针 状 结 晶, 应 摇 匀 后 使 用 生 物 化 学 常 用 的 缓 冲 液 的 配 制 及 保 存 常 用 的 缓 冲 液 的 配 制 目 前 最 常 用 的 缓 冲 液 有 下 列 几 种 :1 磷 酸 盐 缓 冲 液 ;2 醋 酸 盐 缓 冲 液 ;3 巴 比 妥 缓 冲 液 ;4 Tris Hl 缓 冲 液 ;5 硼 酸 缓 冲 淮 其 中 以 磷 酸 盐 缓 冲 液 应 用 最 多 1 磷 酸 盐 缓 冲 液 磷 酸 盐 是 生 物 化 学 研 究 中 使 用 最 广 泛 的 一 种 缓 冲 剂, 由 于 它 们 是 二 级 解 离, 有 二 个 pka 值, 所 以 用 它 们 配 制 的 缓 冲 液,pH 范 围 最 宽 : NaH2P4: pka1=2.12,pka2=7.21; Na2HP4:pKa1=7.21,pKa2=12.32 配 酸 性 缓 冲 液 : 用 NaH2P4,pH=1~4, 配 中 性 缓 冲 液 : 用 混 合 的 两 种 磷 酸 盐,pH=6~8, 配 碱 性 缓 冲 液 : 用 Na2HP4,pH=10~12 用 钾 盐 比 钠 盐 好, 因 为 低 温 时 钠 盐 难 溶, 钾 盐 易 溶, 但 若 配 制 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 缓 冲 液 时, 只 能 用 磷 酸 钠 而 不 能 用 磷 酸 钾, 因 为 SDS( 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ) 会 与 钾 盐 生 成 难 溶 的 十 二 烷 基 硫 酸 钾 磷 酸 盐 缓 冲 液 的 优 点 为 :1 容 易 配 制 成 各 种 浓 度 的 缓 冲 液 ;2 适 用 的 ph 范 围 宽 ;3pH 受 温 度 的 影 响 小 ;4 缓 冲 液 稀 释 后 ph 变 化 小, 如 稀 释 10 倍 后 ph 的 变 化 小 于 0.1

29 29 其 缺 点 为 :1 易 与 常 见 的 钙 a2+ 离 子 镁 Mg2+ 离 子 以 及 重 金 属 离 子 缔 合 生 成 沉 淀 ;2 会 抑 制 某 些 生 物 化 学 过 程, 如 对 某 些 酶 的 催 化 作 用 会 产 生 某 种 程 度 的 抑 制 作 用 2 Tris 缓 冲 液 Tris( 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷,N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 缓 冲 液 在 生 物 化 学 研 究 中 使 用 的 越 来 越 多, 有 超 过 磷 酸 盐 缓 冲 液 的 趋 势, 如 在 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 中 已 都 使 用 Tris 缓 冲 液, 而 很 少 再 用 磷 酸 盐 Tris 缓 冲 液 的 常 用 有 效 ph 范 围 是 在 中 性 范 围, 例 如 :Tris-Hl 缓 冲 液 ph=7.5~ 8.5;Tris- 磷 酸 盐 缓 冲 液 ph=5.0~9.0 配 制 Tris 缓 冲 液 的 方 法 有 两 种 :1 按 书 后 附 录 表 中 所 列 该 缓 冲 液 的 方 法, 分 别 配 制 0.05mol/L Tris 和 0.05mol/LHl 溶 液, 然 后 按 表 中 所 列 体 积 混 合 由 于 标 准 浓 度 的 稀 盐 酸 不 易 配 制, 所 以 常 用 第 二 种 方 法 ;2 若 配 1L0.1mol/L 的 Tris-Hl 缓 冲 液 : 先 称 12.11g Tris 碱 溶 于 950mL~970mL 无 离 子 水 中, 边 搅 拌 边 滴 加 4M Hl, 用 ph 计 测 定 溶 液 ph 值 至 所 需 的 ph 值, 然 后 再 加 水 补 足 到 1L Tris-Hl 缓 冲 液 的 优 点 是 :1 因 为 Tris 碱 的 碱 性 较 强, 所 以 可 以 只 用 这 一 种 缓 冲 体 系 配 制 ph 范 围 由 酸 性 到 碱 性 的 大 范 围 ph 值 的 缓 冲 液 ;2 对 生 物 化 学 过 程 干 扰 很 小, 不 与 钙 镁 离 子 及 重 金 属 离 子 发 生 沉 淀 缺 点 是 :1 缓 冲 液 的 ph 值 受 溶 液 浓 度 影 响 较 大, 缓 冲 液 稀 释 十 倍,pH 值 的 变 化 大 于 0.1;2 温 度 效 应 大, 温 度 变 化 对 缓 冲 液 ph 值 的 影 响 很 大, 例 如 :4 时 缓 冲 液 的 ph=8.4, 而 37 时 的 ph=7.4, 所 以 一 定 要 在 使 用 温 度 下 进 行 配 制, 室 温 下 配 制 的 Tris-Hl 缓 冲 液 不 能 用 于 0 ~4 ;3 易 吸 收 空 气 中 的 2, 所 以 配 制 的 缓 冲 液 要 盖 严 密 封 ;4 此 缓 冲 液 对 某 些 ph 电 极 发 生 一 定 的 干 扰 作 用, 所 以 要 使 用 与 Tris 溶 液 具 有 兼 容 性 的 电 极 3 有 机 酸 缓 冲 液 这 一 类 缓 冲 液 多 数 是 用 羧 酸 与 它 们 的 盐 配 制 而 成,pH 范 围 为 酸 性, 即 ph=3.0~6.0, 最 常 用 的 是 甲 酸 乙 酸 柠 檬 酸 和 琥 珀 酸 等 甲 酸 甲 酸 盐 缓 冲 液 很 有 用, 因 其 挥 发 性 强, 使 用 后 可 以 用 减 压 法 除 之 乙 酸 乙 酸 钠 和 柠 檬 酸 柠 檬 酸 钠 缓 冲 体 系 也 使 用 的 较 多, 柠 檬 酸 有 三 个 pka 值 :pka1=3.10,pka2=4.75, pka3=6.40 琥 珀 酸 有 二 个 pka 值 :pka1=4.18,pka2=5.60 有 机 酸 缓 冲 液 的 缺 点 是 :1 所 有 这 些 羧 酸 都 是 天 然 的 代 谢 产 物, 因 而 对 生 化 反 应 过 程 可 能 发 生 干 扰 作 用 ;2 柠 檬 酸 盐 和 琥 珀 酸 盐 可 以 和 过 渡 金 属 离 子 (Fe 3+ Zn 2+ Mg 2+ 等 ) 结 合 而 使 缓 冲 液 受 到 干 扰 ;3 这 类 缓 冲 液 易 与 a 2+ 离 子 结 合, 所 以 样 品 中 有 a 2+ 离 子 时, 不 能 用 这 类 缓 冲 液 4 硼 酸 盐 缓 冲 液 常 用 的 有 效 ph 范 围 是 :ph=8.5~10.0, 因 而 它 是 碱 性 范 围 内 最 常 用 的 缓 冲 液, 其 优 点 是 配

30 30 制 方 便, 只 使 用 一 种 试 剂, 缺 点 是 能 与 很 多 代 谢 产 物 形 成 络 合 物, 尤 其 是 能 与 糖 类 的 羟 基 反 应 生 成 稳 定 的 复 合 物 而 使 缓 冲 液 受 到 干 扰 5 氨 基 酸 缓 冲 液 此 缓 冲 液 使 用 的 范 围 宽, 可 用 于 ph=2.0~11.0, 例 如 最 常 用 的 有 : 甘 氨 酸 -Hl 缓 冲 液 :ph=2.0~5.0; 甘 氨 酸 -NaH 缓 冲 液 :ph=8.0~11.0; 甘 氨 酸 -Tris 缓 冲 液 :ph=8.0~11.0,( 此 缓 冲 液 用 于 广 泛 使 用 的 SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 电 极 缓 冲 液 ); 组 氨 酸 缓 冲 液 :ph=5.5~6.5; 甘 氨 酰 胺 (glycine amide) 缓 冲 液 :ph=7.8~8.8; 甘 氨 酰 甘 氨 酸 (glycylglycine) 缓 冲 液 :ph=8.0~9.0 此 类 缓 冲 体 系 的 优 点 是 : 为 细 胞 组 份 和 各 种 提 取 液 提 供 更 接 近 的 天 然 环 境 其 缺 点 是 : 1 与 羧 酸 盐 和 磷 酸 盐 缓 冲 体 系 相 似, 也 会 干 扰 某 些 生 物 化 学 反 应 过 程, 如 代 谢 过 程 等 2 试 剂 的 价 格 较 高 6 两 性 离 子 缓 冲 液 1960 年,N.E.Good 和 他 的 同 事 们 总 结 了 现 有 的 各 种 缓 冲 试 剂 的 优 缺 点 后 认 为, 必 须 用 人 为 设 计 和 人 工 合 成 的 方 法 来 找 到 专 门 用 于 生 命 科 学 研 究 的 特 定 的 缓 冲 体 系, 这 些 缓 冲 体 系 应 具 有 前 面 所 述 的 九 条 要 求 和 特 性 两 性 离 子 缓 冲 液 (Zwitterionic buffers) 的 主 要 优 点 是 不 参 加 和 不 干 扰 生 物 化 学 反 应 过 程, 对 酶 化 学 反 应 等 无 抑 制 作 用, 所 以 它 们 专 门 用 于 细 胞 器 和 极 易 变 性 的 对 ph 敏 感 的 蛋 白 质 和 酶 的 研 究 工 作 其 缺 点 是 :1 价 格 昂 贵 ;2 对 测 定 蛋 白 质 含 量 的 双 缩 脲 法 和 Lowry 法 不 适 用, 因 为 它 们 会 使 空 白 管 的 颜 色 加 深 标 准 缓 冲 液 的 配 制 及 其 保 存 ⒈ ph 标 准 物 质 应 保 存 在 干 燥 的 地 方, 如 混 合 磷 酸 盐 ph 标 准 物 质 在 空 气 湿 度 较 大 时 就 会 发 生 潮 解, 一 旦 出 现 潮 解,pH 标 准 物 质 即 不 可 使 用 ⒉ 配 制 ph 标 准 溶 液 应 使 用 二 次 蒸 馏 水 或 者 是 去 离 子 水 如 果 是 用 于 0.1 级 ph 计 测 量, 则 可 以 用 普 通 蒸 馏 水 ⒊ 配 制 ph 标 准 溶 液 应 使 用 较 小 的 烧 杯 来 稀 释, 以 减 少 沾 在 烧 杯 壁 上 的 ph 标 准 液 存 放 ph 标 准 物 质 的 塑 料 袋 或 其 它 容 器, 除 了 应 倒 干 净 以 外, 还 应 用 蒸 馏 水 多 次 冲 洗, 然 后 将 其 倒 入 配 制 的 ph 标 准 溶 液 中, 以 保 证 配 制 的 ph 标 准 溶 液 准 确 无 误 ⒋ 配 制 好 的 标 准 缓 冲 溶 液 一 般 可 保 存 2 3 个 月, 如 发 现 有 浑 浊 发 霉 或 沉 淀 等 现 象 时, 不 能 继 续 使 用 ⒌ 碱 性 标 准 溶 液 应 装 在 聚 乙 烯 瓶 中 密 闭 保 存 防 止 二 氧 化 碳 进 入 标 准 溶 液 后 形 成 碳 酸, 降 低 其 ph 值

31 免 疫 细 胞 化 学 常 用 试 剂 及 配 制 ( 秦 迪 岚 提 供 ) 固 定 剂 大 多 数 神 经 激 素 肽 类 物 质 为 水 溶 性, 在 用 于 免 疫 细 胞 化 学 研 究 之 前, 常 需 固 定 但 肽 类 和 蛋 白 质 的 物 理 化 学 性 质 不 同, 因 而 对 不 同 的 固 定 方 法 或 固 定 剂 的 反 应 也 不 尽 相 同 某 些 固 定 剂 甚 至 可 同 时 破 坏 和 / 或 保 护 同 一 抗 原 的 不 同 抗 原 决 定 簇 因 此, 在 进 行 免 疫 细 胞 化 学 研 究 之 前, 很 有 必 要 了 解 所 要 研 究 的 物 质 ( 蛋 白 质 或 肽 类 ) 的 化 学 性 质, 并 根 据 需 要 来 选 择 适 宜 的 固 定 剂 ( 或 固 定 方 法 ) 以 及 改 进 固 定 条 件 目 前, 免 疫 细 胞 化 学 研 究 中 常 用 的 固 定 剂 仍 为 醛 类 固 定 剂, 其 中 以 甲 醛 类 和 戊 二 醛 最 为 常 用 在 此, 简 要 介 绍 几 种 目 前 较 为 常 用 和 推 荐 的 固 定 剂, 以 大 家 选 用 1. 4% 多 聚 甲 醛 -0.1mol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph7.3) 试 剂 : 多 聚 甲 醛 40g 0.1mol/L 磷 酸 缓 冲 液 至 1000ml 配 制 方 法 : 称 取 40g 多 聚 甲 醛, 置 于 三 角 烧 瓶 中, 加 入 500~800ml 0.1mol/L 磷 酸 缓 冲 液 (Phosphate Buffer 以 下 简 称 PB), 加 热 至 60 左 右, 持 续 搅 拌 ( 或 磁 力 搅 拌 ) 使 粉 末 完 全 溶 解, 通 常 需 滴 加 少 许 1n NaH 才 能 使 溶 液 清 亮, 最 后 补 足 0.1mol/L 的 PB 于 1000ml, 充 分 混 匀 该 固 定 剂 较 适 于 光 镜 免 疫 细 胞 化 学 研 究, 最 好 是 动 物 经 灌 注 固 定 取 材 后, 继 续 浸 泡 固 定 2~24h 另 外, 该 固 定 剂 较 为 温 和, 适 于 组 织 标 本 的 较 长 期 保 存 2. 4% 多 聚 甲 醛 - 磷 酸 二 氢 钠 / 氢 氧 化 钠 试 剂 :A 液 : 多 聚 甲 醛 40g, 蒸 馏 水 400ml; B 液 :Na 2 HP 4 2H g, 蒸 馏 水 300ml; 液 :NaH 3.86g, 蒸 馏 水 200m 配 制 方 法 :A 液 最 好 在 500ml 的 三 角 烧 瓶 中 配 制 ( 方 法 同 前 ), 至 多 聚 甲 醛 完 全 溶 解 后 冷 却 待 用 注 意, 在 溶 解 多 聚 甲 醛 时, 要 尽 量 避 免 吸 入 气 体 或 溅 入 眼 内 B 液 和 液 配 制 好 后, 将 B 液 倒 入 液 中, 混 合 后 再 加 入 A 液, 以 1n NaH 或 1N Hl 将 ph 调 至 7.2~7.4, 最 后, 补 充 蒸 馏 水 至 1000ml 充 分 混 合,4 冰 箱 保 存 备 用 该 固 定 剂 适 于 光 镜 和 电 镜 免 疫 细 胞 化 学 研 究, 用 于 免 疫 电 镜 时, 最 好 加 入 少 量 新 鲜 配 制 的 戊 二 醛, 使 其 终 浓 度 为 0.5%~1% 该 固 定 剂 较 温 和, 适 于 组 织 的 长 期 保 存 组 织 标 本 于 该 固 定 液 中,4 冰 箱 保 存 数 月 仍 可 获 得 满 意 的 染 色 效 果 3.Bouin s 液 及 改 良 Bouin s 液 试 剂 : 饱 和 苦 味 酸,40% 甲 醛 250ml, 冰 醋 酸 50ml 配 制 方 法 : 先 将 饱 苦 味 酸 过 滤, 加 入 甲 醛 ( 有 沉 淀 者 禁 用 ), 最 后 加 入 冰 醋 酸, 混 合 后 存 于 4 冰 箱 中 备 用 冰 醋 酸 最 好 在 临 用 前 加 入 改 良 Bouin s 液 即 不 加 冰 醋 酸 该 固 定 液 为 组 织 学 病 理 学 常 用 固 定 剂 这 一, 对 组 织 的 穿 透 力 较 强, 固 定 较 好, 结 构

32 32 完 整 但 因 偏 酸 (ph 为 3~3.5), 对 抗 原 有 一 定 损 害, 且 组 织 收 缩 较 明 显, 故 不 适 于 组 织 标 本 的 长 期 保 存 此 外, 操 作 时, 应 避 免 吸 入 或 与 皮 肤 接 触 4.Zamboni s(stefanini s) 液 试 剂 : 多 聚 甲 醛 20g, 饱 和 苦 味 酸 150ml,Karasson-Schwlt s PB 至 1000ml 配 制 方 法 : 称 取 多 聚 甲 醛 20g, 加 入 饱 和 苦 味 酸 150ml, 加 热 至 60 左 右, 持 续 搅 拌 使 充 分 溶 解 过 滤 冷 却 后, 加 Karasson-Schwlt s PB 至 1000ml 充 分 混 合 (Karasson Schwlt s 磷 酸 缓 冲 液 的 配 制 配 制 方 法 见 后 ) 该 固 定 液 适 于 电 镜 免 疫 细 胞 化 学, 对 超 微 结 构 的 保 存 较 纯 甲 醛 为 优, 也 适 于 光 镜 免 疫 细 胞 化 学 研 究, 为 实 验 室 常 用 固 定 剂 之 一 我 们 在 应 用 中, 常 采 用 2.5% 的 多 聚 甲 醛 和 30% 的 饱 和 苦 味 酸, 以 增 加 其 对 组 织 的 穿 透 力 和 固 定 效 果, 保 存 更 多 的 组 织 抗 原 固 定 时 间 为 6~18h 5.PLP 液 PLP 液 即 过 碘 酸 盐 - 赖 氨 酸 - 多 聚 甲 醛 固 定 液 (Periodate-Lysine-paraform-alde-hyde fixative) 试 剂 : 过 碘 酸 钠, 赖 氨 酸 盐 酸 盐 ( 或 盐 酸 赖 氨 酸 ), 多 聚 甲 醛, 蒸 馏 水 配 制 方 法 :(1) 贮 存 液 A(0.1mol/L 赖 氨 酸 -0.5mol/l Na3P4,pH7.4): 称 取 赖 氨 酸 盐 酸 盐 1.827g 溶 于 50ml 蒸 馏 水 中, 得 0.2mol/L 的 赖 氨 酸 盐 酸 盐 溶 液, 然 后 加 入 Na2HP4 至 0.1mol/L, 将 ph 调 至 7.4, 补 足 0.1mol/L 的 PB 至 100ml, 使 赖 氨 酸 浓 度 也 为 0.1mol/L,4 冰 箱 保 存, 最 好 两 周 内 使 用 此 溶 液 的 渗 透 浓 度 为 300ms mmol/l/kg (2) 贮 存 液 B(8% 多 聚 甲 醛 溶 液 ): 称 8g 多 聚 甲 醛 加 入 100ml 蒸 馏 水 中, 配 成 8% 多 聚 甲 醛 液 ( 方 法 见 前 ) 过 滤 后 4 冰 箱 保 存 (3) 临 用 前, 以 3 份 A 液 与 1 份 B 液 混 合, 再 加 入 结 晶 过 碘 酸 钠 (NaI4), 使 NaI4 终 浓 度 为 2% 由 于 AB 两 液 混 合,pH 从 约 7.5 降 至 6.2, 故 固 定 时 不 需 再 调 ph 值 固 定 时 间 为 6~18h 该 固 定 剂 较 适 于 富 含 糖 类 的 组 织, 对 超 微 结 构 及 许 多 抗 原 的 抗 原 性 保 存 较 好 其 机 制 是 借 助 于 过 碘 酸 氧 化 组 织 中 的 糖 类 形 成 醛 基, 通 过 赖 氨 酸 的 双 价 氨 基 与 醛 基 结 合, 从 而 与 糖 形 成 交 联 由 于 组 织 抗 原 绝 大 多 数 都 是 由 蛋 白 质 和 糖 两 部 分 构 成, 抗 原 决 定 簇 位 于 蛋 白 部 分, 故 该 固 定 剂 有 选 择 性 地 使 糖 类 固 定, 这 样 既 稳 定 了 抗 原, 又 不 影 响 其 在 组 织 中 的 位 置 关 系 Mclean 和 Nakane 等 认 为, 最 佳 的 混 合 是 : 含 0.01mol/L 的 过 碘 酸 盐 0.075mol/L 的 赖 氨 酸 2% 的 多 聚 甲 醛 及 0.037mol/L 的 磷 酸 缓 冲 液 6.Karnovsky s 液 (ph7.3) 试 剂 : 多 聚 甲 醛 30g,25% 戊 二 醛 80ml,0.1mol/L PB 至 1000ml 配 制 方 法 : 先 将 多 聚 甲 醛 溶 于 0.1mol/L PB 中, 再 加 入 戊 二 醛, 最 后 加 0.1mol/L 的 PB 至 1000ml, 混 匀

33 33 该 固 定 剂 适 于 电 镜 免 疫 细 胞 化 学, 用 该 固 定 液 在 4 短 时 固 定, 比 在 较 低 浓 度 的 戊 二 醛 中 长 时 间 固 定 能 更 好 地 保 存 组 织 的 抗 原 性 和 细 微 结 构 固 定 时 最 好 先 灌 注 固 定, 接 着 浸 泡 固 定 10~30min, 用 缓 冲 液 漂 洗 后 即 可 树 酯 包 埋 或 经 蔗 糖 溶 液 后 用 于 恒 冷 切 片 7.0.4% 对 苯 醌 (Parabenzoquinone) 试 剂 : 对 苯 醌 4.0g,0.01mol/L PBS1000ml 配 制 方 法 : 称 取 4.0g 对 苯 溶 于 1000ml 0.01mol/L 的 PBS 即 可 对 苯 醌 对 抗 原 具 有 较 好 的 保 护 作 用, 但 对 超 微 结 构 的 保 存 有 一 定 影 响, 故 常 与 醛 类 固 定 剂 混 合 使 用 一 般 要 求 临 用 前 配 制, 且 避 免 加 热 助 溶, 因 加 热 或 放 置 时 间 过 长, 固 定 液 变 为 棕 色 至 褐 色, 会 使 组 织 标 本 背 景 增 加, 影 响 观 察 此 外, 对 苯 醌 有 剧 毒, 使 用 时 避 免 吸 入 或 与 皮 肤 接 触 8.PFG 液 (Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG) 试 剂 : 对 苯 醌 20g, 多 聚 甲 醛 15g,25% 戊 二 醛 40ml,0.1mol/L 二 甲 酸 钠 缓 冲 液 至 1000ml 配 制 方 法 : 先 以 500ml 左 右 的 二 甲 酸 钠 缓 冲 液 溶 解 对 苯 醌 及 多 聚 甲 醛, 然 后 加 入 戊 二 醛, 最 后 加 入 二 甲 酸 钠 缓 冲 液 至 1000ml 充 分 混 合 对 苯 醌 与 戊 二 醛 及 甲 醛 联 合 应 用, 即 可 阻 止 醛 基 对 抗 原 的 损 害, 又 不 影 响 超 微 结 构 的 保 存, 故 适 于 多 种 类 抗 原 的 免 疫 细 胞 化 学, 尤 其 是 免 疫 电 镜 的 研 究 9. 碳 二 亚 酰 胺 - 戊 二 醛 (ED-G) 液 试 剂 :0.05mol/L PB 500ml,0.01mol/L PBS 500ml,Tris 约 14g, 浓 Hl 少 许,ED 10g, 25% 戊 二 醛 3.5ml 配 制 方 法 : 先 以 约 500ml 的 PB 与 相 同 体 积 的 PBS 混 合, 加 入 Tris( 使 其 终 浓 度 为 1.4%) 溶 解, 以 浓 Hl 调 ph 至 7.0, 再 将 事 先 称 取 好 的 ED 和 戊 二 醛 加 入 混 合 液, 振 摇 后 计 时, 用 ph 计 检 测, 约 2~3min 时,pH 降 至 6.6, 再 以 1N 的 NaH 在 4min 内 调 ph 至 7.0, 此 时, 将 该 混 合 固 定 液 加 入 盛 有 细 胞 ( 经 PBS 漂 洗 过 ) 的 器 皿 中, 在 23 固 定 7min 后, 以 PBS 洗 去 固 定 液, 即 可 进 一 步 处 理 ED 即 乙 基 - 二 甲 基 氨 基 丙 基 碳 亚 胺 盐 酸 盐 [1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboiimide hydrochloride], 简 称 乙 基 -DI, 常 用 于 多 肽 类 激 素 的 固 定, 对 酶 等 蛋 白 质 的 固 定 也 有 良 好 效 果 ED 单 独 应 用 时, 边 缘 固 定 效 应 重, 但 与 戊 二 醛 Tris 及 PB 联 合 应 用, 效 果 明 显 改 善, 细 胞 质 仍 可 渗 透, 利 用 细 胞 中 抗 原 的 定 位, 超 微 结 构 保 存 较 好 目 前 认 为 是 一 种 用 于 培 养 细 胞 电 镜 水 平 免 疫 细 胞 化 学 研 究 的 很 好 的 固 定 剂 10. 四 氧 化 锇 ( 锇 酸 smic Acid, s 4 ) 配 制 : 将 洗 净 装 有 s4 的 安 瓿 中 加 热 后, 迅 速 投 入 装 有 溶 剂 的 棕 色 瓶 中, 使 安 瓿 遇 冷 自 破 也 可 用 钻 石 刀 在 安 瓿 上 划 痕, 洗 净 后 再 放 入 瓶 中, 盖 好 瓶 塞, 用 力 撞 击 安 瓿, 待 其 破 后 加 溶 剂 稀 释 为 保 证 充 分 溶 解, 应 在 用 前 几 天 配 制 (1)2% s4 水 溶 解 : 取 s41g 溶 于 重 蒸 水 中 此 液 常 作 为 储 备 液, 于 冰 箱 中 密

34 34 封 保 存 (2)1% s4-pb: 试 剂 :A 2.26%NaH 2 P 4 2H ml;B 2.52% 8.5ml; 5.4% 葡 萄 糖 5ml;D s 4 0.5g 配 制 方 法 : 先 分 别 配 好 A B 三 种 液 体, 取 A 液 41.5ml 与 B 液 8.5ml 混 合, 将 ph 调 至 7.3~7.4, 取 A-B 混 合 液 45ml 再 与 5ml 液 混 合 即 为 0.12mol/L PBG (3)1% s4/0.1mol/l 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 (ph7.2~7.4): 试 剂 :2% s4 水 溶 液 10ml;0.2mol/L 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 (ph7.2~7.4)10ml 配 制 方 法 : 取 2%s 4 储 备 液 10ml 与 等 量 0.2mol/L ph7.2~7.4 的 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 充 分 混 合 即 可 s 4 是 电 镜 研 究 所 必 需 的 试 剂, 常 用 于 后 固 定 尽 管 s 4 主 要 为 脂 类 固 定 剂, 但 也 可 与 肽 类 及 蛋 白 质 起 作 用, 形 成 肽 - 蛋 白 质 或 肽 - 脂 交 联 过 氧 化 物 酶 的 反 应 产 物 经 s 4 处 理 后, 电 子 密 度 增 高, 适 于 电 镜 研 究 但 由 于 s 4 的 反 应 产 物 对 光 及 电 子 有 较 明 显 的 吸 收 能 力, 因 此 在 免 疫 细 胞 化 学 染 色 前 常 需 去 除, 去 锇 在 光 镜 水 平 常 用 1% 的 高 锰 酸 钾, 在 电 镜 水 平 则 常 用 H 2 2 来 处 理 以 上 介 绍 了 目 前 免 疫 细 胞 化 学 中 常 用 的 一 些 固 定 液 关 于 固 定 液 种 类 还 很 多, 如 70%~90% 的 酒 精 丙 酮 醋 酸 酒 精 ( 含 0.1%~1% 醋 酸 的 70%~90% 的 酒 精 等 ), 这 些 溶 液 都 能 促 使 蛋 白 质 凝 固 它 们 最 初 只 是 光 学 显 微 镜 通 用 的 固 定 液, 但 在 免 疫 细 胞 化 学 上 用 其 它 方 法 不 成 功 时, 也 可 试 用 总 之, 掌 握 一 个 原 则, 免 疫 细 胞 化 学 中, 含 重 金 属 的 固 定 液 禁 用 ( 但 Zenker-Formalin 可 进 行 短 时 的 固 定 ) 目 前 多 数 认 为, 对 生 物 标 本 较 好 的 固 定 措 施 是 : 用 4 的 Karnovsky s 液 灌 注 固 定 10~30min 后, 接 着 在 ph mol/L 的 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 中 漂 洗 过 液, 这 种 短 时 冷 固 定 处 理, 有 助 于 超 微 结 构 和 许 多 肽 类 抗 原 的 保 存 对 其 它 较 难 保 存 的 抗 原 可 尝 试 PFG PLP 及 Zamboni s 液 等 混 合 固 定 液 缓 冲 液 免 疫 细 胞 化 学 中 应 用 的 缓 冲 液 种 类 较 多, 即 使 是 同 种 缓 冲 液, 其 浓 度 ph 离 子 强 度 等 也 常 常 不 同 在 此 介 绍 几 种 最 常 用 的 缓 冲 液 的 配 制 1.0.2mol/L(pH7.4) 磷 酸 盐 缓 冲 液 (Phosphate Buffer, PB) 试 剂 : NaH 2 P 4 2H 2,Na 2 HP 4 12H 2 配 制 方 法 : 配 制 时, 常 先 配 制 0.2mol/L 的 NaH2P4 和 0.2mol/L 的 Na 2 HP 4, 两 者 按 一 定 比 例 混 合 即 成 0.2mol/L 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PB), 根 据 需 要 可 配 制 不 同 浓 度 的 PB 和 PBS (1)0.2mol/L 的 Na 2 HP 4 ; 称 取 Na 2 HP 4.12H g( 或 NaH 2 P 4 H g) 加 重 蒸 水 至 1000ml 溶 解 (2)0.2mol/L 的 Na 2 HP 4 : 称 取 NaHP 4. 12H g( 或 Na 2 HP 4 7H g 或 Na 2 HP 4 2H g) 加 重 蒸 水 至 1000ml 溶 解 (3)0.2mol/L ph7.4 的 PB 的 配 制 : 取 19ml 0.2mol/L 的 NaH 2 P 4 和 81ml 0.2mol/L 的

35 35 Na 2 HP 4 12H 2, 充 分 混 合 即 为 0.2mol/L 的 PB(pH 约 为 7.4~7.5) 若 ph 偏 高 或 偏 低, 可 通 过 改 变 二 者 的 比 例 来 加 以 调 整, 室 温 保 存 即 可 mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 生 理 盐 水 (Phosphate Buffered Saline, PBS) 试 剂 :0.2mol/L PB 50ml,Nal 8.5~9g( 约 0.15mol/L), 重 蒸 水 至 1000ml 配 制 方 法 : 称 取 Nal 8.5~9g 及 0.2mol/L 的 PB 50ml, 加 入 1000ml 的 容 量 瓶 中, 最 后 加 重 蒸 水 至 1000ml, 充 分 摇 匀 即 可 若 拟 配 制 0.02mol/L 的 PBS, 则 PB 量 加 倍 即 可, 依 此 类 推 PB 和 PBS 是 免 疫 细 胞 化 学 实 验 中 最 为 常 用 的 缓 冲 液,0.01mol/L 的 PBS 主 要 用 于 漂 洗 组 织 标 本 稀 释 血 清 等, 其 ph 应 在 7.25~7.35 之 间, 否 则 需 要 调 整 0.1mol/L 的 PB 常 用 于 配 制 固 定 液 蔗 糖 等 一 般 情 况 下,0.2mol/l PB 的 ph 值 稍 高 些, 稀 释 成 0.01mol/L 的 PBS 时, 常 可 达 到 要 求 的 ph 值, 若 需 调 整 ph, 通 常 也 是 调 PB 的 ph 3.Karasson Schwlt s 磷 酸 盐 缓 冲 液 试 剂 : NaH 2 P 4 H g,Na 2 HP 4 7H g, 重 蒸 水 至 1000ml 配 制 方 法 : 同 前 该 缓 冲 液 主 要 用 于 配 制 Zamboni s 固 定 液 4.0.5mol/L ph7.6 的 Tris- Hl 缓 冲 液 试 剂 :Tris( 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 ) 60.57g,1N Hl 约 420ml, 重 蒸 水 至 1000ml 配 制 方 法 : 先 以 少 量 重 蒸 水 (300~500ml) 溶 解 Tris, 加 入 Hl 后, 用 1N 的 Hl 或 1N 的 NaH 将 ph 调 至 7.6, 最 后 加 重 蒸 水 至 1000ml 此 液 为 储 备 液, 于 4 冰 箱 中 保 存 免 疫 细 胞 化 学 中 常 用 的 Tris-Hl 缓 冲 液 浓 度 为 0.05mol/L, 用 时 取 储 备 液 稀 释 10 倍 即 可 该 液 主 要 用 于 配 制 Tris 缓 冲 生 理 盐 水 (TBS) DAB 显 色 液 5.Tris 缓 冲 生 理 盐 水 (Tris Buffered,Saline,TBS) 试 剂 :0.5mol/L Tris-Hl 缓 冲 液 100ml,Nal 3.5~9g(0.15mol/L), 重 蒸 水 至 1000ml 配 制 : 先 以 重 蒸 水 少 许 溶 解 Nal, 再 加 Tris-Hl 缓 冲 液, 最 后 加 重 蒸 水 至 1000ml, 充 分 摇 匀 使 Tris 终 浓 度 为 0.05mol/L TBS 主 要 用 于 漂 洗 标 本, 常 用 于 免 疫 酶 技 术 中 6.Tris-TBS(PBS) 试 剂 :Triton X ml(1%) 或 3ml(0.3%),0.5mol/L Tris 缓 冲 液 (ph7.6)1000ml(50ml) 或 (0.2mol/L 的 PB),Nal 8.5~9g, 重 蒸 水 至 1000ml 配 制 方 法 : 先 以 重 蒸 水 少 许 溶 解 Nal 后, 加 入 Triton X-100 及 Tris 缓 冲 液 或 (PB), 最 后 加 重 蒸 水 至 1000ml, 充 分 摇 匀 该 液 常 用 浓 度 为 1% 及 0.3%, 前 者 主 要 用 于 漂 洗 标 本, 后 者 主 要 用 于 稀 释 血 清 7.0.1mol/L(pH7.4) 二 甲 胂 酸 缓 冲 液 试 剂 :0.2mol/L 二 甲 胂 酸 钠 500ml,0.1N Hl 28ml, 蒸 馏 水 至 1000ml

36 36 配 制 方 法 : 先 称 取 二 甲 胂 酸 钠 (MW:214)42.8g, 加 蒸 馏 水 至 1000ml, 使 0.2mol/L 的 二 甲 胂 酸 钠 溶 液 ; 再 取 Hl 1.7ml 加 蒸 馏 水 至 1000ml, 配 成 0.1N, 最 后 取 0.2mol/L 二 甲 胂 酸 钠 溶 液 500ml 及 0.1n Hl 28ml 混 合, 加 蒸 馏 水 至 1000ml, 即 为 0.1mol/L 的 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 8. 几 种 常 用 的 不 同 ph 值 缓 冲 液 的 配 制 表 (1)0. 2mol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 (ph5.7~8.0) 见 表 1 表 mol/l 磷 酸 盐 缓 冲 液 ph 0.2mol/L 0.2mol/L ph 0.2mol/L 0.2mol/L NaH 2 P 4 (ml) Na 2 HP 4 (ml) NaH 2 P 4 (ml) Na 2 HP 4 (ml) (2) 0.05mol/L Tris-Hl 缓 冲 液 (ph7.19~9.10)( 见 表 2) 表 mol/L Tris-Hl 缓 冲 液 ph 0.2mol/L Tris(ml) 0.2mol/L Hl(ml) H

37 (3) 0.2mol/L 醋 酸 盐 缓 冲 液 (ph3.6~5.6)( 见 表 3) 表 3 0.2mol/L 醋 酸 盐 缓 冲 液 ph 0.2mol/L 醋 酸 (ml) 0.2mol/L 醋 酸 钠 (ml) ph 0.2mol/L 醋 酸 (ml) 0.2mol/L 醋 酸 钠 (ml) (4) 0.1mol/L 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 (ph5.0~7.4)( 见 表 4) 表 4 0.1mol/L 二 甲 胂 酸 钠 缓 冲 液 ph 0.2mol/L 二 甲 胂 酸 钠 (ml) 0.2N Hl(ml) 蒸 馏 水

38 注 :HI 可 由 N3 代 替, 配 制 成 二 甲 胂 酸 钠 -HN3 缓 冲 液 (5)0.2mol/L 碳 酸 盐 缓 冲 液 (ph9.2~10.7) 表 5 0.2mol/L 碳 酸 盐 缓 冲 液 ph 0.2mol/L Na 2 3 (ml) 0.2mol/L NaH 3 (ml) ph 0.2mol/L Na 2 3 (ml) 0.2mol/L NaH 3 (ml) 显 色 液 免 疫 细 胞 化 学 中, 由 于 抗 原 - 抗 体 反 应 所 形 成 的 复 合 物 本 身 无 色, 无 法 直 接 观 察, 因 而 需 借 助 于 某 些 化 学 基 团 的 呈 色 作 用, 使 其 得 以 显 示, 以 利 于 在 显 微 镜 下 观 察 常 用 的 显 色 液 有 : 1. DAB(Diaminobenzidine) 显 色 液 DAB 即 3,3- 二 氨 基 苯 联 胺 试 剂 :DAB( 常 用 四 盐 酸 盐 )50mg,0.05mol/L TB 100ml,30% H ~40μl 配 制 方 法 : 先 以 少 量 0.05mol/L(pH7.6) 的 TB 溶 解 DAB, 然 后 加 入 余 量 TB, 充 分 摇 匀, 使 DAB 终 浓 度 为 0.05%, 过 滤 后 显 色 前 加 入 30% 的 H2230~40μl, 使 其 终 浓 度 为 0.01% DAB 显 色 液 主 要 用 于 免 疫 过 氧 化 物 酶 法 ( 如 酶 标 法 PAP 法 等 ), 其 终 产 物 可 直 接 在 光 镜 下 观 察, 也 可 经 s4 处 理 后, 增 加 反 应 产 物 的 电 子 密 度, 用 于 电 镜 观 察 但 有 几 点

39 39 需 注 意 :DAB 溶 解 要 完 全, 否 则 未 溶 解 的 颗 粒 沉 积 于 标 本 上 影 响 观 察 ;DAB 浓 度 不 易 过 高, 否 则 显 色 液 呈 棕 色, 增 加 背 景 染 色, 另 外 DAB 有 致 癌 作 用, 故 操 作 时 应 戴 手 套, 尽 量 避 免 与 皮 肤 接 触, 用 后 及 时 彻 底 冲 洗, 接 触 DAB 的 实 验 用 品 最 好 经 洗 液 浸 泡 24h 后 使 用 氯 -1- 萘 酚 (4 l - 1- Naphthol) 显 色 液 配 方 1:4-l-1- 萘 酚 100mg, 纯 乙 醇 10ml,0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml,30% H μl(0.003%) 配 制 方 法 : 先 将 4-l-1- 萘 酚 溶 解 于 乙 醇 中, 然 后 加 入 Tb 19ml, 用 前 加 入 30% H22 使 其 终 浓 度 为 0.005%, 切 片 显 色 时 间 通 常 为 5~20min 配 方 2:4-l-1- 萘 酚 N- 二 甲 基 甲 酰 胺 (DMF),0.05mol/L TB(pH7.6),30% H 2 2, 配 制 方 法 : 先 将 4-l-1- 萘 酚 加 入 DMF 中, 加 热 溶 解 使 呈 乳 白 色, 再 加 入 TB, 乳 白 色 变 为 絮 状, 在 7.5 加 热 5min 后 加 入 H22, 搅 动 使 絮 状 消 失, 趁 热 过 滤, 当 降 至 略 低 于 50 时 才 放 入 组 织 标 本 ( 注 意 : 温 度 过 高 易 损 伤 标 本, 过 低 则 易 重 新 出 现 沉 淀 ) 显 色 时 间 通 常 为 5min 左 右 4-l-1- 萘 酚 的 终 产 物 显 示 蓝 色 多 数 认 为 最 好 去 除 白 色 沉 淀 ( 如 上 述 ), 但 Larsson 等 认 为, 白 色 沉 淀 可 作 为 背 景, 使 阳 性 部 位 更 易 观 察 由 于 酒 精 可 溶 解 4-l-1- 萘 酚 显 色 的 组 织 标 本, 勿 用 酒 精 脱 水 氨 基 -9- 乙 基 卡 唑 (3-amino-9-ethylcarbozole,AE) 显 色 液 试 剂 :AE 20mg, 二 甲 基 甲 酰 胺 (DMF)2.5ml,0.05mol/L 醋 酸 缓 冲 液 (ph5.5)50ml, 30%H ml, 配 制 方 法 : 先 将 AE 溶 于 DMF 中, 再 加 入 醋 酸 缓 冲 液 充 分 混 匀 临 显 色 前, 加 入 30%H22 切 片 显 色 时 间 为 5~20min 该 显 色 液 作 用 后, 阳 性 部 分 呈 深 红 色, 加 以 苏 木 精 或 亮 绿 等 作 为 背 景 染 色, 则 效 果 更 佳 由 于 终 产 物 溶 于 酒 精 和 水, 故 需 用 甘 油 封 固 4. TMB 显 色 液 试 剂 :TMB,Hl, 亚 硝 基 铁 氰 化 钾, 无 水 酒 精 配 制 方 法 :(1) 醋 酸 盐 缓 冲 液 : 取 1.0mol/L 的 Hl 190ml 加 入 1.0mol/L 的 醋 酸 钠 400ml 中 混 合, 再 加 蒸 馏 水 稀 释 至 1000ml, 用 醋 酸 或 NaH 将 ph 调 至 3.3 (2)A 液 : 取 上 述 缓 冲 液 5ml, 溶 解 100mg 亚 硝 基 铁 氰 化 钾, 加 蒸 馏 水 92.5ml 混 合 (3)B 液 : 称 取 5mg TMB 加 入 2.5ml 无 水 酒 精 中, 可 加 热 至 37 ~40 直 到 TMB 完 全 溶 解 (4) 孵 育 液 : 放 入 标 本 前 数 秒, 取 2.5ml B 液 及 97.5ml A 溶 于 试 管 中 充 分 混 合 ( 液 体 在 20min 内 应 保 持 清 亮 的 黄 绿 色, 否 则 可 能 已 有 污 染 ) 酶 反 应 时, 加 入 终 浓 度 为 0.005%

40 40 的 H 2 2 (5) 主 要 显 色 步 骤 : 组 织 标 本 在 蒸 馏 水 ( 或 PBS) 中 漂 洗 数 次 ( 每 次 约 10~15min) 后 放 入 未 加 H22 的 孵 育 液 中 作 用 20min(19 ~30 ), 然 后 向 孵 育 液 中 放 入 H22( 每 100ml 孵 育 液 中 加 0.3% 的 H22 1.0~5.0ml) 继 续 孵 育 液 20min 左 右 (19 ~23 ), 捞 出 标 本 漂 洗 数 次 ( 共 30min 左 右 ) 在 0~4 条 件 下 可 在 漂 洗 液 放 置 4h 直 至 贴 片 脱 水, 封 片 也 可 在 贴 片 前 在 1% 的 中 性 红 中 负 染 2~3min, 也 可 在 1% 派 诺 宁 (ph3.3~3.5) 中 负 染 5min 后 贴 片 脱 水 封 片 TMB 即 四 甲 基 联 苯 胺 (Tetrabenzidine) 是 一 种 脂 溶 性 较 强 的 基 团, 因 此 容 易 进 入 细 胞 与 细 胞 器 中 的 HRP 反 应, 且 由 于 这 种 高 度 的 脂 溶 性, 使 其 易 形 成 多 聚 体, 在 HRP 活 性 部 位 产 生 粗 大 的 深 兰 色 沉 淀 物, 这 使 得 TMB 成 为 组 化 实 验 中 的 一 种 很 好 的 发 色 团 同 时 反 应 产 物 的 沉 淀, 使 得 HRP 的 活 性 部 位 更 加 暴 露, 利 于 酶 氧 化 反 应 进 行 TMB 的 反 应 产 物 为 深 蓝 色, 利 于 光 镜 观 察, 且 反 应 产 物 越 聚 越 大, 常 超 出 单 个 细 胞 器 的 范 围 ( 而 DAB 则 被 限 制 在 其 内 ), 故 TMB 反 应 的 检 测 阈 较 低 由 于 上 述 优 点, 目 前 TMB 常 用 于 光 镜 及 超 微 结 构 水 平 的 HRP 及 HRP-WGA 神 经 投 射 的 研 究 需 要 注 意 的 是 :TMB 显 色 液 中 的 A 液 和 B 液 应 在 2h 内 新 鲜 配 制 另 外,TMB 是 一 种 较 强 的 皮 肤 刺 激 剂, 并 有 致 癌 的 潜 在 可 能, 故 使 用 时 应 带 手 套 及 在 通 风 条 件 下 操 作 5. NBT 显 色 液 试 剂 A 液 :5%NBT: 称 取 0.5gNBT 溶 于 10ml 70% 的 DMF( 二 甲 基 甲 胺 ) 内, 充 分 混 合, 常 存 于 4, 也 可 装 成 小 份,-20 保 存, 用 前 复 温 B 液 :5% BIP: 称 取 BIp 0.5g 溶 于 10ml 100% 的 DMF 内, 混 匀 4 或 分 装 存 于 -20, 用 前 恢 复 至 室 温. 显 色 液 : 取 A 液 40μl, 加 入 到 盛 有 10ml 的 0.1mol/l Tris-Hl(pH9.5, 钤 0.1mol/L Nal 5mmol/L Mgl2) 管 内, 充 分 混 匀 ; 再 加 入 B 液 40μl, 轻 轻 混 合 即 可 最 好 用 前 新 鲜 配 制 NBT 即 四 唑 氮 蓝 (Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818, 为 深 蓝 色 无 定 形 微 溶 物 质 BIP 即 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲 哚 - 磷 酸 盐 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) 当 二 者 存 在 时, 在 碱 性 磷 酸 酶 (Alkaline phosphatase, AP) 作 用 下,NBT 被 还 原 形 成 显 微 镜 下 可 见 的 蓝 色 或 紫 色 沉 淀 粘 附 剂 在 免 疫 细 胞 化 学 工 作 中, 由 于 标 本 ( 如 切 片 ) 的 脱 落 常 影 响 工 作 的 质 量 的 速 度, 故 粘 附 剂 的 选 择 和 使 用 就 显 得 较 为 重 要 1. 铬 矾 明 胶 液 试 剂 : 铬 矾 0.5g, 明 胶 (Gelatine)5g,H 2 ~1000ml 方 法 : 在 1000ml 的 烧 杯 或 烧 瓶 中, 以 500~800ml H2 加 温 溶 解 明 胶, 待 其 完 全 溶

41 41 解 后, 再 加 入 铬 矾 注 意 温 度 过 高 易 使 明 胶 烧 糊, 包 被 玻 片 时 最 好 控 制 水 温 在 70 如 有 明 显 残 渣, 过 滤 后 使 用 2. 甲 醛 - 明 胶 液 试 剂 :40% 甲 醛 2.5ml, 明 胶 0.5g, 蒸 馏 水 至 100ml, 配 制 方 法 : 用 少 许 蒸 馏 水 ( 约 80ml) 加 热 溶 解 明 胶, 待 完 全 溶 化 后, 加 入 甲 醛, 最 后 补 充 蒸 馏 水 至 100ml 混 匀 即 可 3. 多 聚 赖 氨 酸 (Poly-L-Lycine, PLL) 试 剂 : 多 聚 赖 氧 酸 5g, 蒸 馏 水 ~1000ml 配 制 方 法 : 称 取 PLL, 溶 于 H2, 充 分 混 合 即 可, 此 液 浓 度 为 0.5%, 可 适 当 稀 释 配 成 0.01~0.5% 浓 度 4 保 存, 也 可 -20 备 用 PLL 可 反 复 冰 冻, 效 果 无 明 显 影 响, 工 作 液 常 再 稀 释 10~50 倍 4.Vectabond 试 剂 该 试 剂 是 Vector 公 司 新 进 推 出 的 一 种 新 型 玻 片 粘 附 剂 该 试 剂 与 一 般 的 粘 附 剂 不 同, 它 是 通 过 对 玻 璃 表 面 起 化 学 修 饰 作 用, 改 变 其 表 面 的 化 学 物 理 特 性, 使 组 织 切 片 牢 固 地 贴 于 玻 璃 片 上, 贴 上 后 不 易 脱 落, 保 留 时 间 较 久 一 个 试 剂 盒 (7ml) 可 配 成 350ml 工 作 液 ( 用 丙 酮 配 ) 处 理 载 玻 片 前 ( 事 先 酸 处 理 ), 用 染 色 缸 装 好 各 种 液 体, 按 下 列 程 序 进 行 : 干 净 载 玻 片 丙 酮 5min Vectabond 试 剂 工 作 液 (7ml Vectabond+ 350ml 丙 酮 ): 将 载 玻 片 用 镊 子 夹 住 浸 入 Vectabond 试 剂 1~2 次 dh2,2 5min 干 燥 (37 过 夜 ) 用 铝 箔 包 好, 室 温 存 放 备 用 注 意 : 避 免 污 染 ( 尘 埃 等 ) 综 上 述 方 法 处 理 的 载 片 一 般 可 存 放 半 年 以 上 封 固 剂 1. 甘 油 -TBS 及 甘 油 -PBS 配 制 方 法 : 按 比 例 将 甘 油 和 TBS( 或 PBS) 充 分 混 合 后, 置 4, 冰 箱 静 止 ; 待 气 泡 排 除 后 方 可 使 用 2. 甘 油 - 明 胶 ( 冻 ) 试 剂 : 明 胶 10g, 甘 油 12ml, 蒸 馏 水 100ml, 香 草 酚 少 许, 配 制 方 法 : 称 取 1g 明 胶 于 温 热 ( 约 40 ) 的 蒸 馏 水 中, 充 分 溶 解 后 过 滤, 再 加 入 12ml 甘 油 混 合 均 匀 少 许 香 草 酚 是 为 了 防 腐 3. 液 体 石 蜡 液 体 石 蜡 因 含 杂 质 少, 很 少 引 起 非 特 异 性 荧 光, 故 常 用 于 荧 光 组 化 及 免 疫 荧 光 法 时 标 本 的 封 固 4.DPX 试 剂 :Distrene 10g, 酸 二 丁 5ml, 二 甲 苯 35ml DPX 为 中 性 封 固 剂, 用 于 多 种 染 色 方 法 匀 不 易 褪 色, 但 组 织 收 缩 较 明 显, 故 应 尽 量

42 42 使 其 为 均 匀 的 一 薄 层 DPX 现 有 商 品 出 售, 可 直 接 应 用 若 感 过 于 粘 稠, 也 可 加 少 量 二 甲 苯 稀 释 后 应 用 注 意 : 二 甲 苯 不 可 加 得 太 多, 二 甲 苯 挥 发 后, 片 子 上 出 现 许 多 干 燥 的 空 泡, 影 响 观 察, 遇 有 这 种 情 况, 可 用 二 甲 苯 浸 泡 掉 盖 玻 后 重 新 封 固 酶 消 化 液 % 胰 蛋 白 酶 试 剂 : 胰 蛋 白 酶 0.1gm,0.1% 氯 化 钙 (ph7.8)100ml, 配 制 方 法 : 先 配 制 0.1% 的 al2, 用 0.1mol/L 的 NaH 将 其 ph 调 至 7.8, 然 后 加 入 蛋 白 酶 溶 解 之 用 前 将 胰 蛋 白 酶 消 化 液 在 水 浴 中 予 热 至 37 ( 载 有 标 本 的 玻 片 也 在 TBS 中 予 热 至 同 样 样 温 度 ) 该 消 化 液 时 间 约 为 5~30min 2.0.4% 胃 蛋 白 酶 试 剂 : 胃 蛋 白 酶 400mg,0.1N Hl 100ml, 配 制 方 法 : 同 胰 蛋 白 酶 消 化 时 间 在 37 约 为 30min % Pronase 试 剂 :Pronase 0.06g,0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml, 配 制 方 法 : 同 前 在 免 疫 细 胞 化 学 染 色 中, 有 时 经 Formalin 过 度 固 定 的 标 本, 常 会 产 生 过 量 的 醛 基, 遮 盖 抗 原, 影 响 一 抗 与 抗 原 的 结 合 用 蛋 白 酶 溶 液 消 化, 可 起 到 暴 露 抗 原 部 分 的 作 用 消 化 时 间 应 根 据 不 同 组 织 而 异, 总 之, 在 保 持 组 织 形 态 不 被 破 坏 的 前 提 下, 宜 尽 量 延 长 消 化 时 间 以 上 三 种 酶 消 化 液 中, 以 第 一 种 最 为 常 用 其 它 蔗 糖 溶 液 免 疫 细 胞 化 学 中 应 用 的 蔗 精, 常 用 浓 度 为 5%~30% 一 般 光 镜 研 究, 仅 用 20% 蔗 糖 处 理 已 足 矣, 若 制 备 电 镜 标 本, 在 冰 冻 前 最 好 经 上 行 蔗 糖 (5% 10% 15% 20% 及 20% 蔗 糖 -5% 甘 油 等 ) 处 理, 以 确 保 其 良 好 的 细 微 结 构 (1)20% 蔗 糖 液 : 试 剂 : 蔗 糖 20g,0.1mol/L PB(pH7.5) 至 100ml 配 制 方 法 : 先 以 少 许 0.1mol/L 的 PB 溶 解 蔗 糖, 再 加 0.1mol/l PB 至 100ml 充 分 混 合, 置 4 冰 箱 保 存 该 液 多 用 于 纯 光 镜 研 究 标 本 在 刚 放 入 浓 度 如 此 高 的 蔗 糖 液, 常 浮 在 上 面, 当 标 本 沉 到 底 部 时 即 可 通 常 光 镜 标 本 浸 泡 在 20% 蔗 糖 液 中 过 夜 都 能 达 到 要 求 (2)20% 蔗 糖 -5% 甘 油 : 试 剂 : 蔗 糖 20g, 甘 油 5ml 2.3 固 液 分 离 与 加 热

43 固 液 分 离 的 方 法 (1) 倾 析 法 对 于 相 对 密 度 较 大 的 沉 淀 或 颗 粒 较 大 的 晶 体, 静 置 后 能 较 快 沉 降 至 容 器 底 部, 采 用 简 便 的 倾 析 法 进 行 分 离 和 洗 涤 如 果 对 沉 淀 进 行 洗 涤, 应 用 去 离 子 水 充 分 搅 拌, 再 沉 降 倾 析, 重 复 2-3 次 即 可 (2) 过 滤 法 分 为 常 压 过 滤 减 压 过 滤 和 热 过 滤 是 常 用 的 过 滤 方 法 a 常 压 过 滤 : 注 意 事 项 :1 滤 纸 的 边 缘 比 漏 斗 的 边 缘 略 代 ;2 倾 入 漏 斗 的 液 面 应 比 滤 纸 的 边 缘 低 1cm; 3 过 滤 之 前 放 放 滤 纸 后 一 定 要 用 水 润 湿 滤 纸, 并 用 手 小 心 按 压 滤 纸 以 赶 出 漏 斗 与 滤 纸 间 的 气 泡 4 过 滤 沉 淀 物 粒 子 细 小 或 具 有 粘 性, 先 静 置, 然 后 过 滤 上 层, 澄 清 部 分, 最 后 把 沉 淀 移 到 滤 纸 上 b 减 压 过 滤 ( 抽 气 过 滤 ): 布 化 漏 斗, 橡 皮 塞 玻 璃 吸 滤 瓶 注 意 事 项 :1 若 用 水 泵, 则 吸 滤 瓶 和 水 泵 之 间 宜 连 接 一 个 缓 冲 瓶, 或 配 有 一 个 二 通 旋 塞, 调 节 旋 塞, 可 以 防 止 水 的 倒 吸 2 若 用 油 泵, 则 吸 滤 瓶 和 油 泵 之 间 应 连 接 吸 收 水 气 的 干 燥 装 置 和 缓 冲 瓶 3 抽 滤 时, 应 先 用 党 课 把 平 铺 在 漏 斗 上 的 滤 纸 润 湿, 然 后 开 动 泵, 进 行 过 滤 操 作, 为 了 把 液 体 尽 量 除 净, 可 用 玻 璃 挤 压 滤 饼 4 滤 饼 洗 涤 时, 要 使 漏 饼 处 于 常 压 状 态, 然 后 再 把 溶 剂 均 匀 洒 在 滤 饼 上, 使 其 盖 住 滤 饼 5 在 停 止 抽 滤 时, 应 该 先 打 开 旋 塞, 然 后 关 闭 抽 气 泵 6 强 酸 或 强 碱 性 溶 液 过 滤 时, 应 用 玻 璃 布 或 涤 纶 布 来 代 替 滤 纸 c 加 热 滤 : 1 使 用 保 温 漏 斗 过 滤 2 为 了 较 好 地 利 用 滤 纸 的 有 效 面 积, 常 使 用 折 叠 式 滤 纸 3 过 滤 时, 漏 斗 中 的 液 体 不 宜 积 得 太 多, 以 免 析 出 晶 体, 堵 塞 漏 斗 4 可 用 强 热 后 的 布 纸 漏 斗 进 行 减 压 过 滤 (3) 离 心 分 离 法 主 要 针 对 被 分 离 的 溶 液 和 沉 淀 量 很 少 的 情 况 注 意 事 项 :1 离 心 试 管 放 入 时 应 遵 守 对 称 的 原 则 ;2 每 支 离 心 管 中 应 盛 有 等 体 积 的 液 体 ;3 离 心 机 起 动 时, 应 逐 渐 加 速, 停 止 离 心 时, 应 让 离 心 机 自 然 停 止 转 动, 以 防 损 坏 离 心 机 加 热 (1) 直 接 加 热 a 液 体 直 接 加 热 根 据 液 体 量 的 多 少 及 蒸 发 快 可 选 择 用 试 管, 烧 杯 和 蒸 发 器 进 行 加 热, 液 体

44 44 注 :1 试 管 中 加 热 液 体 时, 液 体 量 不 能 超 过 试 管 容 积 的 1/3, 试 管 口 不 能 对 着 别 人 或 自 己 ; 加 热 时 先 加 热 液 体 中 部, 后 加 热 底 部 目 的 : 使 液 体 受 热 均 匀 2 烧 杯 加 热 液 体 : 液 体 体 积 占 器 皿 容 积 不 多 于 1/2V; 烧 瓶 加 热 : 液 体 体 积 占 器 皿 容 积 不 多 于 1/3V ; 视 情 况 放 入 几 粒 沸 石, 为 使 加 热 均 匀, 加 热 时 应 垫 上 石 棉 网, 并 伴 以 搅 拌 3 蒸 发 浓 缩 时, 常 用 蒸 发 皿 4 对 于 热 稳 定 的 物 质, 可 直 接 在 火 源 中 加 热 ; 否 则 应 采 用 水 溶 加 热 b 固 体 直 接 加 热 注 : 可 采 用 试 管 坩 埚 马 弗 炉 等, 依 据 加 热 程 度 不 同, 选 择 不 同 的 器 件 1 试 管 加 热 固 体 : 试 管 口 略 朝 下 倾 斜 ; 2 根 据 灼 烧 物 的 性 质 选 择 不 同 材 质 的 坩 埚,( 玻 璃 瓶,Al23, 金 属 器 件 等 ), 加 热 时 先 小 火, 后 大 火 3 加 热 温 度 很 高 不 易 挥 发 的 腐 蚀 性 物 质 时, 可 用 马 弗 炉 进 行 加 热, 可 达 950,1300 ( 更 高 ) (2) 间 接 加 热 水 浴 加 热 :<100 时 可 采 用 水 作 为 热 浴 液 ; 稍 高 于 100, 可 用 无 机 盐 饱 和 水 溶 液 作 为 热 浴 液 锅 内 溶 液 量 2/3V 常 用 的 是 恒 温 水 溶 槽, 加 热 时 应 尽 可 能 使 水 浴 中 水 的 表 面 略 高 于 被 加 热 容 器 内 的 液 面 油 溶 加 热 : 较 高 温 度 下 不 分 解 的 油 类 物 质, 如 石 蜡 油 ( 200 ); 甘 油 ( 220 ); 硅 油 和 真 空 泵 油 ( 250 ) 注 : 1 为 安 全 起 见, 使 用 带 套 电 热 丝 浸 入 油 内, 电 阻 丝 与 电 源 调 压 器 连 接, 以 实 现 非 明 火 控 温 油 浴 加 热 ; 2 应 在 锅 内 加 入 一 支 温 度 计 控 制 温 度 ; 3 操 作 时 不 要 将 水 溅 入 油 浴 锅 内 ; 若 出 严 重 冒 烟 情 况 应 立 即 停 止 加 热 砂 浴 加 热 : 250 用 铁 盘 + 均 匀 细 砂 + 明 火 加 热 间 接 加 热 还 有 盐 浴 硫 酸 浴 等, 但 不 常 用

45 45 3 仪 器 使 用 与 维 护 3.1 电 子 天 平 的 使 用 与 维 护 电 子 天 平 及 其 分 类 人 们 把 用 电 磁 力 平 衡 被 称 物 体 重 力 的 天 平 称 之 为 电 子 天 平 其 特 点 是 称 量 准 确 可 靠 显 示 快 速 清 晰 并 且 具 有 自 动 检 测 系 统 简 便 的 自 动 校 准 装 置 以 及 超 载 保 护 等 装 置 按 电 子 天 平 的 精 度 可 分 为 以 下 几 类 : 1. 超 微 量 电 子 天 平 超 微 量 天 平 的 最 大 称 量 是 2 至 5g, 其 标 尺 分 度 值 小 于 ( 最 大 ) 称 量 的 10-6, 如 Mettler 的 UMT2 型 电 子 天 平 等 属 于 超 微 量 电 子 天 平 2. 微 量 天 平 微 量 天 平 的 称 量 一 般 在 3 至 50g, 其 分 度 值 小 于 ( 最 大 ) 称 量 的 10-5, 如 Mettler 的 AT21 型 电 子 天 平 以 及 Sartoruis 的 S4 型 电 子 天 平

46 46 3. 半 微 量 天 平 半 微 量 天 平 的 称 量 一 般 在 20 至 100g, 其 分 度 值 小 于 ( 最 大 ) 称 量 的 10-5, 如 Mettler 的 AE50 型 电 子 天 平 和 Sartoruis 的 M25D 型 电 子 天 平 等 均 属 于 此 类 4. 常 量 电 子 天 平 此 种 天 平 的 最 大 称 量 一 般 在 100 至 200g, 其 分 度 值 小 于 ( 最 大 ) 称 量 的 10-5, 如 Mettler 的 AE200 型 电 子 天 平 和 Sartoruis 的 A120S A200S 型 电 子 天 平 均 属 于 常 量 电 子 天 平 5. 分 析 天 平 其 实 电 子 分 析 天 平, 是 常 量 天 平 半 微 量 天 平 微 量 天 平 和 超 微 量 天 平 的 总 称 6. 精 密 电 子 天 平 这 类 电 子 天 平 是 准 确 度 级 别 为 Ⅱ 级 的 电 子 天 平 的 统 称 选 购 及 使 用 注 意 事 项 1. 如 何 选 择 电 子 天 平 选 择 电 子 天 平 应 该 从 电 子 天 平 的 绝 对 精 度 ( 分 度 值 e) 上 去 考 虑 是 否 符 合 称 量 的 精 度 要 求 如 选 0.1mg 精 度 的 天 平 或 0.01mg 精 度 的 天 平, 切 忌 不 可 笼 统 地 说 要 万 分 之 一 或 十 万 分 之 一 精 度 的 天 平, 因 为 国 外 有 些 厂 家 是 用 相 对 精 度 来 衡 量 天 平 的, 否 则 买 来 的 天 平 无 法 满 足 用 户 的 需 要 例 如 : 在 实 际 工 作 中 遇 到 这 样 一 个 情 况, 用 一 台 实 际 标 尺 分 度 值 d 为 1mg, 检 定 标 尺 分 度 值 e 为 10mg, 最 大 称 量 为 200g 的 Mettler 电 子 天 平, 用 来 称 量 7mg 的 物 体, 这 样 是 不 能 得 出 准 确 结 果 的 : 在 JJG98-90 非 自 动 天 平 试 行 检 定 规 程 中 规 定, 最 大 允 许 误 差 与 检 定 标 尺 分 度 值 e 为 同 一 数 量 级, 此 台 天 平 的 最 大 允 许 误 差 为 1e, 显 然 不 能 称 量 7mg 的 物 体 ; 称 量 15mg 的 物 体 用 此 类 天 平 也 不 是 最 佳 选 择, 因 为 其 测 试 结 果 的 相 对 误 差 会 很 大, 应 选 择 更 高 一 级 的 天 平, 有 的 厂 家 在 出 厂 时 已 规 定 了 最 小 称 量 的 数 值 因 此 我 们 在 选 购 及 使 用 电 子 天 平 时 必 须 考 虑 精 度 等 级 2. 对 称 量 范 围 的 要 求 选 择 电 子 天 平 除 了 看 其 精 度, 还 应 看 最 大 称 量 是 否 满 足 量 程 的 需 要 通 常 取 最 大 载 荷 加 少 许 保 险 系 数 即 可, 也 就 是 常 用 载 荷 再 放 宽 一 些 即 可, 不 是 越 大 越 好 3. 关 于 电 子 天 平 的 校 准 ( 使 用 前 一 定 要 仔 细 阅 读 说 明 书 ) 对 天 平 进 行 首 次 计 量 测 试 时 误 差 较 大, 究 其 原 因, 相 当 一 部 分 仪 器, 在 较 长 的 时 间 间 隔 内 未 进 行 校 准, 而 且 认 为 天 平 显 示 零 位 便 可 直 接 称 量 ( 需 要 指 出 的 是, 电 子 天 平 开 机 显 示 零 点, 不 能 说 明 天 平 称 量 的 数 据 准 确 度 符 合 测 试 标 准, 只 能 说 明 天 平 零 位 稳 定 性 合 格 因 为 衡 量 一 台 天 平 合 格 与 否, 还 需 综 合 考 虑 其 它 技 术 指 标 的 符 合 性 ) 因 存 放 时 间 较 长, 位 置 移 动, 环 境 变 化 或 为 获 得 精 确 测 量, 天 平 在 使 用 前 一 般 都 应 进 行 校 准 操 作 校 准 方 法 分 为 内 校 准 和 外 校 准 两 种 德 国 生 产 的 沙 特 利 斯, 瑞 士 产 的 梅 特 勒, 上 海 产 的 JA 等 系 列 电 子 天 平 均 有 校 准 装 置 如 果 使 用 前 不 仔 细 阅 读 说 明 书 很 容 易 忽 略 校 准 操 作, 造 成 较 大 称 量 误 差 下 面 以 上 海 天 平 仪 器 厂 JA1203 型 电 子 天 平 为 例 说 明 如 何 对 天 平 进 行 外 校 准

47 47 方 法 : 轻 按 AL 键 当 显 示 器 出 现 AL- 时, 即 松 手, 显 示 器 就 出 现 AL-100 其 中 100 为 闪 烁 码, 表 示 校 准 砝 码 需 用 100g 的 标 准 砝 码 此 时 就 把 准 备 好 100g 校 准 砝 码 放 上 称 盘, 显 示 器 即 出 现 "----" 等 待 状 态, 经 较 长 时 间 后 显 示 器 出 现 g, 拿 去 校 准 砝 码, 显 示 器 应 出 现 0.000g, 若 出 现 不 是 为 零, 则 再 清 零, 再 重 复 以 上 校 准 操 作 ( 注 意 : 为 了 得 到 准 确 的 校 准 结 果 最 好 重 复 以 上 校 准 ) 有 的 人 认 为 在 电 子 天 平 量 程 范 围 内 称 量 的 物 体 越 重 对 天 平 的 损 害 也 就 越 大 这 种 认 识 是 不 完 全 正 确 的 一 般 衡 器 最 大 安 全 载 荷 是 它 所 能 够 承 受 的 不 致 使 其 计 量 性 能 发 生 永 久 性 改 变 的 最 大 静 载 荷 由 于 电 子 天 平 采 用 了 电 磁 力 自 动 补 偿 电 路 原 理, 当 秤 盘 加 载 时 ( 注 意 不 要 超 过 称 量 范 围 ), 电 磁 力 会 将 秤 盘 推 回 到 原 来 的 平 衡 位 置, 使 电 磁 力 与 被 称 物 体 的 重 力 相 平 衡, 只 要 在 允 许 范 围 内 称 量 大 小 对 天 平 的 影 响 是 很 小 的, 不 会 因 长 期 称 重 而 影 响 电 子 天 平 的 准 确 度 天 平 的 使 用 方 法 与 称 量 1. 电 子 天 平 : 高 精 度,0.000lg, 称 量 准 确 迅 速 的 特 点 2. 功 能 键 简 介 :FA1604S 型 号 :N/H 显 示 作 用 天 平 接 通 电 源 后, 预 热 120min 后 再 开 启 显 示 器 TAR: 清 零 去 皮 的 功 能 AL: 天 平 校 准 键 : 如 果 天 平 长 时 间 未 用 或 被 移 动 过, 就 应 对 其 进 行 校 正 方 法 : 按 AL 键, 显 示 AL-100 字 样, 表 示 校 准 砝 码 需 用 100g 的 标 准 砝 码, 将 其 放 上 称 盘, 显 示 等 待 状 态, 经 过 较 长 时 间 后 显 示 g, 取 走 砝 码, 显 示 g, 校 正 完 毕, 否 则 按 TAL 清 零 键 清 零 后 重 复 上 述 操 作 UNT 键 : 量 制 转 换 键 INT 键 : 积 分 时 间 调 整 键 ASD 键 : 灵 敏 度 调 整 键 RNG 键 : 称 量 范 围 转 换 键 3. 注 意 事 项 : 1 称 量 物 质 的 选 择 ( 不 宜 称 量 物 ) 2 量 程 电 子 天 平 的 维 护 与 保 养 1. 将 天 平 置 于 稳 定 的 工 作 台 上 避 免 振 动 气 流 及 阳 光 照 射 2. 在 使 用 前 调 整 水 平 仪 气 泡 至 中 间 位 置 3. 电 子 天 平 应 按 说 明 书 的 要 求 进 行 预 热 4. 称 量 易 挥 发 和 具 有 腐 蚀 性 的 物 品 时, 要 盛 放 在 密 闭 的 容 器 中, 以 免 腐 蚀 和 损 坏 电 子 天 平 5. 经 常 对 电 子 天 平 进 行 自 校 或 定 期 外 校, 保 证 其 处 于 最 佳 状 态

48 如 果 电 子 天 平 出 现 故 障 应 及 时 检 修, 不 可 带 病 工 作 7. 操 作 天 平 不 可 过 载 使 用 以 免 损 坏 天 平 8. 若 长 期 不 用 电 子 天 平 时 应 暂 时 收 藏 为 好 3.2 常 用 PH 计 正 确 使 用 与 维 护 酸 度 计 简 称 ph 计, 由 电 极 和 电 计 两 部 分 组 成 使 用 中 若 能 够 合 理 维 护 电 极 按 要 求 配 制 标 准 缓 冲 液 和 正 确 操 作 电 计, 可 大 大 减 小 ph 示 值 误 差, 从 而 提 高 化 学 实 验 医 学 检 验 数 据 的 可 靠 性 电 极 的 正 确 使 用 与 保 养 目 前 实 验 室 使 用 的 电 极 都 是 复 合 电 极, 其 优 点 是 使 用 方 便, 不 受 氧 化 性 或 还 原 性 物 质 的 影 响, 且 平 衡 速 度 较 快 使 用 时, 将 电 极 加 液 口 上 所 套 的 橡 胶 套 和 下 端 的 橡 皮 套 全 取 下, 以 保 持 电 极 内 氯 化 钾 溶 液 的 液 压 差 下 面 就 把 电 极 的 使 用 与 维 护 简 单 作 一 介 绍 : ⒈ 复 合 电 极 不 用 时, 可 充 分 浸 泡 3M 氯 化 钾 溶 液 中 切 忌 用 洗 涤 液 或 其 他 吸 水 性 试 剂 浸 洗 ⒉ 使 用 前, 检 查 玻 璃 电 极 前 端 的 球 泡 正 常 情 况 下, 电 极 应 该 透 明 而 无 裂 纹 ; 球 泡 内 要 充 满 溶 液, 不 能 有 气 泡 存 在 ⒊ 测 量 浓 度 较 大 的 溶 液 时, 尽 量 缩 短 测 量 时 间, 用 后 仔 细 清 洗, 防 止 被 测 液 粘 附 在 电 极 上 而 污 染 电 极 ⒋ 清 洗 电 极 后, 不 要 用 滤 纸 擦 拭 玻 璃 膜, 而 应 用 滤 纸 吸 干, 避 免 损 坏 玻 璃 薄 膜 防 止 交 叉 污 染, 影 响 测 量 精 度 ⒌ 测 量 中 注 意 电 极 的 银 氯 化 银 内 参 比 电 极 应 浸 入 到 球 泡 内 氯 化 物 缓 冲 溶 液 中, 避 免 电 计 显 示 部 分 出 现 数 字 乱 跳 现 象 使 用 时, 注 意 将 电 极 轻 轻 甩 几 下 ⒍ 电 极 不 能 用 于 强 酸 强 碱 或 其 他 腐 蚀 性 溶 液 ⒎ 严 禁 在 脱 水 性 介 质 如 无 水 乙 醇 重 铬 酸 钾 等 中 使 用 ph 计 的 正 确 校 准 ph 计 因 电 计 设 计 的 不 同 而 类 型 很 多, 其 操 作 步 骤 各 有 不 同, 因 而 ph 计 的 操 作 应 严 格 按 照 其 使 用 说 明 书 正 确 进 行 在 具 体 操 作 中, 校 准 是 ph 计 使 用 操 作 中 的 一 重 要 步 骤 其 校 准 方 法 均 采 用 两 点 校 准 法, 即 选 择 两 种 标 准 缓 冲 液 : 一 种 是 ph7 标 准 缓 冲 液, 第 二 种 是 ph9 标 准 缓 冲 液 或 ph4 标 准 缓 冲 液 先 用 ph7 标 准 缓 冲 液 对 电 计 进 行 定 位, 再 根 据 待 测 溶 液 的 酸 碱 性 选 择 第 二 种 标 准 缓 冲 液 如 果 待 测 溶 液 呈 酸 性, 则 选 用 ph4 标 准 缓 冲 液 ; 如 果 待 测 溶 液 呈 碱 性, 则 选 用 ph9 标 准 缓 冲 液 若 是 手 动 调 节 的 ph 计, 应 在 两 种 标 准 缓 冲 液 之 间 反 复 操 作 几 次, 直 至 不 需 再 调 节 其 零 点 和 定 位 ( 斜 率 ) 旋 钮,pH 计 即 可 准 确 显 示 两

49 49 种 标 准 缓 冲 液 ph 值 则 校 准 过 程 结 束 此 后, 在 测 量 过 程 中 零 点 和 定 位 旋 钮 就 不 应 再 动 若 是 智 能 式 ph 计, 则 不 需 反 复 调 节, 因 为 其 内 部 已 贮 存 几 种 标 准 缓 冲 液 的 ph 值 可 供 选 择 而 且 可 以 自 动 识 别 并 自 动 校 准 但 要 注 意 标 准 缓 冲 液 选 择 及 其 配 制 的 准 确 性 智 能 式 0.01 级 ph 计 一 般 内 存 有 三 至 五 种 标 准 缓 冲 液 ph 值, 如 科 立 龙 公 司 的 KL-016 型 ph 计 等 其 次, 在 校 准 前 应 特 别 注 意 待 测 溶 液 的 温 度 以 便 正 确 选 择 标 准 缓 冲 液, 并 调 节 电 计 面 板 上 的 温 度 补 偿 旋 钮, 使 其 与 待 测 溶 液 的 温 度 一 致 不 同 的 温 度 下, 标 准 缓 冲 溶 液 的 ph 值 是 不 一 样 的 校 准 工 作 结 束 后, 对 使 用 频 繁 的 ph 计 一 般 在 48 小 时 内 仪 器 不 需 再 次 定 标 如 遇 到 下 列 情 况 之 一, 仪 器 则 需 要 重 新 标 定 : ⑴ 溶 液 温 度 与 定 标 温 度 有 较 大 的 差 异 时 ; ⑵ 电 极 在 空 气 中 暴 露 过 久, 如 半 小 时 以 上 时 ; ⑶ 定 位 或 斜 率 调 节 器 被 误 动 ; ⑷ 测 量 过 酸 (ph<2= 或 过 碱 (ph>12) 的 溶 液 后 ; ⑸ 换 过 电 极 后 ; ⑹ 当 所 测 溶 液 的 ph 值 不 在 两 点 定 标 时 所 选 溶 液 的 中 间, 且 距 7pH 又 较 远 时 3.3 移 液 枪 的 使 用 与 维 护 这 种 取 液 器 在 生 化 实 验 中 大 量 地 使 用, 它 们 主 要 用 于 多 次 重 复 的 快 速 定 量 移 液, 可 以 只 用 一 只 手 操 作, 十 分 方 便 移 液 的 准 确 度 ( 即 容 量 误 差 ) 为 ±(0.5%~1.5%), 移 液 的 精 密 度 ( 即 重 复 性 误 差 ) 更 小 些, 为 0.5% 取 液 器 可 分 为 二 种 : 一 种 是 固 定 容 量 的, 常 用 的 有 100μL 等 多 种 规 格 每 种 取 液 器 都 有 其 专 用 的 聚 丙 烯 塑 料 吸 头, 吸 头 通 常 是 一 次 性 使 用, 当 然 也 可 以 超 声 清 洗 后 重 复 使 用, 而 且 此 种 吸 头 还 可 以 进 行 120 高 压 灭 菌 ; 另 一 种 是 可 调 容 量 的 取 液 器, 常 用 的 有 200μL 500 μl 和 1000μL 等 几 种 移 液 器 的 操 作 方 法 可 调 式 自 动 取 液 器 的 操 作 方 法 用 拇 指 和 食 指 旋 转 取 液 器 上 部 的 旋 钮, 使 数 字 窗 口 出 现 所 需 容 量 体 积 的 数 字, 在 取 液 器 下 端 插 上 一 个 塑 料 吸 头, 并 旋 紧 以 保 证 气 密, 然 后 四 指 并 拢 握 住 取 液 器 上 部, 用 拇 指 按 住 柱 塞 杆 顶 端 的 按 钮, 向 下 按 到 第 一 停 点, 将 取 液 器 的 吸 头 插 入 待 取 的 溶 液 中, 缓 慢 松 开 按 钮, 吸 上 液 体, 并 停 留 1~2 秒 钟 ( 粘 性 大 的 溶 液 可 加 长 停 留 时 间 ), 将 吸 头 沿 器 壁 滑 出 容 器, 用 吸 水 纸 擦 去 吸 头 表 面 可 能 附 着 的 液 体, 排 液 时 吸 头 接 触 倾 斜 的 器 壁, 先 将 按 钮 按 到 第 一 停 点, 停 留 一 秒 钟 ( 粘 性 大 的 液 体 要 加 长 停 留 时 间 ), 再 按 压 到 第 二 停 点, 吹 出 吸 头 尖 部 的 剩 余 溶 液, 如 果 不 便 于 用 手 取 下 吸 头, 可 按 下 除 吸 头 推 杆, 将 吸 头 推 入 废 物 缸, 如 图 和 图 1.4

50 50 图 1.1 自 动 取 液 器 的 构 造 图 1.2 自 动 取 液 器 的 使 用 图 1.3 吸 入 溶 液 图 1.4 排 出 溶 液 手 动 取 液 器 的 操 作 方 法 手 动 移 液 器 是 一 种 为 既 准 确 又 精 确 地 采 样 和 分 液 而 设 计 的 移 液 器 手 动 系 列 所 有 移 液 器 的 操 作 都 基 于 空 气 置 换 的 原 理, 并 使 用 一 次 性 移 液 器 吸 头 本 实 验 室 的 移 液 器 量 程 范 围 从 0.5uL 到 1ml 移 液 枪 的 操 作 方 法 : 1. 设 置 移 液 体 积 : 手 柄 的 显 示 窗 清 楚 地 显 示 移 液 器 所 移 液 量 移 液 量 通 过 顺 时 针 或 逆 时 针 旋 转 操 作 按 钮 来 设 置 2. 装 配 吸 头 : 在 装 配 吸 头 前 要 保 证 移 液 嘴 连 件 的 清 洁 将 吸 头 紧 紧 按 在 移 液 器 吸 液 嘴 连 件 上, 确 保 密 封 完 好, 其 标 志 是 在 吸 头 与 黑 色 吸 液 嘴 连 件 形 成 清 晰 的 密 封 圈 3. 吸 液 和 放 液 : 吸 液 时 移 液 器 保 持 竖 直, 吸 头 尖 端 没 入 液 面 下 3 毫 米 以 下 进 行 吸 液 放 液 时 吸 头 尖 端 可 靠 在 容 器 内 壁 慢 吸 慢 放, 始 终 用 拇 指 控 制 按 钮 运 动, 以 保 证 连 贯 一 致 4. 丢 弃 吸 头 : 移 液 后, 用 力 向 下 按 动 推 出 器 推 出 吸 头, 将 吸 头 丢 弃 到 废 物 缸 中 5. 放 置 好 移 液 器 : 移 液 枪 用 完 之 后 要 归 到 最 大 计 量 的 位 置, 并 放 置 在 移 液 器 架 之 上 移 液 器 使 用 注 意 事 项 1. 吸 取 液 体 时 一 定 要 缓 慢 平 稳 地 松 开 拇 指, 绝 不 允 许 突 然 松 开, 以 防 将 溶 液 吸 入 过 快 而 冲 入 取 液 器 内 腐 蚀 柱 塞 而 造 成 漏 气 2. 为 获 得 较 高 的 精 度, 吸 头 需 预 先 吸 取 一 次 样 品 溶 液, 然 后 再 正 式 移 液, 因 为 吸 取 血 清 蛋 白 质 溶 液 或 有 机 溶 剂 时, 吸 头 内 壁 会 残 留 一 层 液 膜, 造 成 排 液 量 偏 小 而 产 生 误 差 3. 浓 度 和 粘 度 大 的 液 体, 会 产 生 误 差, 为 消 除 其 误 差 的 补 偿 量, 可 由 试 验 确 定, 补 偿 量 可 用 调 节 旋 钮 改 变 读 数 窗 的 读 数 来 进 行 设 定 4. 可 用 分 析 天 平 称 量 所 取 纯 水 的 重 量 并 进 行 计 算 的 方 法, 来 校 正 取 液 器,1mL 蒸 馏 水 20 时 重 g. 5. 移 液 器 反 复 撞 击 吸 头 来 上 紧 的 方 法 是 非 常 不 可 取 的, 长 期 操 作 会 使 内 部 零 件 松 散 而

51 51 损 坏 移 液 器 6. 移 液 器 未 装 吸 头 时, 切 莫 移 液 7. 在 设 置 量 程 时, 请 注 意 旋 转 到 所 需 量 程 数 字 清 清 楚 楚 在 显 示 窗 中, 所 设 量 程 在 移 液 器 量 程 范 围 内 不 要 将 按 钮 旋 出 量 程, 否 则 会 卡 住 机 械 装 置, 损 坏 了 移 液 器 8. 移 液 器 严 禁 吸 取 有 强 挥 发 性 强 腐 蚀 性 的 液 体 ( 如 浓 酸 浓 碱 有 机 物 等 ) 9. 严 禁 使 用 移 液 器 吹 打 混 匀 液 体 10. 不 要 用 大 量 程 的 移 液 器 移 取 小 体 积 的 液 体, 以 免 影 响 准 确 度 同 时, 如 果 需 要 移 取 量 程 范 围 以 外 较 大 量 的 液 体, 请 使 用 移 液 管 进 行 操 作 3.4 恒 温 槽 的 安 装 与 调 节 组 成 元 件 恒 温 槽 一 般 由 浴 槽 温 度 控 制 器 继 电 器 加 热 器 搅 拌 器 和 温 度 计 等 组 成 槽 体 ; 温 度 调 节 器 接 点 温 度 计, 发 出 指 令 给 温 度 控 制 器 ; 温 度 控 制 器 是 控 温 的 执 行 机 构, 控 制 加 热 器 和 指 示 灯 的 工 作 继 电 器 ; 加 热 器 ; 搅 拌 器 ; 温 度 指 示 器 1/10 玻 璃 温 度 计 ; 贝 克 曼 温 度 计, 测 量 系 统 温 度 的 变 化 值 超 级 恒 温 槽 : 另 外 还 附 有 循 环 水 泵, 可 实 现 槽 外 系 统 的 温 度 恒 定, 尽 管 避 免 温 度 的 滞 后 现 象 注 :1 除 对 上 述 各 元 件 的 灵 敏 度 有 一 定 要 求 外, 还 应 注 意 各 元 件 在 恒 温 槽 中 的 布 局 的 合 理 性 ; 2 适 用 温 度 20-50,( 水 作 恒 温 介 质 );50 90 时, 可 在 水 面 上 加 少 许 炼 油 厂 的 白 油 ( 一 种 石 油 馏 分 ), 以 防 止 水 的 蒸 发 ; 90, 甘 油 白 油 或 其 他 的 沸 点 物 作 为 恒 温 介 质 3 更 高 温 的 恒 温 槽 可 采 用 空 气 浴 盐 浴 金 属 浴 等 4 0 o 以 下 的 可 采 用 盐 水 做 工 作 物 质 装 置 简 图 恒 温 技 术 原 理 温 度 对 物 理 化 学 的 各 种 参 量 和 化 学 反 应 有 着 显 著 的 影 响, 因 此 许 多 实 验 工 作 都 要 在 某 一 恒 温 温 度 下 进 行 恒 温 控 制 可 分 为 两 类, 一 类 是 利 用 物 质 的 相 变 点 温 度 来 获 得 恒 温, 如 冰 水 混 合 物 (0 ) 液 氮 (77.3 ) 沸 点 丙 酮 (56.5 ) 沸 点 萘 (56.5 ) 等 另 一 类 是 利 用 电 子 调 节 器 加 以 自 动 调 节 在 近 代 实 验 技 术 中 普 遍 应 用 后 者 其 优 点 是 温 度 可 以 任 意 选 定, 控 温 精 度 高 操 作

52 52 1. 将 蒸 馏 水 注 入 玻 璃 缸 内, 按 图 1-1 安 装 好 温 度 计 搅 拌 器 接 触 温 度 计 和 恒 温 控 制 器 ( 即 晶 体 管 继 电 器 ), 接 好 线 路, 经 教 师 检 查 后 接 通 电 源 2. 调 节 恒 温 槽 的 温 度 开 启 继 电 器, 开 动 搅 拌 器, 将 与 加 热 器 相 联 的 调 压 变 压 器 调 到 220V 或 某 指 定 值, 调 节 水 银 接 点 温 度 计, 使 其 标 铁 上 端 与 辅 助 温 度 标 尺 的 温 度 示 值 所 需 控 制 的 温 度 低 1~2, 及 时 锁 住 固 定 螺 丝 这 时, 继 电 器 的 红 色 指 示 灯 表 示 加 热 器 工 作 ; 直 到 继 电 器 的 绿 色 指 示 灯 亮, 表 示 加 热 器 停 止 加 热 观 察 槽 中 的 精 密 温 度 计, 根 据 其 与 所 需 控 制 温 度 的 差 距, 进 一 步 调 节 水 银 接 点 温 度 计 中 金 属 丝 的 位 置 细 心 地 反 复 调 节, 直 至 在 红 绿 交 替 出 现 期 间, 精 密 温 度 计 的 示 值 恒 定 在 所 需 控 制 的 温 度 为 止 ( 第 一 个 指 定 温 度 为 25.0, 冬 季 可 取 20.0, 夏 季 可 取 30.0 ) 最 后 将 固 定 螺 丝 锁 紧, 使 磁 铁 不 再 转 动 分 别 将 恒 温 槽 调 节 到 两 个 温 度 下 进 行 恒 温 (1) 恒 温 槽 灵 敏 度 的 测 定 a. 根 据 恒 温 槽 的 指 定 温 度, 调 节 好 贝 克 曼 温 度 计, 使 其 在 指 定 温 度 时 的 示 值 在 2~3 刻 度 间 将 已 经 调 好 的 贝 克 曼 温 度 计 置 入 恒 温 槽 内, 安 放 在 精 密 温 度 计 旁 边 b. 观 察 恒 温 槽 的 温 度 的 微 小 变 化 每 隔 2min 记 录 一 次 温 度 ( 同 时 读 取 贝 克 曼 温 度 计 和 精 密 温 度 计 的 示 值 ), 共 记 录 60min( 至 少 测 定 温 度 波 动 的 三 个 周 期 ) 记 录 好 温 度 的 波 动 情 况, 每 个 恒 温 温 度 下 分 别 测 定 三 次 以 时 间 为 横 坐 标, 以 温 度 为 纵 坐 标, 绘 制 该 恒 温 温 度 下 的 温 度 - 时 间 曲 线 ; 取 最 高 温 度 和 最 低 温 度 计 算 恒 温 槽 的 灵 敏 度 本 实 验 还 可 以 使 用 一 种 市 售 的 玻 璃 恒 温 槽, 它 与 本 实 验 组 装 的 恒 温 槽 具 有 相 似 的 构 造 和 灵 敏 度, 所 不 同 的 是 用 热 电 偶 作 为 感 温 元 件, 采 用 键 入 式 设 定 恒 温 温 度 和 灵 敏 度, 其 使 用 方 法 见 本 实 验 的 附 录 3 SWQ 智 能 数 字 恒 温 控 制 器 图 1-1 恒 温 水 浴 的 控 温 示 意 图 本 实 验 是 应 用 电 子 继 电 器 和 电 接 点 温 度 计 共 同 完 成 控 温 目 的 的 如 图 1-1 所 示, 电 接 点 温 度 计 (Tr) 有 两 个 电 极, 其 中 一 个 电 极 是 可 调 电 极, 由 上 部 伸 入 毛 细 管 内, 末 端 可 由 磁 性 螺 旋 杆 随 意 调 节 ; 另 一 个 电 极 为 固 定 电 极, 它 伸 入 温 度 计 底 部 与 水 银 柱 相 接 这 样, 将 电 接 点 温 度 计 置 于 水 浴 中, 利 用 磁 性 螺 旋 杆 可 将 标 铁 调 节 到 欲 控 制 的 温 度 上 当 水 浴 中 的 液 体

53 53 温 度 升 高 时, 水 银 柱 上 升, 两 极 导 通, 反 之 则 断 开 两 电 极 的 通 断 又 影 响 着 电 子 继 电 器 ( 虚 线 框 部 分 ) 中 通 过 线 圈 J 的 电 流 的 大 小 J 的 电 流 大 时, 则 产 生 的 磁 力 强, 克 服 弹 簧 (S) 的 弹 力 而 吸 下 开 关 K 使 加 热 器 (H) 导 通 工 作, 反 之 则 停 止 加 热 恒 温 槽 的 灵 敏 度 及 其 测 定 恒 温 槽 的 灵 敏 度 是 衡 量 恒 温 槽 恒 温 性 能 好 坏 的 主 要 标 志 灵 敏 度 与 水 银 接 点 温 度 计 中 毛 细 管 的 粗 细, 金 属 丝 与 水 银 接 触 处 是 否 清 洁, 搅 拌 器 的 效 果, 加 热 器 功 率 的 大 小, 恒 温 槽 的 体 积 大 小 及 其 热 量 散 失, 继 电 器 的 灵 敏 度 等 诸 多 因 素 有 关 为 了 测 定 恒 温 槽 的 灵 敏 度, 可 在 指 定 温 度 下, 采 用 贝 克 曼 温 度 计 来 测 定 恒 温 槽 温 度 的 微 小 变 化, 作 出 恒 温 槽 温 度 T 随 时 间 t 变 化 的 曲 线, 如 图 1-1 所 示 图 1-1 曲 线 a 表 示 恒 温 槽 的 灵 敏 度 良 好, 温 度 的 波 动 极 微 小 ; 曲 线 b 表 示 灵 敏 度 较 差, 需 要 更 换 较 灵 敏 的 水 银 接 点 温 度 计 ; 曲 线 c 表 示 加 热 器 的 功 率 太 大 ; 曲 线 d 表 示 加 热 器 的 功 率 太 小 图 1-2 恒 温 槽 的 灵 敏 度 曲 线 若 灵 敏 度 曲 线 上 的 最 高 温 度 为 T 高, 最 低 温 度 为 T 低, 则 恒 温 槽 的 灵 敏 度 TE 可 表 示 为 T F = ±(T 高 -T 低 )/2 (1-1) 槽 温 是 由 槽 内 的 0.1 分 度 的 精 密 温 度 计 指 示 的, 以 T 表 示, 则 恒 温 槽 的 温 度 以 T±TE 表 示 附 录 1 贝 克 曼 温 度 计 的 构 造 与 使 用 贝 克 曼 温 度 计 是 水 银 温 度 计 的 一 种, 它 的 构 造 见 图 1-3 它 的 主 要 特 点 如 下 : (1) 贝 克 曼 温 度 计 的 标 尺 刻 度 精 细 1 间 隔 约 长 5cm, 中 间 分 为 100 等 分, 故 可 以 直 接 读 出 0.01 如 果 用 放 大 镜 观 察, 可 以 估 计 到 0.002, 测 量 精 度 较 高 (2) 贝 克 曼 温 度 计 上 的 标 度 通 常 只 有 5, 所 以 量 程 较 短 (3) 贝 克 曼 温 度 计 的 测 温 水 银 球 内 的 水 银 储 量 可 以 借 助 顶 端 的 水 银 贮 槽 来 调 节, 所 以 可 以 在 不 同 的 温 度 范 围 内 应 用 之

54 54 (4) 由 于 贝 克 曼 温 度 计 的 水 银 球 内 的 水 银 贮 量 可 以 改 变, 所 以 其 示 值 不 是 温 度 的 绝 对 数 值, 只 能 在 量 程 范 围 内 精 密 地 表 示 出 体 系 的 温 度 变 化 的 温 差 ( ) 银 量 贝 克 曼 温 度 计 在 使 用 前 需 要 根 据 待 测 体 系 的 温 度 及 温 差 值 的 大 小 来 调 节 水 银 球 中 的 水 调 节 方 法 如 下 : (1) 确 定 所 使 用 的 温 度 范 围 通 常 我 们 要 测 量 的 温 度 变 化 类 型 大 致 有 三 类 : 第 一 类 是 测 量 温 度 降 低 ; 第 二 类 是 测 量 温 度 升 高 ; 第 三 类 是 测 量 温 度 的 波 动 若 为 温 度 降 低 的 实 验 ( 如 凝 固 点 降 低 法 测 定 物 质 的 摩 尔 质 量 ), 则 水 银 柱 指 示 的 起 始 温 度 应 调 节 在 4 左 右 ; 若 为 温 度 升 高 的 实 验 ( 如 燃 烧 热 的 测 定 ), 则 水 银 柱 指 示 的 起 始 温 度 应 调 节 在 1 左 右 ; 若 为 温 度 波 动 的 实 验 ( 如 丙 三 醇 粘 度 的 测 定 ), 则 水 银 柱 指 示 的 起 始 温 度 应 调 节 在 2.5 左 右 (2) 进 行 水 银 贮 量 的 调 节 水 银 贮 量 的 调 节 方 法 有 两 种, 第 一 种 方 法 是 恒 温 浴 调 节 法, 第 二 种 是 标 尺 读 数 法 现 以 考 察 恒 温 槽 恒 温 性 能 为 例 介 绍 恒 温 浴 调 节 法 的 操 作 方 法 设 恒 温 槽 的 恒 温 温 度 T=303.2K, 希 望 贝 克 曼 温 度 计 上 的 示 值 为 2.5 左 右 处 其 调 节 的 步 骤 如 下 : 1 估 计 水 银 液 面 在 2.5 处 到 毛 细 管 弯 头 处 (b) 点 的 温 度 值 ( 即 刻 度 数 )T X ( 参 看 图 1-3) 由 两 部 分 组 成 即 其 中 是 2.5 处 到 水 银 柱 刻 度 的 最 高 点 (a) 这 一 段 的 温 度 读 数, 它 可 由 温 度 计 的 刻 度 准 确 读 取 的, = = 3.5 是 a 点 到 毛 细 管 弯 头 处 (b) 点 这 一 段 的 温 度 计 的 读 数, 由 于 这 一 段 的 水 银 毛 细 管 没 有 刻 度, 因 而 只 能 对 照 有 刻 度 的 毛 细 管 来 估 计, 一 般 说 来 =2.5 左 右 所 以 = + = = 6 2 设 法 使 下 部 的 水 银 球 中 的 水 银 与 上 部 的 水 银 贮 槽 中 的 水 银 连 接 起 来 将 贝 克 曼 温 度 计 浸 在 温 度 较 高 (70~80 ) 的 恒 温 水 浴 中, 使 毛 细 管 内 的 水 银 上 升 到 毛 细 管 弯 头 处 (b) 点, 并 在 球 形 出 口 处 形 成 滴 状, 然 后 从 水 浴 中 取 出 贝 克 曼 温 度 计, 将 其 倒 置, 使 水 银 贮 槽 中 的 水 银 与 毛 细 管 中 的 水 银 连 接 起 来, 然 后 将 贝 克 曼 温 度 计 正 立 起 来 3 另 用 一 恒 温 水 浴, 将 其 温 度 调 节 到 b 点 所 需 要 的 温 度 ( 温 度 为, 即 = 309.2K) 将 贝 克 曼 温 度 计 置 于 该 水 浴 中, 恒 温 5~10min 4 从 水 浴 中 取 出 贝 克 曼 温 度 计, 以 右 手 紧 握 它 的 中 部, 使 贝 克 曼 温 度 计 垂 直, 用 左 手 的 虎 口 由 下 往 上 撞 击 右 手 腕, 水 银 柱 即 可 在 弯 头 处 (b 点 ) 断 开 这 一 动 作 要 迅 速, 且 要 远 离 实 验 台, 以 免 碰 坏 温 度 计 ⑸ 将 调 好 的 贝 克 曼 温 度 计 置 于 欲 测 温 度 (303.2K) 恒 温 水 浴 中, 观 察 水 银 柱 是 否 停 在 2.5 处 左 右 若 有 较 大 的 偏 差 时, 应 该 重 复 上 述 的 操 作, 直 到 达 到 要 求 为 止 由 于 贝 克 曼 温 度 计 是 由 薄 玻 璃 制 成 的, 尺 寸 也 较 大, 易 坏 所 以 一 般 只 将 贝 克 曼 温 度 计 放 置 三 处 : 其 一,( 不 使 用 时,) 置 于 温 度 计 的 盒 中 ; 其 二 损,( 调 节 时,) 握 在 手 中, 不 应 该 随 意 搁 置 ; 其 三,( 使 用 时,) 安 装 在 使 用 的 仪 器 上 调 节 贝 克 曼 温 度 计 时, 注 意 勿 使 其 受 到 剧 热 或 骤 冷, 还 应 避 免 受 到 重 击 已 经 调 节 好 的 贝 克 曼 温 度 计, 注 意 勿 使 毛 细 管 中 的 水 银 柱

55 55 再 与 温 度 计 上 部 的 贮 槽 中 的 水 银 相 连 接 目 前 实 验 室 逐 渐 以 精 密 数 字 温 差 仪 取 代 贝 克 曼 温 度 计 精 密 数 字 温 差 仪 具 有 操 作 简 单, 使 用 方 便 等 优 点, 详 细 情 况 请 参 阅 后 面 的 附 录 附 录 2 晶 体 管 继 电 器 电 路 图 图 1-4 晶 体 管 继 电 器 的 电 路 图 T- 电 源 变 压 器 ; D 1 D 2 D 3 D 4-2AP3 晶 体 二 级 管 ; J-121 型 灵 敏 继 电 器 ;L 1 - 工 作 指 示 氖 泡 ;L 2 - 电 源 指 示 灯 泡 图 1-4 中 的 1,2 点 与 接 触 温 度 计 相 连 接, 当 接 触 温 度 计 中 水 银 柱 与 钨 丝 触 针 未 接 触 时, 1,2 点 断 路, 三 极 管 的 集 电 极 电 流 使 继 电 器 工 作, 电 加 热 器 通 电 加 热, 恒 温 槽 的 温 度 上 升 当 温 度 达 到 所 需 要 的 恒 定 温 度 时, 水 银 柱 便 与 钨 丝 触 针 接 触,1,2 点 短 路, 这 时 基 极 电 流 为 零, 集 电 极 电 流 极 小, 继 电 器 将 衔 铁 放 开, 电 加 热 器 停 止 加 热, 恒 温 槽 的 温 度 开 始 下 降 当 水 银 柱 与 触 针 再 次 断 开 时, 集 电 极 电 流 增 大, 继 电 器 将 重 新 加 热 这 样 反 复 进 行, 就 使 恒 温 槽 的 水 温 恒 定 于 某 一 温 度 下 一 般 控 制 的 温 度 波 动 范 围 在 ±0.0~0.01K, 进 一 步 的 改 进, 可 达 ±0 001K

56 56 附 录 3 SWQ 智 能 数 字 恒 温 控 制 器 从 本 实 验 的 内 容 中 我 们 了 解 到, 恒 温 槽 的 恒 温 性 能 主 要 取 决 于 感 温 元 件 和 恒 温 控 制 器, 接 触 温 度 计 的 调 节 是 恒 温 准 确 与 否 的 关 键 接 触 温 度 计 的 构 造 简 单, 通 过 它 很 容 易 理 解 恒 温 原 理 近 年 来, 由 于 实 验 技 术 的 发 展, 这 种 调 节 技 术 被 数 字 式 恒 温 控 制 器 的 键 盘 输 入 所 取 代, 使 恒 温 操 作 更 加 简 单, 克 服 了 人 为 因 素 对 恒 温 效 果 的 影 响 SWQ 智 能 数 字 恒 温 控 制 器 是 通 过 微 处 理 器 对 温 度 传 感 器 ( 热 电 偶 ) 的 信 号 进 行 线 性 补 偿, 利 用 数 字 信 号 处 理 技 术 进 行 恒 温 控 制, 采 用 键 入 式 温 度 设 定, 可 以 人 为 地 设 定 恒 温 槽 的 灵 敏 度 ( 回 差 ) 其 操 作 面 板 如 图 1-5 所 示 SWQ 智 能 数 字 恒 温 控 制 器 的 使 用 方 法 如 下 : 1. 将 热 电 偶 插 入 恒 温 介 质 中, 电 源 开 关 置 于 开, 此 时 恒 温 指 示 灯 亮, 左 边 LED 显 示 为 介 质 温 度, 右 边 LED 显 示 为 恒 温 温 度 的 设 置 例 如 欲 将 恒 温 槽 调 节 到 18.0 按 动 设 定 键, 右 边 LED 的 十 位 数 字 闪 烁, 再 按 键 位 将 逐 次 显 示 0 1, 至 显 示 1 时 停 止 按 动 键 按 动 设 定 键, 右 边 LED 的 个 位 数 字 闪 烁, 再 按 键, 此 位 将 逐 次 显 示 9 8, 至 显 示 8 时 停 止 按 动 键 按 动 设 定 键, 右 边 LED 的 最 后 一 位 0 数 字 闪 烁, 再 按 设 定 键, 工 作 指 示 灯 亮 此 时 右 边 LED 显 示 值 即 为 设 定 温 度 值 打 开 玻 璃 恒 温 水 浴 ( 其 操 作 面 板 如 图 1-6 所 示 ) 的 加 热 器 开 关 和 水 搅 拌 开 关, 恒 温 槽 的 温 度 将 逐 渐 升 高 在 玻 璃 恒 温 水 浴 升 温 的 过 程 中, 可 将 加 热 器 功 率 置 于 强 位 置, 恒 温 时 置 于 弱 位 置 需 要 快 搅 拌 时 水 搅 拌 开 关 置 于 快 位 置, 通 常 情 况 下 置 于 慢 位 置 即 可 4. 回 差 温 度 的 设 置

57 57 按 回 差 键, 回 差 将 依 次 显 示 , 达 到 回 差 温 度 的 设 置 当 介 质 温 度 小 于 设 定 ( 温 度 - 回 差 ) 温 度 时, 加 热 器 处 于 加 热 状 态 ; 当 介 质 温 度 大 于 设 定 ( 温 度 + 回 差 ) 温 度 时, 加 热 器 停 止 加 热 由 此 可 见, 此 回 差 即 为 恒 温 槽 的 灵 敏 度 5. 实 验 结 束 后, 关 闭 加 热 器 开 关 水 搅 拌 开 关 和 恒 温 控 制 器 开 关 3.5 超 声 波 仪 的 使 用 与 维 护 概 述 超 声 波 清 洗 是 利 用 超 声 波 在 液 体 中 的 空 化 作 用 来 完 成 的 超 声 波 发 生 器 产 生 的 电 信 号, 通 过 换 能 器 传 入 清 洗 液 中, 会 连 续 不 断 地 迅 速 形 成 和 迅 速 闭 合 无 数 的 微 小 气 泡, 这 种 过 程 所 生 的 强 大 机 械 力, 不 断 冲 击 物 件 表 面, 加 之 超 声 波 在 液 体 中 有 加 速 溶 解 和 乳 化 作 用, 使 物 件 表 面 及 缝 隙 中 的 污 垢 迅 速 剥 落, 从 而 达 到 清 洗 目 的 超 声 波 清 洗 器 已 被 广 泛 地 用 于 金 属 电 镀 塑 胶 电 子 机 械 汽 车 等 各 工 业 部 门 以 及 医 药 大 专 院 校 和 各 实 验 室 等 超 声 空 化 效 应 与 超 声 波 的 声 强 声 压 频 率, 清 洗 液 的 表 面 张 力 蒸 汽 压 粘 度 以 及 被 洗 工 件 的 声 学 特 征 有 关, 声 强 愈 高, 空 化 愈 强 烈, 有 利 于 清 洗 ; 空 化 阈 值 和 频 率 有 密 切 关 系, 目 前 超 声 波 清 洗 器 的 工 作 频 率 根 据 清 洗 对 象, 大 致 分 为 三 个 频 段 : 低 频 超 声 清 洗 (20-50KHz), 高 频 超 声 清 洗 (50-200KHz) 和 兆 赫 超 声 清 洗 (700KHz-1MHz 以 上 ) 低 频 超 声 清 洗 适 用 于 大 部 件 表 面 或 者 污 物 和 清 洗 件 表 面 结 合 强 度 高 的 场 合 频 率 的 低 端, 空 化 强 度 高, 易 腐 蚀 清 洗 件 表 面, 不 适 宜 清 洗 表 面 光 洁 度 高 的 部 件, 而 且 空 化 噪 声 大 60KHz 左 右 的 频 率, 穿 透 力 较 强, 宜 清 洗 表 面 形 状 复 杂 或 有 盲 孔 的 工 件, 空 化 噪 声 较 小, 但 空 化 强 度 较 低, 适 合 清 洗 表 面 污 垢 与 被 清 洗 件 表 面 结 合 力 较 弱 的 场 合 高 频 超 声 清 洗 适 用 与 计 算 机 微 电 子 元 件 的 精 细 清 洗, 如 磁 盘 驱 动 器 读 写 头 液 晶 玻 璃 及 平 面 显 示 器, 微 组 件 和 抛 光 金 属 件 等 的 清 洗 这 些 清 洗 对 象 要 求 在 清 洗 过 程 中 不 能 受 到 空 化 腐 蚀, 要 能 洗 掉 微 米 级 的 污 物 兆 赫 超 声 清 洗 适 用 与 集 成 电 路 芯 片 硅 片 及 薄 膜 等 的 清 洗 能 去 除 微 米 亚 微 米 级 的 污 物 而 对 清 洗 件 没 有 任 何 的 损 伤 因 为 此 时 不 产 生 空 化, 其 清 洗 机 理 主 要 是 声 压 梯 度 粒 子 速 度 和 声 流 的 作 用 清 洗 剂 的 选 择 要 从 污 物 的 性 质 和 有 利 于 超 声 清 洗 两 个 方 面 考 虑 清 洗 液 的 静 压 力 大 时, 不 容 易 产 生 空 化, 所 有 在 密 闭 加 压 容 器 中 进 行 超 声 清 洗 或 处 理 时 效 果 较 差 清 洗 液 的 流 动 速 度 对 超 声 清 洗 效 果 也 有 很 大 影 响 最 好 是 在 清 洗 过 程 中 液 体 静 止 不 流 动, 这 时 泡 的 生 长 和 闭 合 运 动 能 够 充 分 完 成 如 果 清 洗 液 的 流 速 过 快, 则 有 些 空 化 核 会 被 流 动 的 液 体 带 走 ; 有 些 空 化 核 则 没 有 在 到 生 长 闭 合 运 动 整 过 程 时 就 离 开 声 场, 因 而 使 总 的 空 化 强 度 降 低 在 实 际 清 洗 过 程 中 有 时 为 避 免 污 物 重 新 粘 附 在 清 洗 件 上, 清 洗 液 需 要 不 断 流 动 更 新, 此 时 应 注 意 清 洗 液 的 流 动 速 度 不 能 过 快, 以 免 降 低 清 洗 效 果

58 58 被 清 洗 件 的 声 学 特 性 和 清 洗 槽 中 的 排 列 对 清 洗 效 果 也 有 较 大 影 响 吸 声 大 的 清 洗 件, 如 橡 胶 布 料 等 清 洗 效 果 差, 而 对 声 反 射 强 的 清 洗 件, 如 金 属 件 玻 璃 制 品 的 清 洗 效 果 好 清 洗 件 面 积 小 的 一 面 应 朝 声 源 排 放, 排 列 要 有 一 定 的 间 距 清 洗 件 不 能 直 接 放 在 清 洗 槽 底 部, 尤 其 是 较 重 的 清 洗 件, 以 免 影 响 槽 底 板 的 震 动, 也 避 免 清 洗 件 擦 伤 底 板 而 加 速 空 化 腐 蚀 清 洗 件 最 好 是 悬 挂 在 槽 中, 或 用 金 属 箩 筐 盛 好 悬 挂, 但 需 注 意 要 用 金 属 丝 做 成, 并 尽 可 能 用 细 丝 做 成 空 格 较 大 的 筐, 以 减 少 声 的 吸 收 和 屏 蔽 清 洗 液 中 气 体 的 含 量 对 超 声 波 清 洗 效 果 也 有 影 响 在 清 洗 液 中 如 果 有 残 存 气 体 ( 非 空 化 核 ) 会 增 加 声 传 播 损 失, 在 开 机 时 先 进 行 低 于 空 化 阈 值 的 功 率 水 平 作 震 动, 减 少 清 洗 液 中 的 残 存 气 体 要 得 到 良 好 的 清 洗 效 果, 必 须 选 择 适 当 的 声 学 参 数 和 清 洗 液 使 用 须 知 在 使 用 超 声 波 清 洗 器 之 前, 敬 请 仔 细 阅 读 并 严 格 遵 守 以 下 注 意 事 项 1 防 止 触 电 只 有 在 良 好 接 地 的 情 况 下 才 能 作 用 清 洗 器 在 倒 入 或 倒 出 溶 液 之 前 应 拔 去 电 源 插 头 必 须 由 专 业 人 员 打 开 清 洗 器 2 避 免 人 员 伤 亡 和 财 产 损 失 只 能 使 用 水 溶 清 洗 液 不 要 使 用 酒 精 汽 油 或 其 他 易 燃 溶 液, 以 免 引 起 爆 炸 或 火 灾 不 要 使 用 各 种 强 酸 强 碱 等 腐 蚀 性 溶 液, 以 免 腐 蚀 损 坏 清 洗 槽 不 要 用 手 接 触 清 洗 槽 或 溶 液, 它 们 可 能 是 高 温 烫 手 的 不 要 让 清 洗 溶 液 的 温 度 超 过 防 止 设 备 损 坏 槽 内 无 清 洗 液 的 情 况 下 不 能 开 机 工 作 液 面 放 至 建 议 水 位 线 并 随 时 根 据 放 入 槽 内 的 被 工 作 物 件 的 多 少, 来 调 整 液 面, 保 持 液 面 至 建 议 水 位 线 不 要 把 被 洗 物 直 接 放 在 清 洗 槽 底 部, 应 把 它 们 悬 挂 起 来 或 放 在 托 架 上, 不 然 会 损 坏 换 能 器 定 期 更 换 清 洗 液 4 不 要 把 新 式 廉 价 的 珠 宝 饰 品 放 入 清 洗 槽 内 清 洗, 热 和 震 动 的 组 合 作 用 可 能 会 使 其 固 定 连 接 部 分 松 脱 不 要 清 洗 翡 翠 珍 珠 猫 眼 石 珊 瑚 和 绿 松 石 这 类 有 自 然 裂 纹 的 东 西 5 清 洗 溶 液 应 定 期 更 换, 否 则 清 洗 下 来 的 污 垢 会 聚 合 成 颗 粒 沉 积 在 槽 底, 这 会 消 弱 超 声 的 清 洗 作 用 此 外, 许 多 溶 液 经 过 一 定 时 间 会 失 去 清 洗 效 果, 因 此 需 要 及 时 补 充

59 清 洗 方 法 1 清 洗 方 法 (1) 直 接 清 洗 放 水 和 清 洗 液 于 清 洗 槽 内, 把 被 洗 物 件 放 在 托 架 ( 清 洗 网 架 ) 上, 并 使 其 下 降 到 槽 内, 也 可 用 吊 架 把 被 洗 物 件 悬 吊 起 来, 并 侵 入 到 清 洗 液 中 (2) 间 接 清 洗 放 水 和 清 洗 液 于 清 洗 槽 内, 把 所 需 的 化 学 清 洗 剂 倒 入 烧 杯 或 其 它 合 适 的 容 器 内, 并 将 被 洗 物 侵 入 其 中 然 后 把 装 有 化 学 清 洗 剂 和 被 洗 物 的 容 器 浸 入 到 槽 内 注 意 一 定 不 能 让 这 类 容 器 触 碰 槽 底 直 接 和 间 接 两 种 清 洗 方 法, 它 们 各 有 优 劣, 如 果 不 知 道 选 择 哪 种 方 法 更 好, 可 在 进 行 清 洗 效 果 试 验 后 再 作 选 择 直 接 清 洗 的 优 点 是 清 洗 效 率 高 并 便 于 操 作 间 接 清 洗 的 优 点 是 能 够 清 楚 的 看 到 存 留 在 烧 杯 内 的 清 除 出 来 的 污 垢, 便 于 对 它 们 进 行 过 滤 或 抛 弃, 内 同 时 使 用 二 种 或 更 多 的 清 洗 溶 剂 2 漂 洗 干 燥 (1) 对 被 洗 物 进 行 漂 洗 以 去 除 残 留 在 其 表 面 的 化 学 清 洗 剂 (2) 可 用 压 缩 空 气 热 吹 风 机 或 烘 箱 对 被 洗 物 进 行 干 燥 (3) 超 声 清 洗 会 洗 去 被 洗 物 表 面 的 防 锈 油, 因 此 有 必 要 在 清 洗 之 后 涂 上 防 锈 油 清 洗 器 的 使 用 1 确 保 所 用 电 源 电 压 与 清 洗 器 标 牌 上 标 明 的 电 压 一 致, 并 有 良 好 接 地 时 插 上 电 源 插 头 2 选 择 清 洗 方 法 (1) 直 接 清 洗 : 在 清 洗 器 槽 内 放 置 托 架 水 和 清 洗 液, 把 被 洗 物 件 放 在 托 架 上, 也 可 用 吊 架 把 被 洗 物 件 悬 吊 起 来, 并 侵 入 到 清 洗 液 中 (2) 间 接 清 洗 : 放 水 和 清 洗 液 于 清 洗 槽 内, 把 所 需 的 化 学 清 洗 剂 倒 入 烧 杯 或 其 它 合 适 的 容 器 内, 并 将 被 洗 物 侵 入 其 中 然 后 把 装 有 化 学 清 洗 剂 和 被 洗 物 的 容 器 侵 入 到 槽 内 3 根 据 放 入 槽 内 的 被 工 作 物, 调 整 液 面, 确 保 液 面 至 建 议 水 位 线 4 把 定 时 调 在 适 当 的 时 间 上, 由 于 清 洗 对 象 不 同, 所 化 的 清 洗 时 间 也 有 很 大 不 同, 大 部 分 物 件 一 般 清 洗 几 分 钟, 有 些 物 件 可 能 需 要 时 间 长 一 些 具 体 时 间 可 通 过 实 验 确 定 5 打 开 开 关, 并 等 2-5 分 钟 使 清 洗 器 溶 液 脱 气 脱 气 过 程 仅 须 在 每 天 开 始 清 洗 前 或 更 换 液 体 后 进 行 6 清 洗 结 束 后, 如 有 必 要 可 用 清 水 漂 洗 本 实 验 室 数 控 声 波 清 洗 器 :SB2200-T 和 KQ-300DE 型 KQ-300DE 型 使 用 注 意 事 项 :

60 60 a. 不 能 将 物 件 直 接 放 入 清 洗 槽 内, 以 免 影 响 清 洗 效 果, 同 时 会 损 坏 仪 器 ; b. 清 洗 槽 内 加 入 的 水 或 水 溶 液 最 低 不 得 低 于 100mm, 而 最 高 不 得 超 过 130mm 的 水 位 ; c. 所 希 望 的 操 作 温 度 在 之 间, 低 于 20 会 发 出 一 种 特 定 的 蜂 鸣 声 ; 一 般 工 作 清 洗 要 求 水 温 在 60 左 右 ; d. 超 声 功 率 要 求 在 40%-100% 之 间, 一 般 物 件 要 求 清 洗 的 功 率 设 定 在 100% 清 洗 槽 内 严 禁 直 接 放 入 酒 精 丙 酮 汽 油 等 易 燃 溶 液 以 及 强 酸 强 碱 等 腐 蚀 性 溶 液 如 果 必 须 使 用 上 述 溶 液, 建 议 使 用 间 接 清 洗 法 3.6 离 心 机 的 使 用 与 维 护 离 心 机 类 型 1. 普 通 离 心 机 2. 高 速 离 心 机 3. 超 高 速 离 心 机 1 制 备 性 超 速 离 心 机 主 要 由 驱 动 和 速 度 控 制 温 度 控 制 真 空 系 统 和 转 头 四 部 分 组 成 2 分 析 性 超 速 离 心 机 分 析 性 超 速 离 心 机 使 用 了 特 殊 设 计 的 转 头 和 检 测 系 统, 以 便 连 续 地 监 视 物 质 在 一 个 离 心 场 的 沉 降 过 程 操 作 注 意 事 项 离 心 机 工 作 时 是 高 速 运 转, 使 用 时 要 注 意 安 全, 必 须 做 到 以 下 几 点 : 1. 离 心 机 使 用 时 要 放 置 在 平 稳 坚 固 的 台 面 上 < 它 的 底 座 都 装 有 橡 胶 吸 脚, 借 助 于 大 气 压 力 及 仪 器 本 身 的 重 量, 紧 贴 于 台 面 ); 大 容 量 低 速 离 心 机 和 高 速 冷 冻 离 心 机 要 相 应 地 安 放 在 坚 实 的 地 面 上, 水 平 放 置 超 速 离 心 机 重 达 数 百 公 斤, 应 放 在 很 坚 实 的 地 面 上 并 有 防 尘 防 潮 设 备, 保 证 离 心 室 达 到 一 定 的 真 空 度, 正 常 运 行 离 心 机 工 作 前, 应 将 负 荷 平 衡, 重 量 误 差 越 小 越 好, 否 则 会 引 起 剧 烈 震 动, 损 坏 离 心 转 头 及 转 轴 2. 离 心 器 分 离 支 架 必 须 在 安 置 离 心 管 后 运 转, 严 禁 空 架 运 转 离 心 机 启 动 时, 转 速 开 关 或 G 值 旋 钮 应 放 在 低 档 位, 启 动 后 再 逐 步 调 节 到 所 需 要 的 数 值 一 次 工 作 后, 须 将 旋 纽 调 至 低 档 位 再 次 工 作, 在 高 转 速 挡 或 高 G 值 档 禁 止 直 接 启 动 3. 选 择 合 适 的 转 头, 控 制 转 头 的 转 速 在 下 述 情 况 下 要 降 低 转 头 的 最 高 转 速 : 转 头 的 运 转 时 间 和 运 转 次 数 达 到 规 定 的 寿 命 时 ; 当 转 头 受 到 局 部 表 面 损 伤 或 出 现 管 孔 内 轻 微 腐 蚀 时 ; 使 用 不 锈 钢 离 心 管 套 管 厚 壁 管 或 离 心 瓶 时 ; 样 品 平 均 密 度 超 过 1.2g/cm 3 时 ; 转 头 受 到 高 温 时 4. 转 头 在 每 次 使 用 前 要 严 格 检 查 孔 内 是 否 有 异 物 和 污 垢, 以 保 持 平 衡 转 头 必 须 保 持

61 61 干 燥 清 洁, 切 勿 碰 撞 擦 伤 如 不 慎 跌 落, 应 对 转 头 进 行 X 光 拍 片 检 查, 确 认 无 内 部 损 伤 后 方 可 继 续 使 用 转 头 每 次 使 用 后 应 用 温 水 (50 ~60 ) 及 中 性 洗 涤 剂 浸 泡 清 洗, 最 后 用 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 冲 洗, 软 布 擦 干 后 用 电 吹 风 烘 干 上 蜡, 干 燥 保 存 5. 各 种 离 心 管 的 拉 力 强 度 和 伸 长 度 都 不 同, 应 按 需 要 选 用, 离 心 管 可 由 许 多 种 不 同 材 料 制 成, 如 聚 乙 烯 纤 维 素 聚 碳 酸 脂 聚 丙 烯 等 使 用 时 注 意 保 证 样 品 溶 剂 及 梯 度 材 料 不 腐 蚀 离 心 管 及 盖 组 件 过 期 老 化 有 裂 纹 或 已 受 腐 蚀 的 离 心 管 尽 量 不 用 或 降 速 使 用 控 制 塑 料 离 心 管 的 使 用 次 数, 注 意 规 格 配 套 离 心 过 程 中 不 得 开 启 离 心 室 盖, 不 得 用 手 或 异 物 碰 撞 正 在 旋 转 中 的 转 头 及 离 心 管 6. 对 于 低 温 离 心 样 品, 应 先 将 空 的 转 头 在 2000rpm 预 冷 一 定 时 间, 预 冷 时 控 制 温 度 在 0 左 右, 也 可 将 转 头 放 在 冰 箱 中 预 冷 数 小 时 备 用, 离 心 杯 可 直 接 存 放 在 冰 箱 中 预 冷 7. 在 离 心 过 程 中 如 发 现 异 常 现 象, 如 不 正 常 噪 音 及 振 动, 应 立 即 停 机 检 查, 未 找 出 原 因 前 不 得 继 续 运 转 8. 在 日 常 使 用 离 心 机 的 过 程 中, 每 隔 三 个 月 应 对 主 机 校 正 一 次 水 平 度, 每 使 用 5 亿 转 处 理 真 空 泵 油 一 次, 工 作 500h 应 检 查 驱 动 电 机 炭 刷, 最 好 用 吸 尘 器 将 摩 擦 产 生 的 炭 粉 除 去, 必 要 时 需 要 更 换 炭 刷 或 将 整 流 子 用 细 砂 纸 打 光 每 使 用 1500h 左 右 应 清 洗 驱 动 部 位 轴 承 并 加 上 高 速 润 滑 油 脂, 转 轴 与 转 头 接 合 部 应 经 常 涂 脂 防 锈, 长 期 不 用 时 应 涂 防 锈 油 加 油 纸 包 扎 平 时 不 用 时, 应 每 月 低 速 开 机 1~2 次, 每 次 0.5h, 保 证 各 部 位 的 正 常 运 转 离 心 机 常 见 故 障 1. 真 空 度 下 降 是 常 见 故 障 在 真 空 度 下 降 或 抽 真 空 不 好 时, 要 检 查 真 空 系 统, 一 般 是 将 油 更 换, 真 空 度 就 会 恢 复 另 外, 小 型 或 台 式 真 空 机, 人 们 常 常 会 忘 记 将 放 在 离 心 腔 中 的 转 头 取 出, 时 间 长 了 转 头 会 卡 死 在 轴 上 不 能 用 力 敲 打, 这 样 会 损 坏 离 心 轴, 导 致 转 轴 扭 歪, 会 损 坏 离 心 机, 甚 至 发 生 事 故 必 要 时 可 以 请 专 业 工 程 师 协 助 取 出 对 于 高 速 超 速 离 心 机, 大 部 分 都 没 有 真 空 装 置, 目 的 是 让 离 心 腔 在 运 行 状 态 时 处 于 中 或 高 真 空 状 态, 减 少 对 转 头 的 摩 擦, 使 其 稳 定 运 行 高 速 超 高 速 离 心 机 运 行 过 程 中, 面 板 上 有 故 障 提 示, 可 以 针 对 相 应 的 故 障 提 示 符 处 理 故 障 2. 离 心 机 不 工 作 的 现 象 对 于 高 速 超 速 离 心 机, 看 离 心 条 件 是 否 选 择 合 适, 检 查 传 感 部 分 控 制 系 统 和 显 示 单 元 等, 逐 步 检 查 就 可 找 出 原 因 对 于 小 型 或 台 式 离 心 机, 人 们 常 常 会 忘 记 把 转 头 一 直 放 在 离 心 腔 里, 时 间 长 了 转 头 会 卡 死 在 轴 上, 为 了 将 转 头 取 下, 必 须 用 力 敲 打, 这 样 会 严 重 损 伤 离 心 轴, 导 致 转 轴 扭 歪, 恢 复 不 了, 甚 至 损 坏 离 心 机 正 确 的 操 作 合 理 的 维 护 是 保 证 仪 器 正 常 运 转 和 延 长 仪 器 使 用 寿 命 的 关 键 性 能 优 越 的

62 62 离 心 机, 均 要 做 好 日 常 维 护 工 作, 以 使 离 心 机 发 挥 最 大 的 效 率 离 心 机 的 维 护 与 保 养 1. 超 速 离 心 时, 应 注 意 选 择 合 适 的 离 心 管 和 转 头, 当 转 速 超 过 所 用 转 头 最 大 转 速 的 25% 时, 转 头 就 会 爆 炸 转 头 使 用 前, 应 放 冰 箱 预 冷, 离 心 完 毕 后, 转 头 应 用 温 水 洗 涤 并 干 燥, 更 好 的 办 法 是 将 转 头 擦 干, 转 头 长 期 不 用 应 涂 一 层 上 光 蜡 保 护 2. 电 动 机 的 轴 承 定 期 加 润 滑 脂, 磨 损 过 度 的 垫 圈 立 即 更 换 防 止 密 封 圈 老 化, 随 着 时 间 的 延 长, 应 经 常 检 查 有 无 变 形 在 离 心 机 内 腔 上 部 与 盖 门 接 触 处 配 有 橡 胶 密 封 圈, 随 使 用 时 间 的 延 长, 应 经 常 观 察 有 无 变 形, 以 防 外 界 热 量 渗 入, 使 制 冷 效 果 差 而 影 响 检 测 结 果 3. 所 使 用 离 心 管 必 须 保 证 质 量, 质 量 不 好, 已 变 形 或 有 裂 纹 的 离 心 管 就 不 能 使 用 保 持 离 心 管 对 称 平 衡 使 用, 平 时 要 注 意 其 清 洁 消 毒 保 养 保 持 离 心 杯 对 称 平 衡 4. 做 好 离 心 机 故 障 记 录, 如 仪 器 故 障 原 因 和 排 除 方 法 及 时 间 等 5. 注 意 维 护 转 子 使 用 中 有 腐 蚀 性 气 体 或 处 在 潮 湿 环 境 中, 会 严 重 影 响 离 心 机 转 子 的 寿 命, 故 严 禁 使 用 有 损 伤 的 离 心 管, 或 工 作 时 将 离 心 管 充 注 过 满 或 密 封 不 严 而 发 生 泄 露 3.7 旋 转 蒸 发 仪 的 使 用 与 维 护 原 理 : 旋 转 蒸 发 仪 的 基 本 原 理 就 是 减 压 蒸 馏, 也 就 是 在 减 压 情 况 下, 当 溶 剂 蒸 馏 时, 蒸 馏 烧 瓶 在 连 续 转 动 主 要 用 于 在 减 压 条 件 下 连 续 蒸 馏 大 量 易 挥 发 性 溶 剂 尤 其 对 萃 取 液 的 浓 缩 和 色 谱 分 离 时 的 接 收 液 的 蒸 馏, 可 以 分 离 和 纯 化 反 应 产 物 操 作 : 使 用 时, 应 先 减 压, 再 开 动 电 动 机 转 动 蒸 馏 烧 瓶, 结 束 时, 应 先 停 机, 再 通 大 气, 以 防 蒸 馏 烧 瓶 在 转 动 中 脱 落 作 为 蒸 馏 的 热 源, 常 配 有 相 应 的 恒 温 水 槽 注 意 事 项 : 1. 旋 转 蒸 发 仪 应 放 在 通 风 很 好 的 位 置, 如 果 条 件 允 许 的 话 最 好 放 在 通 风 橱 内 ; 2. 旋 转 蒸 发 仪 每 次 用 完 时, 其 残 留 的 废 液 应 立 即 处 理 或 回 收, 做 到 旋 转 蒸 发 仪 中 不 留 废 的 溶 剂 ; 3. 沸 点 较 低, 但 在 常 温 常 压 下 是 固 体 或 粘 稠 状 的 物 质, 禁 止 使 用 ; 4. 产 物 与 溶 剂 要 有 一 定 的 沸 点 差 ; 且 通 常 是 将 溶 剂 进 行 蒸 馏, 产 物 留 在 蒸 馏 瓶 中 ; 5. 易 发 生 热 聚 合 或 光 聚 合 的 物 质 进, 禁 止 使 用 该 仪 器 行 分 离 提 纯 3.8 冷 冻 干 燥

63 63 1. 冷 冻 干 燥 的 原 理 将 待 干 燥 的 制 品 冷 冻 成 固 态, 然 后 将 冻 结 的 制 品 经 真 空 升 华 逐 渐 脱 水 而 留 下 干 物 质 的 过 程 称 为 冷 冻 干 燥 冷 冻 干 燥 的 制 品 是 在 低 温 高 真 空 中 制 成 的, 微 小 冰 晶 体 的 升 华 呈 现 多 孔 结 构, 并 保 持 原 先 冻 结 的 体 积, 加 水 易 溶, 并 能 恢 复 原 有 的 新 鲜 状 态, 生 物 活 性 不 变 由 于 冷 冻 干 燥 有 上 述 优 点, 所 以 适 合 于 对 热 敏 感, 易 吸 湿, 易 氧 化, 易 变 性 的 制 品 ( 如 蛋 白 质 酶 核 酸 抗 菌 素 激 素 等 ), 广 泛 应 用 于 科 研 和 生 产 冷 冻 干 燥 的 过 程 是 由 冷 冻 干 燥 机 来 完 成, 冷 冻 干 燥 机 是 生 化 与 分 子 生 物 学 实 验 室 必 备 的 仪 器 之 一, 因 为 大 多 数 生 物 大 分 子 分 离 纯 化 后 的 最 终 产 品 多 数 是 水 溶 液, 要 从 水 溶 液 中 得 到 固 体 产 品, 最 好 的 办 法 就 是 冷 冻 干 燥, 因 为 生 物 大 分 子 容 易 失 活, 通 常 不 能 使 用 加 热 蒸 发 浓 缩 的 方 法 冷 冻 干 燥 的 程 序 包 括 冻 结 升 华 和 再 干 燥 冰 冻 干 燥 的 原 理 可 用 溶 剂 的 三 相 点 相 图 来 说 明, 如 图 2 11 图 2-11 三 相 点 相 图 A 是 固 液 曲 线 ;B 是 汽 液 曲 线 ; 是 固 汽 曲 线 ; 是 三 相 点 当 温 度 在 三 相 点 以 下, 将 压 力 降 至 线 以 下, 溶 剂 ( 通 常 是 水 ) 就 可 以 由 固 相 直 接 升 华 为 汽 相 例 如, 冰 在 -40 时 其 上 方 的 蒸 汽 压 为 0.1 毫 米 汞 柱 (mmhg), 在 -60 时 其 上 方 的 蒸 汽 压 为 0.01 毫 米 汞 柱 (mmhg) 固 态 的 冰 升 华 为 水 蒸 汽 时 要 吸 收 大 量 的 热,1 克 0 的 冰 变 成 0 的 蒸 汽 需 吸 热 580 千 卡, 所 以 升 华 时 又 可 以 使 固 态 的 冰 进 一 步 降 温, 空 气 潮 湿 时 可 以 看 见 装 有 固 态 冰 的 容 器 外 壁 上 结 有 霜 2. 冷 冻 干 燥 的 优 点 冰 冻 干 燥 得 到 的 生 物 大 分 子 固 体 样 品 有 突 出 的 优 点 :1 由 于 是 由 冰 冻 状 态 直 接 升 华 为 汽 态, 所 以 样 品 不 起 泡, 不 暴 沸 ;2 得 到 的 干 粉 样 品 不 粘 壁, 易 取 出 ;3 冻 干 后 的 样 品 是 疏 松 的 粉 末, 易 溶 于 水 冷 冻 干 燥 机 的 国 产 品 牌 近 年 来 发 展 很 快 如 北 京 的 军 事 医 学 科 学 院 生 产 的 小 型 中 型 和

64 64 大 型 工 业 用 冻 干 机, 已 可 以 取 代 昂 贵 的 进 口 产 品 3. 自 组 装 小 型 简 易 的 冻 干 干 燥 器 1 准 备 一 个 较 大 的 玻 璃 真 空 干 燥 器, 将 样 品 置 于 小 培 养 皿 中 速 冻 后 放 入 干 燥 器 内, 器 内 已 事 先 用 两 个 小 培 养 皿 分 别 盛 有 KH( 或 NaH) 和 P25, 干 燥 器 通 过 一 个 两 端 塞 上 棉 花 其 中 装 满 P25 的 干 燥 管 与 真 空 泵 相 连, 抽 真 空 后, 经 过 5~10 小 时 就 可 以 得 到 冷 冻 干 燥 的 样 品 ; 2 将 样 品 溶 液 置 于 一 个 圆 底 烧 瓶 瓶 内, 将 烧 瓶 浸 入 干 冰 乙 醇 低 温 浴 (-60 ) 中, 样 品 即 被 速 冻 成 冰 块, 将 烧 瓶 标 准 磨 口 通 过 磨 口 管 与 一 个 冷 阱 相 连, 冷 阱 内 放 有 干 冰 乙 醇 混 合 液, 冷 阱 的 另 一 个 出 口 管 与 真 空 泵 相 连, 抽 真 空 时 汽 化 的 水 汽 就 冻 结 在 冷 阱 的 内 壁 上, 抽 真 空 数 小 时 后 即 可 在 烧 瓶 中 得 到 冻 干 的 样 品 此 简 易 装 置 也 可 用 于 冻 干 含 有 少 量 乙 醇 甲 醇 丙 酮 等 常 用 有 机 溶 剂 的 样 品, 可 重 复 以 下 的 操 作 除 去 这 些 有 机 溶 剂 : 样 品 速 冻 抽 真 空 至 恒 定 使 样 品 升 温 至 室 温 挥 发 有 机 溶 剂 再 速 冻 样 品, 如 此 反 复 多 次, 以 除 尽 有 机 溶 剂, 否 则 样 品 不 易 冻 干, 且 泵 前 应 装 有 保 护 真 空 泵 的 缓 冲 液, 以 吸 收 水 和 有 机 溶 剂 4. 注 意 事 项 冷 冻 干 燥 操 作 虽 然 十 分 简 单, 但 却 须 注 意 以 下 事 项 : (1) 样 品 溶 液 1 样 品 要 溶 于 水, 不 含 有 机 溶 剂, 否 则 会 造 成 冰 点 降 低, 冷 冻 的 样 品 容 易 融 化, 因 而 减 压 时 会 起 大 量 泡 沫, 使 样 品 变 性 污 染 和 损 失 同 时 若 含 有 有 机 溶 剂, 被 抽 入 真 空 泵 后 溶 于 真 空 泵 油, 使 其 可 达 真 空 度 降 低 而 必 须 换 油 2 样 品 要 预 先 脱 盐, 不 可 使 盐 浓 度 过 高, 否 则 冰 冻 后 易 融 化, 影 响 样 品 活 性, 而 且 不 易 冻 干 3 样 品 缓 冲 液 在 冷 冻 时 ph 可 能 会 有 较 大 变 化, 例 如 ph 7.0 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 在 冷 冻 时, 磷 酸 氢 二 钠 比 磷 酸 二 氢 钠 先 冻 结, 因 而 使 溶 液 ph 下 降 而 接 近 3.5, 使 某 些 对 低 ph 敏 感 的 酶 变 性 失 活, 此 时 需 加 入 ph 稳 定 剂, 如 糖 类 和 钙 离 子 等 4 样 品 溶 液 的 浓 度 不 要 过 稀, 例 如 蛋 白 质 的 浓 度 不 低 于 15 mg/ml 为 宜 同 批 冻 干 的 样 品 液 浓 度 不 宜 相 差 太 大, 以 免 冻 干 的 时 间 相 差 过 大 (2) 装 样 品 溶 液 的 容 器 1 最 好 用 各 种 尺 寸 的 培 养 皿 盛 样 品 溶 液, 液 层 不 要 太 厚, 以 免 冻 干 时 间 太 长, 耗 电 太 多 也 可 以 使 用 安 培 瓶 和 青 霉 素 瓶 用 烧 杯 时 液 层 厚 度 不 要 超 过 2 cm, 否 则 烧 杯 易 冻 裂 2 冻 干 稀 溶 液 时 会 得 到 很 轻 的 绒 毛 状 固 体 样 品, 容 易 飞 散 而 损 失 和 造 成 污 染, 因 而 要 用 刺 了 孔 的 薄 膜 或 吸 水 纸 包 住 杯 口, 刺 的 孔 不 要 过 小 过 少, 否 则 会 影 响 冻 干 速 度 (3) 溶 液 冷 冻 如 有 条 件, 尽 可 能 用 干 冰 乙 醇 低 温 浴 速 冻, 如 能 将 盛 有 样 品 溶 液 的 容 器 边 冻 边 旋 转 形 成 很 薄 的 冰 冻 层, 则 可 以 大 大 加 快 冻 干 的 速 度

65 65 (4) 冻 干 1 样 品 全 部 冻 干 前, 不 要 轻 易 摇 动, 以 防 水 蒸 汽 冲 散 冻 干 的 样 品 粉 末 2 样 品 冻 干 达 到 较 高 真 空 度 时, 容 器 外 部 有 时 会 结 霜, 若 外 霜 消 失, 则 说 明 样 品 已 冻 干, 或 是 仅 剩 样 品 中 心 的 小 冰 块, 再 稍 加 延 长 冻 干 时 间 即 可 3 冻 干 后 要 及 时 取 出 样 品, 以 免 样 品 在 室 温 下 停 留 时 间 过 长 而 失 活 4 停 真 空 泵 时 要 先 放 气, 以 免 泵 油 倒 灌 放 气 时 要 缓 慢, 以 免 气 流 冲 散 样 品 干 粉 5 样 品 冻 干 后 要 及 时 密 封 冷 藏, 以 防 受 潮 6 真 空 泵 要 经 常 检 查 油 面 和 油 色, 油 面 过 低 和 油 色 发 黑, 则 需 换 油, 通 常 半 年 或 一 季 度 至 少 要 换 一 次 油 4 光 学 仪 器 基 本 知 识 4.1 傅 立 叶 红 外 光 谱 傅 里 叶 变 换 红 外 光 谱 法 (FTIR) 的 基 本 原 理 当 不 同 能 量 的 各 种 光 线 照 射 到 物 体 上 时 都 会 相 互 作 用 而 发 生 能 量 交 换, 频 率 越 高 的 光 线 能 量 越 大, 与 物 质 相 互 作 用 也 越 强 烈, 根 据 光 线 频 率 由 高 到 低 顺 序, 可 把 光 线 分 为 x 射 线 紫 外 线 可 见 光 红 外 线 微 波 无 线 电 波 等 波 段 当 频 率 最 高 的 x 射 线 与 物 质 相 互 作 用 时 可 使 其 分 子 的 化 学 键 断 裂, 紫 外 线 可 见 光 则 使 物 质 分 子 中 的 电 子 发 生 能 级 跃 迁, 而 能 量 较 低 的 红 外 线 只 能 使 分 子 中 的 共 价 键 发 生 振 动, 能 量 更 低 的 微 波 和 无 线 电 波 只 能 使 分 子 发 生 转 动 或 原 子 核 电 子 的 自 旋 运 动 由 于 物 体 发 生 上 述 分 子 内 的 结 构 变 化 时 只 吸 收 特 定 波 长 的 光 波, 因 此 把 透 过 物 体 的 光 线 经 过 色 散, 分 成 不 同 波 长 组 成 的 谱 带, 即 可 得 到 吸 收 光 谱 图, 可 以 对 不 同 波 长 光 线 被 物 体 吸 收 情 况 进 行 研 究 常 用 的 吸 收 光 谱 有 紫 外 可 见 和 红 外 三 种 红 外 光 谱 仪 是 利 用 光 的 色 散 原 理 制 成 的, 当 通 过 物 体 后 的 入 射 光 经 棱 镜 光 栅 等 单 色 器 使 光 波 色 散, 把 复 合 光 分 为 单 色 光, 并 按 波 长 顺 序 排 列 到 狭 缝 平 面 上 并 由 检 测 器 接 收 其 信 号, 依 次 对 单 色 光 的 强 度 进 行 测 定, 即 得 到 样 品 的 吸 收 光 谱 图 以 前 使 用 的 红 外 光 谱 仪 由 于 扫 描 的 每 一 瞬 间, 只 有 极 窄 的 一 段 光 波 落 在 检 测 器 上, 灵 敏 度 和 检 测 速 度 均 受 到 限 制, 而 傅 立 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 利 用 迈 克 耳 逊 干 涉 仪, 使 光 谱 信 号 作 到 多 路 传 输, 并 将 干 涉 信 号 经 傅 立 叶 数 学 变 换 转 换 成 普 通 光 谱 信 号, 因 此 能 在 同 一 时 刻 收 集 光 谱 中 所 有 频 率 的 信 息, 在 一 分 钟 内 能 对 全 部 光 谱 扫 描 近 千 次, 因 此 大 大 提 高 了 灵 敏 度 和 工 作 效 率

66 傅 里 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 的 发 展 概 况 1880 年 迈 克 耳 孙 (Michelson) 发 明 了 干 涉 仪, 由 于 检 测 仪 的 灵 敏 度 和 傅 里 叶 变 换 (FT) 的 计 算 问 题, 并 未 投 入 实 际 应 用 20 世 纪 上 叶,William Webber oblentz 领 导 的 美 国 国 家 标 准 技 术 研 究 所 辐 射 测 量 部 门 率 先 发 表 原 子 和 分 子 基 团 在 红 外 波 长 范 围 有 特 征 吸 收 峰, 开 始 了 对 红 外 光 谱 仪 的 研 究 第 二 次 世 界 大 战 对 合 成 橡 胶 的 生 产 和 检 测 需 要, 驱 使 了 对 红 外 光 谱 仪 的 研 制 和 生 产 色 散 型 红 外 分 光 光 度 计 开 始 广 泛 地 应 用 于 各 个 领 域 20 世 纪 50 年 代 美 国 John Hopkins 大 学 一 实 验 小 组 及 空 军 剑 桥 研 究 实 验 室 建 造 高 分 辨 率 光 谱 仪 后, 傅 里 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 才 得 到 实 际 的 应 用 1965 年 onley 和 Tukey 发 表 了 FT 快 速 计 算 法, 极 大 地 方 便 了 计 算 机 计 算, 使 傅 里 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 得 到 迅 速 发 展 现 在 傅 里 叶 变 换 红 外 光 谱 仪 已 得 到 全 面 的 发 展, 使 用 方 法 几 乎 适 应 各 类 物 质 的 检 测 分 析, 包 括 衰 减 全 反 射 法 漫 反 射 法, 光 声 光 谱 法 显 微 光 谱 法 动 态 光 谱 法 ( 动 力 学 法 ) 光 谱 仪 与 各 种 仪 器 的 联 用, 以 及 与 计 算 机 技 术 的 结 合 现 在, 红 外 光 谱 法 通 常 作 为 分 析 各 种 聚 合 物 材 料 最 佳 选 择 的 技 术 在 纺 织 工 业 领 域, 主 要 用 于 对 未 知 物 的 分 析 ; 定 量 分 析 ; 织 物 等 表 面 涂 层 的 分 析 和 高 分 子 材 料 大 分 子 链 等 的 测 定 4.2 紫 外 和 可 见 光 光 谱 利 用 紫 外 光 可 见 光 红 外 光 和 激 光 等 测 定 物 质 的 吸 收 光 谱, 利 用 此 吸 收 光 谱 对 物 质 进 行 定 性 定 量 分 析 和 物 质 结 构 分 析 的 方 法, 称 为 分 光 光 度 法 或 分 光 光 度 技 术, 使 用 的 仪 器 称 为 分 光 光 度 计, 分 光 光 度 计 灵 敏 度 高, 测 定 速 度 快, 应 用 范 围 广, 尤 其 是 紫 外 / 可 见 分 光 光 度 技 术 更 是 生 物 化 学 研 究 工 作 中 必 不 可 少 的 基 本 手 段 之 一 光 谱 原 理 光 是 电 磁 波, 可 用 波 长 λ 表 示, 电 磁 波 谱 是 由 不 同 性 质 的 连 续 波 长 的 光 谱 所 组 成, 对 于 生 物 化 学 来 说, 最 重 要 的 波 长 区 域 是 可 见 光 和 紫 外 光 光 的 波 长 是 二 个 相 邻 的 波 峰 之 间 的 距 离 光 的 传 播 是 由 相 互 垂 直 的 电 场 分 量 E 和 磁 场 分 量 H 所 构 成 λ = /V 其 中, λ 波 长 ; 光 速 ; V 频 率, 单 位 时 间 通 过 一 个 定 点 的 波 数 光 又 可 以 看 作 是 由 具 有 能 量 的 粒 子 所 组 成, 这 些 粒 子 所 具 有 的 原 能 量 E 由 下 式 算 出 : E = H V H 普 朗 克 常 数 ( 尔 格 秒 ); V 频 率 紫 外 区 可 分 为 紫 外 ( 近 紫 外 ) 和 真 空 紫 外 ( 远 紫 外 ) 由 于 吸 收 池 ( 又 称 样 品 池 比 色 杯 等 ) 和 光 学 元 件 以 及 氧 气 能 吸 收 小 于 190nm 波 长 的 光, 因 此 常 规 紫 外 测 定 集 中 在 近 紫 外 区, 即 200nm~400nm 可 见 光 区 为 400nm~800nm

67 67 组 成 物 质 的 分 子 均 处 于 一 定 能 态 并 不 停 地 运 动 着, 分 子 的 运 动 可 分 为 平 动 转 动 振 动 和 分 子 内 电 子 的 运 动, 每 种 运 动 状 态 都 处 于 一 定 的 能 级, 因 此 分 子 的 能 量 可 以 写 成 : E=E0+E 平 +E 转 +E 振 +E 电 E0 分 子 内 在 的 不 随 分 子 运 动 而 改 变 的 能 量 ; E 平 平 动 能, 只 是 温 度 的 函 数 因 此 与 光 谱 有 关 的 能 量 变 化 是 分 子 的 转 动 能 量 振 动 能 量 和 分 子 的 电 子 能 量 分 子 的 每 一 种 能 量 都 有 一 系 列 的 能 级, 能 级 不 是 任 意 的, 而 是 具 有 量 子 化 特 征 的, 通 常 分 子 处 于 基 态, 当 它 吸 收 一 定 能 量 跃 迁 到 激 发 态, 则 产 生 吸 收 光 谱 分 子 转 动 振 动 和 电 子 能 级 的 跃 迁, 相 应 地 产 生 转 动 振 动 及 电 子 光 谱 按 照 量 子 力 学 原 理, 分 子 能 态 按 一 定 的 规 律 跳 跃 式 地 变 化, 物 质 在 入 射 光 的 照 射 下, 分 子 吸 收 光 时, 其 能 量 的 增 加 是 不 连 续 的, 物 质 只 能 吸 收 一 定 能 量 的 光, 吸 收 光 的 频 率 和 两 个 能 级 间 的 能 量 差 要 符 合 下 列 关 系 : E=E2- E1=h E1 E2 分 别 表 示 初 能 态 和 终 能 态 的 能 量, 初 能 态 与 终 能 态 之 间 的 能 量 差 愈 大, 则 所 吸 收 的 光 的 频 率 愈 高 ( 即 波 长 愈 短 ), 反 之 则 所 吸 收 的 光 的 频 率 愈 低 ( 即 波 长 愈 长 ) 由 于 吸 收 是 不 连 续 的, 因 此 在 光 的 一 定 部 位 出 现 一 系 列 吸 收 谱 带 因 为 分 子 转 动 振 动 及 电 子 能 级 跃 迁 的 能 量 差 别 较 大, 因 此, 它 们 的 吸 收 光 谱 出 现 在 不 同 的 光 谱 区 域 分 子 转 动 能 级 级 差 小, E<0.05 电 子 伏 特 (ev), 分 子 转 动 光 谱 的 吸 收 出 现 在 远 红 外 或 微 波 区 振 动 能 级 间 的 差 别 较 大, E =0.05~1.0ev, 振 动 光 谱 出 现 在 中 红 外 区 电 子 能 级 的 级 差 更 大, E=1~20ev, 所 以 由 电 子 跃 迁 得 到 的 光 谱 出 现 在 可 见 紫 外 或 波 长 更 短 的 光 谱 区 可 见 光 紫 外 光 吸 收 光 谱, 是 由 于 分 子 中 联 系 较 松 散 的 价 电 子 被 激 发 产 生 跃 迁 从 而 吸 收 光 辐 射 能 量 形 成 的, 即 分 子 由 基 态 变 为 激 发 态, 电 子 由 一 个 低 能 级 的 轨 道 ( 即 成 键 轨 道 ), 吸 收 了 光 能 量 跃 迁 到 高 能 级 轨 道 ( 称 为 反 键 轨 道 ) 与 吸 收 光 谱 有 关 的 三 种 电 子 是 :1 二 个 原 子 的 电 子 沿 其 对 称 方 向 相 互 形 成 的 共 价 键 ( 即 单 键 ), 称 σ 键, 构 成 σ 键 的 电 子 称 σ 电 子, 如 - -H 键 2 平 行 于 二 个 原 子 轨 道 形 成 的 价 键 ( 即 双 键 ), 称 π 键, 形 成 π 键 的 电 子 称 为 π 电 子, 如 = 键 3 未 共 享 成 键 的 电 子, 称 n 电 子 各 种 电 子 跃 迁 所 需 能 量 大 小 的 顺 序 是 : π*<π π* n σ*<π σ*<σ π*<σ σ* 紫 外 吸 收 光 谱 主 要 是 由 于 双 键 电 子, 尤 其 是 共 轭 双 键 中 的 π 电 子 和 未 共 享 的 电 子 对 的 激 发 所 产 生 的 所 以 各 种 物 质 分 子 对 紫 外 光 的 吸 光 性 质 取 决 于 该 分 子 的 双 键 数 目 和 未 共 享 电 子 对 的 共 轭 情 况 等 表 2.1 电 子 跃 迁 类 型 与 紫 外 吸 收 波 长 (nm) 关 系 : 电 子 跃 迁 类 型 例 子 紫 外 吸 收 波 长 范 围

68 68 σ σ* -H 100~150 nm π π*( 非 共 轭 ) = <200 nm π π*( 共 轭 ) =-= 200~300 nm n π* = ~300 nm π π* 跃 迁 : 此 类 跃 迁 所 需 能 量 较 小, 吸 收 波 长 在 紫 外 区 的 200~300 nm, 不 饱 和 烃 共 轭 烯 烃 及 芳 香 烃 均 可 发 生 这 类 跃 迁, 氨 基 酸 蛋 白 质 与 核 酸 均 含 有 大 量 共 轭 双 键, 因 而 200~300 nm 的 紫 外 吸 收 测 定, 在 生 化 实 验 技 术 中 有 极 广 泛 的 用 途 若 逐 渐 改 变 照 射 某 物 质 的 入 射 光 的 波 长, 并 测 定 物 质 对 各 种 波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A 或 光 密 度 D ) 或 透 射 程 度 ( 透 光 度 T ), 以 波 长 λ 作 横 坐 标, A 或 T 为 纵 坐 标, 即 为 该 物 质 的 吸 收 光 谱 曲 线 由 图 2.1 可 以 看 出 吸 收 光 谱 的 特 征 : 1 曲 线 上 A 处 称 最 大 吸 收 峰, 它 所 对 应 的 波 长 称 最 大 吸 收 波 长, 以 λmax 表 示 2 曲 线 上 B 处 有 一 谷, 称 最 小 吸 收, 它 所 对 应 的 波 长, 称 最 小 吸 收 波 长, 以 λmin 表 示 3 曲 线 上 在 最 大 吸 收 峰 旁 边 有 一 小 峰, 称 肩 峰 4 在 吸 收 曲 线 的 波 长 最 短 的 一 端, 曲 线 上 D 处, 吸 收 相 当 强, 但 不 成 峰 形, 此 处 称 为 末 端 吸 收 λmax 是 化 合 物 中 电 子 能 级 跃 迁 时 吸 收 的 特 征 波 长, 不 同 物 质 有 不 同 的 最 大 吸 收 峰, 所 以 它 对 鉴 定 化 合 物 极 为 重 要 吸 收 光 谱 中,λmax λmin 肩 峰 以 及 整 个 吸 收 光 谱 的 形 状 决 定 于 物 质 的 性 质, 其 特 征 随 物 质 的 结 构 而 异, 所 以 是 物 质 定 性 的 依 据 图 2.1 吸 收 光 谱 曲 线 测 定 某 物 质 的 紫 外 吸 收 光 谱 的 曲 线, 可 与 已 知 标 准 的 紫 外 光 谱 图 相 对 照, 对 照 时 须 注 意 测 定 的 条 件, 如 溶 剂 浓 度 等 常 用 标 准 的 紫 外 吸 收 光 谱 是 萨 德 勒 研 究 实 验 公 司 编 制 的 Sadtler 紫 外 标 准 图 谱 集, 到 七 十 年 代 末 为 止 已 收 集 个 化 合 物 紫 外 光 谱 图, 此 外 还 有 药 物 和 非 极 性 溶 剂 紫 外 光 谱 图 2000 多 幅 由 于 化 合 物 紫 外 吸 收 峰 较 少, 而 且 峰 形 都 很 宽, 不 象 红 外 光 谱 是 许 多 指 纹 峰, 所 以 在 用 紫 外 吸 收 光 谱 进 行 化 合 物 定 性 鉴 定 时, 应 注 意 : 化 合 物 相 同, 其 紫 外 光 谱 应 完 全 相 同 ; 但 是 紫 外 光 谱 相 同, 不 一 定 化 合 物 就 相 同, 可 能 仅 是 存 在 某 些 相 同 的 发 色 团 或 基 团, 因 此 在 鉴 定 时 应 与 红 外 光 谱 相 结 合 图 2.1 吸 收 光 谱 曲 线

69 69 由 于 电 子 跃 迁 的 同 时 也 引 起 分 子 的 转 动 和 振 动 光 谱, 要 把 电 子 跃 迁 和 分 子 振 动 转 动 的 跃 迁 完 全 分 开 是 不 可 能 的, 因 此 我 们 常 见 的 紫 外 吸 收 光 谱 是 由 一 个 或 几 个 宽 的 吸 收 谱 带 所 组 成 紫 外 光 谱 中 常 用 的 术 语 有 发 色 团 助 色 团 增 色 效 应 和 减 色 效 应 发 色 团 : 凡 是 与 饱 和 碳 氢 化 合 物 连 接 能 引 起 n π* π π* n σ* 等 电 子 跃 迁 的 基 团 称 为 发 色 团 例 如 := = 等 发 色 团 助 色 团 : 助 色 团 是 一 些 具 有 非 共 价 键 的 基 团 ( 如 -H -NH2 -SH 等 ) 这 些 基 团 在 波 长 >200 nm 处 没 有 吸 收, 当 它 与 发 色 团 相 连 时, 使 发 色 团 的 吸 收 带 向 长 波 移 动, 称 为 红 移 ( 或 浅 色 效 应 ), 红 移 的 同 时 吸 收 带 的 强 度 增 加 若 助 色 团 与 发 色 团 相 连, 产 生 an* 跃 迁, 使 吸 收 波 长 向 短 波 移 动, 称 为 兰 移 ( 或 深 色 效 应 ) 增 色 效 应 (hyperchromic effect): 核 酸 变 性 或 降 解, 使 得 DNA 或 RNA 溶 液 对 紫 外 光 的 吸 收 明 显 增 加, 即 ε 值 ( 吸 光 系 数 或 称 消 光 系 数 ) 显 著 升 高, 此 现 象 称 为 增 色 效 应 此 效 应 是 由 于 碱 基 之 间 电 子 相 互 作 用 的 改 变 所 致, 通 常 在 260nm 处 测 量 减 色 效 应 (hypochromic effect): 在 一 定 的 条 件 下, 变 性 的 核 酸 又 可 以 复 性, 此 时 ε 值 又 明 显 减 少, 回 复 到 原 来 的 核 酸 分 子 ε 值 较 低 的 水 平, 即 此 时 DNA 或 RNA 溶 液 的 紫 外 光 吸 收 显 著 降 低, 此 现 象 称 为 减 色 效 应, 此 效 应 也 是 由 于 碱 基 之 间 电 子 相 互 作 用 的 变 化 所 引 起 的, 通 常 在 260nm 条 件 下 测 量 光 吸 收 定 律 朗 伯 比 尔 (Lambert-beer) 光 吸 收 定 律 : A=-lgT=εbc A 吸 光 度, 又 称 光 密 度 D ; T 透 光 度, T=I/I ; I 为 照 射 到 吸 收 池 上 的 光 强 ; I 为 透 过 吸 收 池 的 光 强 ; ε 摩 尔 吸 光 系 数 或 克 分 子 吸 光 系 数 (L mol-1 cm-1); b 样 品 光 程 (cm), 通 常 使 用 1.0cm 的 吸 收 地,b=1cm; 样 品 浓 度 (mol/l) 由 上 式 可 以 看 出 : 吸 光 度 A 与 物 质 的 摩 尔 吸 光 系 数 ε 和 物 质 的 浓 度 成 正 比 ε=a/ bc 摩 尔 吸 光 系 数 是 物 质 对 某 波 长 的 光 的 吸 收 能 力 的 量 度 ε 越 大, 吸 收 光 的 能 力 越 强, 相 应 的 分 光 光 度 法 测 定 的 灵 敏 度 就 越 高 ε 值 越 大, 说 明 电 子 跃 迁 的 几 率 越 大, 通 常 ε=10~ 105: 一 般 认 为 ε>104 为 强 吸 收 ;ε=103~104 为 较 强 吸 收 ;ε<102 为 弱 吸 收, 此 时 分 光 光 度 法 不 灵 敏 因 为 通 常 使 用 分 光 光 度 计 可 检 测 出 的 最 小 吸 光 度 A=0.001, 所 以, 当 b=1cm,ε=105 时, 可 检 测 的 溶 液 最 小 浓 度 是 =10-8 mol/l 常 用 的 吸 光 系 数 还 有 一 种 百 分 吸 光 系 数, 即 在 某 一 波 长 下, 溶 液 浓 度 为 1%(W / V), 液

70 70 层 厚 度 b=1cm 时 的 吸 光 度, 以 E 1% λmax 表 示 E 1% λmax= A/ L 百 分 浓 度 (W/V); L 液 层 厚 度, 吸 收 杯 光 径 长 度 ; A 吸 光 度 最 大 吸 收 波 长 λmax 时 的 ε 和 E 1% λmax 值 可 用 下 式 换 算 : ε=e 1% λmax 分 子 量 /10 吸 光 度 A 有 一 个 重 要 性 质 是 其 具 有 加 和 性 : 即 混 合 物 的 总 吸 光 度 等 于 溶 液 中 的 各 组 份 各 自 在 该 波 长 下 吸 光 度 的 算 术 和 这 是 多 元 混 合 物 分 光 光 度 法 定 量 分 析 的 基 础 若 溶 液 中 各 溶 质 的 吸 光 系 数 ε 相 同, 则 各 溶 质 吸 光 度 的 大 小 与 溶 质 浓 度 成 比 例 例 如, 离 子 交 换 柱 层 析 分 离 核 苷 酸 实 验 中 可 利 用 吸 光 光 度 计 算 回 收 率 : m= V m 溶 质 的 量 ; 溶 质 浓 度 ;V 溶 液 体 积 ;A 吸 光 度 ;ε 吸 光 系 数 ;b 吸 收 池 光 径 则 回 收 率 为 : 4.3 荧 光 光 度 分 析 荧 光 原 理 基 态 分 子 吸 收 特 征 频 率 的 光 能 后 被 激 发, 这 些 激 发 分 子 中 的 电 子 很 快 (<10-15s= 由 基 态 跃 迁 到 激 发 态, 激 发 态 电 子 很 不 稳 定, 它 会 迅 速 降 低 而 返 回 到 第 一 电 子 激 发 态 的 最 低 振 动 能 级 然 后 再 由 这 一 能 级 返 回 基 态 的 任 何 振 动 能 级 在 后 一 过 程 中, 激 发 态 电 子 以 光 的 形 式 放 出 它 们 所 吸 收 的 能 量, 所 发 出 的 光 称 为 荧 光 荧 光 物 质 分 子 所 吸 收 的 特 征 频 率 的 光 称 为 激 发 光, 如 图 2.2

71 71 图 2.2 吸 收 光 谱 和 荧 光 光 谱 能 级 跃 迁 示 意 图 荧 光 光 谱 (fluores cencespectrum) 是 带 光 谱 其 发 射 光 谱 的 形 状 往 往 与 激 发 光 波 长 无 关 ; 但 其 发 射 光 谱 和 吸 收 光 谱 的 形 状 相 似, 且 呈 镜 像 对 称 关 系 荧 光 的 激 发 光 谱 与 发 射 光 谱 是 荧 光 分 光 光 度 分 析 的 基 本 参 数 和 依 据 同 时, 荧 光 物 质 在 吸 光 之 后 发 射 出 的 荧 光 强 度 也 是 最 常 用 的 荧 光 参 数 之 一, 它 是 表 示 荧 光 发 射 强 弱 的 物 理 量 目 前, 一 般 商 品 荧 光 分 光 光 度 计 都 采 用 荧 光 强 度 来 表 示, 单 位 为 任 意 单 位 表 示 的 相 对 强 度 荧 光 物 质 发 射 的 荧 光 强 度 与 它 吸 收 的 光 能 成 正 比 荧 光 分 光 光 度 法 的 应 用 荧 光 分 析 大 致 可 分 为 直 接 测 定 法 和 间 接 测 定 法 两 种 直 接 测 定 法 是 利 用 物 质 的 自 身 荧 光 来 进 行 测 定, 而 间 接 测 定 法 是 由 于 许 多 有 机 或 无 机 化 合 物 自 身 不 产 生 荧 光 或 发 射 的 荧 光 很 微 弱, 无 法 直 接 进 行 测 定, 只 能 用 间 接 的 方 法 进 行 测 定 常 用 的 间 接 测 定 法 有 化 学 反 应 法 荧 光 猝 灭 法 和 敏 化 发 光 法 等 1. 直 接 荧 光 检 测 有 些 样 品 自 身 可 以 产 生 荧 光, 可 以 直 接 进 行 荧 光 检 测, 像 少 数 氨 基 酸 如 色 氨 酸 酪 氨 酸 苯 丙 氨 酸 和 部 分 蛋 白 质 核 黄 素 水 杨 酸 钠 等 自 己 可 以 发 出 荧 光, 这 就 是 直 接 荧 光 测 定 方 式 在 对 成 分 复 杂 的 生 物 样 品 进 行 直 接 荧 光 检 测 前, 往 往 需 要 利 用 萃 取 沉 淀 过 滤 色 谱 等 方 法 对 样 品 加 以 纯 化, 以 去 除 或 减 少 杂 质 的 干 扰, 降 低 荧 光 本 底, 提 高 检 测 灵 敏 度 2. 间 接 荧 光 检 测 有 些 物 质 本 身 荧 光 很 弱, 或 不 发 荧 光, 需 要 使 其 转 化 成 荧 光 物 质 再 进 行 检 测, 就 是 间 接 荧 光 检 测 1 化 学 反 应 引 导 的 荧 光 检 测 利 用 化 学 反 应 可 使 一 些 自 身 荧 光 很 弱 或 不 能 产 生 荧 光 的 化 合 物 转 变 成 荧 光 化 合 物 例 如 测 定 血 浆 或 脑 组 织 中 的 吗 啡 时, 利 用 氧 化 还 原 反 应, 将 含 吗 啡 的 提 取 液 ph 调 节 至 8.5, 加 K3Fe(N)6 使 吗 啡 氧 化 为 二 聚 物, 可 产 生 很 强 的 荧 光 (350/440nm), 在 0.1~8μg/mL 血 浆 浓

72 72 度 范 围 内 成 线 性 根 据 测 定 物 的 不 同 化 学 特 性, 可 利 用 水 解 反 应 缩 合 反 应 络 合 反 应 光 化 学 反 应 H2S4 引 导 荧 光 等 不 同 化 学 反 应, 把 它 转 变 成 相 应 的 荧 光 化 合 物 2 制 备 荧 光 衍 生 物 检 测 1) 与 荧 光 试 剂 反 应 生 成 荧 光 衍 生 物 常 用 的 荧 光 试 剂 有 荧 光 胺, 用 于 含 伯 胺 仲 胺 或 潜 在 氨 基 的 样 品 的 测 定 ; 丹 酰 氯 (DANS-1), 常 用 于 含 胺 基 酚 羟 基 样 品 的 测 定 ; 邻 苯 二 甲 醛 (o-phthaldehyde), 常 用 于 伯 胺 类 及 a- 氨 基 酸 类 化 合 物 的 荧 光 分 析 ; 氯 化 硝 基 苯 骈 氧 二 氮 茂 (NBD-1), 本 身 无 荧 光. 通 过 与 蛋 白 质 上 的 支 链 基 团 ( 通 常 是 -SH 基 ) 反 应 生 成 荧 光 物 质 核 酸 常 用 的 荧 光 试 剂 有 溴 化 乙 锭 叮 黄 素 及 光 神 霉 素 等 2) 与 荧 光 染 料 反 应 生 成 荧 光 离 子 对 有 机 碱 类 样 品 与 水 溶 性 酸 性 荧 光 染 料 络 合 形 成 中 性 离 子 对, 然 后 用 有 机 溶 剂 提 取 后 进 行 荧 光 测 定 例 如 利 用 氯 丙 秦 与 四 溴 荧 光 素 形 成 离 子 对. 进 行 氯 丙 秦 含 量 的 测 定 3 荧 光 淬 灭 检 测 荧 光 淬 灭 ( 或 称 荧 光 熄 灭 ) 指 的 是 荧 光 物 质 分 子 于 其 它 物 质 分 子 之 间 发 生 的 导 致 荧 光 强 度 下 降 的 物 理 或 化 学 作 用 过 程, 这 种 物 质 被 称 为 荧 光 淬 灭 剂 荧 光 淬 灭 作 用 在 荧 光 分 析 中 降 低 荧 光 强 度, 对 荧 光 分 析 不 利, 但 是 可 以 被 用 来 建 立 针 对 该 淬 灭 剂 的 荧 光 测 定 法, 这 就 是 荧 光 淬 灭 检 测 例 如 芳 伯 胺 类 样 品 经 重 氮 化 后 与 Bratton-Marshall 试 剂 [N-(1- 萘 基 )- 乙 二 胺 ] 偶 合, 偶 合 产 物 可 淬 灭 Bratton-Marshall 试 剂 的 荧 光, 与 试 剂 空 白 对 照, 荧 光 强 度 的 减 少 与 样 品 含 量 成 正 比 一 般 来 说, 荧 光 淬 灭 检 测 比 直 接 荧 光 检 测 更 为 灵 敏, 并 具 有 更 高 的 选 择 性 由 于 分 子 荧 光 分 析 具 有 灵 敏 度 高 ( 可 比 分 子 吸 收 光 谱 法 高 2~3 个 数 量 级 ) 线 性 范 围 宽 达 3~4 个 数 量 级 选 择 性 强 需 要 样 品 量 少 方 法 简 便 快 捷, 可 提 供 激 发 光 谱 发 射 光 谱 荧 光 强 度 荧 光 效 率 荧 光 寿 命 荧 光 偏 振 等 丰 富 的 分 析 参 数, 所 以 荧 光 分 析 从 建 立 起 就 引 起 人 们 的 重 视, 并 很 快 在 医 药 卫 生 和 科 学 研 究 各 个 领 域 的 分 析 研 究 中 推 广 使 用 荧 光 分 析 的 主 要 缺 点 是 应 用 范 围 还 不 够 广 泛, 还 有 许 多 物 质 自 己 不 能 产 生 荧 光, 也 不 易 和 荧 光 染 料 结 合 另 外 荧 光 测 定 时 的 实 验 条 件 要 求 严 格, 干 扰 因 素 较 多 : 如 光 分 解 氧 淬 灭 易 污 染 等, 应 用 受 到 一 定 的 限 制 3. 荧 光 分 析 中 的 制 样 技 术 1 溶 剂 和 化 学 试 剂 的 选 择 制 样 过 程 所 用 的 溶 剂 和 化 学 试 剂 选 择 要 适 宜, 而 且 要 有 足 够 的 纯 度, 这 对 荧 光 分 析 是 非 常 重 要 的 如 果 溶 剂 在 一 定 波 长 范 围 内 有 吸 收, 就 不 宜 在 此 波 段 用 作 荧 光 试 剂 ; 同 一 种 荧 光 在 不 同 溶 剂 中 的 荧 光 强 度 和 荧 光 光 谱 都 是 显 著 不 同 的 化 学 试 剂 的 纯 度 不 高, 会 带 来 干 扰 的 杂 质 2 待 测 液 的 浓 度 荧 光 分 析 是 微 量 组 分 或 痕 量 组 分 的 分 析, 当 A 0.05 时, 将 产 生 浓 度 效 应, 使 荧 光 强 度 与 荧 光 体 浓 度 的 关 系 偏 离 线 性 浓 度 效 应 是 导 致 荧 光 下 降 的 原 因 之 一

73 原 子 吸 收 光 谱 原 子 吸 收 光 谱 分 析 是 基 于 被 测 元 素 的 基 态 原 子 在 蒸 汽 状 态, 对 该 原 子 共 振 辐 射 进 行 元 素 测 定 的 分 析 方 法, 称 为 原 子 吸 收 光 谱 (atomic absorption sepectrometry,aas) 原 子 吸 收 光 谱 分 析 主 要 分 为 两 类 : 一 类 由 火 焰 将 试 样 分 解 成 自 由 原 子. 称 为 火 焰 原 子 吸 收 光 谱 分 析 ; 另 一 类 依 靠 电 加 热 的 石 墨 管 将 试 样 汽 化 分 解, 称 为 石 墨 炉 无 火 焰 原 子 吸 收 光 谱 分 析 原 子 吸 收 分 光 光 度 法 具 有 灵 敏 度 高, 选 择 性 强, 测 定 元 素 范 围 广 操 作 简 便 快 速, 重 现 性 好 等 优 点, 已 得 到 广 泛 的 应 用 原 理 1. 原 子 吸 收 光 谱 原 理 原 子 吸 收 分 光 光 度 计 分 析 的 基 本 原 理 是 原 子 灯 发 出 被 测 元 素 的 特 征 谱 线 在 通 过 原 子 化 器 时, 被 待 测 元 素 的 基 态 原 子 所 吸 收, 使 原 子 灯 发 出 的 被 测 元 素 特 征 谱 线 强 弱 发 生 改 变, 并 引 起 原 来 的 辐 射 信 号 发 生 变 化 通 过 检 测 特 征 谱 线 的 变 化 来 测 定 原 子 特 征 吸 收 光 谱 利 用 辐 射 信 号 变 化 的 强 弱 来 测 定 化 合 物 中 被 侧 元 素 的 含 量 2. 原 子 吸 收 光 谱 的 产 生 原 子 是 由 带 正 电 荷 的 原 子 核 和 带 负 电 荷 的 电 子 组 成 的, 电 子 围 绕 着 原 子 核 在 一 定 的 轨 道 起 动 基 态 原 子 运 动 的 轨 迹 的 能 级 是 稳 定 的 当 原 子 吸 收 了 外 界 的 辐 射 能 以 后, 原 子 内 部 的 能 量 就 会 增 加, 原 子 处 于 不 稳 定 状 态, 低 轨 迹 运 动 的 电 子 就 会 跃 迁 到 高 能 级 的 电 轨 道 形 成 激 发 态 原 子, 因 此 在 基 态 原 子 吸 收 其 共 振 辐 射, 外 层 电 子 由 基 态 跃 迁 到 激 发 态 的 过 程 中, 也 就 是 原 子 在 吸 收 能 量 的 过 程 中 产 生 原 子 吸 收 光 谱 原 子 的 吸 收 光 谱 位 于 光 谱 的 紫 外 区 和 可 见 光 区 3. 基 态 原 子 数 和 激 发 态 原 子 数 的 关 系 在 测 定 原 子 吸 收 光 谱 的 条 件 下, 原 子 蒸 汽 中 基 态 原 子 数 近 似 于 总 原 子 数 在 原 子 蒸 汽 中 同 时 存 在 着 待 测 原 子 和 非 待 测 原 子, 而 待 测 原 子 和 非 待 测 原 子 在 测 定 条 件 下 都 可 能 会 有 基 态 原 子 和 激 发 态 原 子 存 在 因 此, 测 定 原 子 吸 收 光 谱 是 在 激 发 态 待 测 原 子 与 基 态 原 子 和 非 基 态 原 子 共 存 的 状 态 下 进 行 的, 是 在 一 个 复 杂 的 环 境 中 进 行 测 定 的 根 据 热 力 学 原 理, 在 一 定 的 温 度 下 物 质 达 到 热 平 衡 状 态 时, 基 态 与 激 发 态 的 原 子 数 的 比 例 遵 循 Boltzmann 分 布 定 律 : Nr 激 发 态 原 子 数 ; No 基 态 原 子 数 ; gt 激 发 态 能 级 的 统 计 权 重 ; go 基 态 能 级 的 统 计 权 重 ; Et 激 发 能 ; k J/K; T 热 力 学 温 度

74 74 在 原 子 吸 收 光 谱 中, 一 定 波 长 的 谱 线 gt/go,et 是 已 知 值 因 此, 就 可 以 根 据 上 述 公 式 计 算 出 在 一 定 温 度 下 的 Nt /No 值 4. 待 测 元 素 的 定 量 测 定 待 测 元 素 的 自 由 原 子 经 过 吸 收 所 产 生 的 吸 收 信 号, 所 测 吸 光 度 大 小 与 试 样 中 该 元 素 的 含 量 成 正 比 可 用 下 式 表 示 : A = K 式 中 :A 是 试 样 的 吸 光 度 ; 是 被 测 元 素 在 试 样 中 的 浓 度 ;K 是 比 例 常 数 此 过 程 和 分 光 光 度 法 很 相 似, 只 是 它 们 的 吸 收 池 不 同, 一 个 是 溶 液 的 分 子, 一 个 是 火 焰 ( 或 电 加 热 设 备 ) 中 的 自 由 原 子 每 个 元 素 的 空 心 阴 极 灯 都 发 出 该 元 素 特 有 的 具 有 准 确 波 长 的 光, 将 这 些 光 称 为 元 素 的 吸 收 谱 线 或 元 素 的 共 振 线 有 很 多 元 素 有 多 条 吸 收 谱 线, 谱 线 的 波 长 单 位 为 nm 原 子 吸 收 光 谱 分 析 的 优 点 较 其 他 分 析 光 谱 相 比, 原 子 吸 收 光 谱 分 析 主 要 优 点 有 : 1 灵 敏 度 高 : 一 般 情 况 下 灵 敏 度 可 达 到 10-14g, 一 般 石 墨 炉 原 子 吸 收 光 谱 法 可 达 到 10-16g; 2 专 一 性 强 : 多 数 情 况 下 共 存 元 素 对 被 测 元 素 不 产 生 干 扰, 样 品 无 需 纯 化 ; 3 分 析 速 度 快 : 测 试 一 个 样 品 最 快 只 需 几 十 秒 钟 ; 4 应 用 广 : 可 以 测 定 无 机 化 合 物 有 机 化 合 物 和 生 物 大 分 子 ; 5 制 样 简 单 : 可 以 直 接 测 定 固 态 样 品 液 态 样 品 和 气 态 样 品 ; 6 操 作 方 便 : 只 要 把 样 品 直 接 送 入 原 子 化 器 即 可 进 行 分 析, 有 些 固 体 样 品 还 可 以 直 读 第 二 篇 生 物 实 验 基 础 1 生 物 实 验 基 本 知 识 1.1 实 验 室 工 作 细 则 实 验 室 的 任 何 东 西 都 有 它 最 应 该 放 的 地 方 切 记, 哪 里 拿 的 放 回 哪 里 实 验 室 区 域 划 分 : 实 验 室 分 公 用 区 域 和 个 人 实 验 区 域 个 人 使 用 区 主 要 为 指 定 的 实 验 桌 和 试 剂 架, 指 定 的 坐 位, 指 定 的 4 和 -20 使 用 区, 冷 库 使 用 区 ; 公 用 区 域 包 括 细 胞 室 大 小 摇 床 大 小 离 心 机 PR 仪 称 量 区 HPL 室 动 物 箱 破 菌 机 成 像 系 统 核 酸 电 泳 区 和 蛋 白 质 电 泳 区 灭 菌 室 RNA 实 验 区 冷 库 生 活 区 浴 室 等 所 有 公 用 区 需 要 保 持 清 洁 和 空 闲, 不 能 因 为 个 人 样 品 不 收 拾 而 影 响 别 人 的 正 常 使 用 试 剂 是 实 验 室 的 血 液 任 何 试 剂 接 近 用 完 时, 或 有 特 殊 试 剂 需 求 时, 必 须 先 向 实 验 室 负

75 75 责 试 剂 定 购 的 人 员 提 出, 必 要 时 向 实 验 室 负 责 人 商 量 定 购 事 宜 正 确 的 标 签, 是 保 证 实 验 室 正 常 运 转 的 最 低 要 求 标 签 必 须 写 明 4 个 要 素 : 试 剂 名 称 浓 度 ( 及 ph) 人 名 日 期 如 果 高 温 灭 菌 过, 也 请 注 明 严 格 禁 止 使 用 个 人 编 号 只 要 是 使 用 时 间 在 一 天 以 上, 就 要 具 体 写 清 楚 这 4 个 要 素 要 像 小 狗 见 了 电 线 杆 一 样, 多 多 留 下 你 的 标 签 强 烈 建 议 所 使 用 的 试 剂 一 定 要 自 己 配 器 皿 洗 涤 : 个 人 使 用 的 玻 璃 和 塑 料 器 皿, 需 要 各 自 负 责 清 洗 凉 干 玻 璃 器 皿 橱 灭 菌 室 门 仪 器 室 门 要 始 终 保 持 关 闭 状 态 如 果 你 相 信 只 由 你 一 个 人 使 用 的 物 品, 可 以 存 放 在 你 自 己 的 抽 屉 1.2 实 验 室 动 物 卫 生 防 疫 一 般 预 防 措 施 1) 饲 养 人 员 严 格 按 照 饲 养 管 理 规 程 和 卫 生 防 疫 规 程 进 行 操 作, 作 好 记 录, 发 现 情 况, 及 时 汇 报 2) 饲 养 人 员 不 得 接 触 非 本 场 的 家 畜 家 禽, 防 止 野 禽 野 生 动 物 侵 入 场 内 3) 严 格 遵 守 卫 生 消 毒 制 度, 降 低 环 境 设 施 中 的 病 原 体 含 量 严 绷 头 脑 中 的 消 毒 观 念, 万 万 不 能 麻 痹 大 意, 更 不 能 敷 衍 了 事 4) 不 从 疫 区 引 进 实 验 动 物 5) 饲 料 垫 料 的 存 放 环 境 应 干 燥 通 风, 饲 料 应 达 到 相 应 的 国 家 标 准 6) 不 同 种 类, 不 同 品 系 不 同 年 龄 的 动 物 应 分 开 饲 养, 防 止 交 叉 感 染, 严 防 饲 养 人 员 串 岗, 外 来 购 买 或 领 用 实 验 动 物 者 不 能 进 入 饲 养 室 7) 有 关 人 员 每 年 进 行 健 康 检 查, 患 有 传 染 病 的 人 员 不 能 从 事 实 验 动 物 工 作 8) 定 期 检 疫, 发 现 情 况 及 时 按 有 关 规 定 处 理 9) 如 发 现 疾 病, 及 时 诊 断, 及 时 采 取 措 施, 或 隔 离, 或 淘 汰 1.3 生 物 实 验 用 仪 器 清 洗 与 清 洁 实 验 中 所 用 的 玻 璃 仪 器 等 清 洁 与 否 直 接 影 响 实 验 的 结 果, 往 往 由 于 仪 器 的 不 清 洁 或 被 污 染 而 造 成 较 大 的 实 验 误 差, 有 时 甚 至 会 导 致 实 验 的 失 败 做 生 物 化 学 实 验 对 玻 璃 仪 器 清 洁 程 度 的 要 求, 比 一 般 化 学 实 验 的 要 求 更 高, 这 是 因 为 :1 生 物 化 学 实 验 中 蛋 白 质 酶 核 酸 等 往 往 都 是 以 毫 克 和 微 克 计 的, 稍 有 杂 质, 影 响 就 很 大 ;2 生 物 化 学 实 验 对 许 多 常 见 的 污 染 杂 质 十 分 敏 感, 如 金 属 离 子 ( 钙 镁 离 子 等 ) 去 污 剂 和 有 机 物 残 基 等, 因 此 玻 璃 仪 器 ( 包 括 离 心 管 等 塑 料 器 皿 ) 是 否 彻 底 清 洗 净 是 非 常 重 要 的 仪 器 的 清 洗

76 76 1 初 用 玻 璃 仪 器 的 清 洗 新 购 买 的 玻 璃 仪 器 表 面 常 附 着 有 游 离 的 碱 性 物 质, 可 先 用 0.5% 的 去 污 剂 洗 刷, 再 用 自 来 水 洗 净, 然 后 浸 泡 在 1%~2% 盐 酸 溶 液 中 过 夜 ( 不 可 少 于 4 小 时 ), 再 用 自 来 水 冲 洗, 最 后 用 无 离 子 水 冲 洗 两 次,6 在 100 ~120 烘 箱 内 烘 干 备 用 2 使 用 过 的 玻 璃 仪 器 的 清 洗 做 完 实 验, 应 立 即 把 用 过 的 玻 璃 仪 器 洗 刷 干 净 这 是 由 于 那 时 污 物 比 较 容 易 清 洗, 同 时 由 于 了 解 污 物 的 性 质, 有 利 于 选 用 适 当 的 洗 涤 方 法 使 用 过 的 玻 璃 仪 器 的 清 洗, 可 先 用 自 来 水 洗 刷 至 无 污 物, 再 用 合 适 的 毛 刷 沾 去 污 剂 ( 粉 ) 洗 刷, 或 浸 泡 在 0.5% 的 清 洗 剂 中 超 声 清 洗 ( 比 色 皿 决 不 可 超 声 ), 然 后 用 自 来 水 彻 底 洗 净 去 污 剂, 再 用 无 离 子 水 洗 两 次 玻 璃 仪 器 洗 净 的 标 志 是 水 倾 出 后, 器 壁 上 没 有 水 滴, 否 则 重 洗 若 重 洗 后 仍 挂 有 水 珠, 则 需 用 洗 液 浸 泡 数 小 时 后 ( 或 用 去 污 粉 擦 洗 ), 重 新 清 洗 3 石 英 和 玻 璃 比 色 皿 的 清 洗 绝 不 可 用 强 碱 清 洗, 因 为 强 碱 会 侵 蚀 抛 光 的 比 色 皿 只 能 用 洗 液 或 1%~2% 的 去 污 剂 浸 泡, 然 后 用 自 来 水 冲 洗, 这 时 使 用 一 支 绸 布 包 裹 的 小 棒 或 棉 花 球 棒 刷 洗, 效 果 会 更 好, 清 洗 干 净 的 比 色 皿 内 外 壁 不 挂 水 珠 4 塑 料 器 皿 的 清 洗 聚 乙 烯 聚 丙 烯 等 制 成 的 塑 料 器 皿, 在 生 物 化 学 实 验 中 已 用 的 越 来 越 多 第 一 次 使 用 塑 料 器 皿 时, 可 先 用 8mol/L 尿 素 ( 用 浓 盐 酸 调 ph = 1) 清 洗, 接 着 依 次 用 无 离 子 水 1mol/LKH 和 无 离 子 水 清 洗, 然 后 用 1~3 mol/ledta 除 去 金 属 离 子 的 污 染, 最 后 用 无 离 子 水 彻 底 清 洗, 以 后 每 次 使 用 时, 可 只 用 0.5% 的 去 污 剂 清 洗, 然 后 用 自 来 水 和 无 离 子 水 洗 净 即 可 5 玻 璃 和 塑 料 器 皿 的 干 燥 生 化 实 验 中 用 到 的 玻 璃 和 塑 料 器 皿 经 常 需 要 干 燥, 通 常 都 是 用 烘 箱 或 烘 干 机 在 110 ~ 120 进 行 干 燥, 而 不 要 用 丙 酮 荡 洗 后 再 吹 干 的 方 法 来 干 燥, 因 为 那 样 会 有 残 留 的 有 机 物 覆 盖 在 器 皿 的 内 表 面, 从 而 干 扰 生 物 化 学 反 应 定 量 的 玻 璃 仪 器 不 能 加 热, 一 般 采 取 控 干 或 依 次 用 少 量 酒 精 乙 醚 刷 洗 后 用 温 热 的 气 流 吹 干 硝 酸 纤 维 素 的 塑 料 离 心 管 加 热 时 会 发 生 爆 炸, 所 以 决 不 能 放 在 烘 箱 中 干 燥, 只 能 用 冷 风 吹 干 清 洗 液 的 作 用 原 理 及 配 制 ( 见 第 一 篇 2.2.2)

77 77 2. 生 化 实 验 基 本 操 作 2.1 电 泳 操 作 规 程 及 注 意 事 项 ( 霍 海 玲 提 供 ) 电 泳 操 作 的 基 本 要 点 准 备 干 净 的 配 胶 板 和 电 泳 槽 选 择 电 泳 方 法 正 确 选 择 凝 胶 浓 度 注 意 DNA 酶 污 染 的 仪 器 可 能 会 降 解 DNA, 造 成 条 带 信 号 弱 模 糊 甚 至 缺 失 的 现 象 一 般 的 核 酸 检 测 只 需 要 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 就 可 以 ; 如 果 需 要 分 辨 率 高 的 电 泳, 特 别 是 只 有 几 个 bp 的 差 别 应 该 选 择 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ; 用 普 通 电 泳 不 合 适 的 巨 大 DNA 链 应 该 使 用 脉 冲 凝 胶 电 泳 注 意 巨 大 的 DNA 链 用 普 通 电 泳 可 能 跑 不 出 胶 孔 导 致 缺 带 对 于 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 浓 度 通 常 在 0.5~2% 之 间, 低 浓 度 的 用 来 进 行 大 片 段 核 酸 的 电 泳, 高 浓 度 的 用 来 进 行 小 片 段 分 析 低 浓 度 胶 易 碎, 小 心 操 作 和 使 用 质 量 好 的 琼 脂 糖 是 解 决 办 法 注 意 高 浓 度 的 胶 可 能 使 分 子 大 小 相 近 的 DNA 带 不 易 分 辨, 造 成 条 带 缺 失 现 象

78 78 适 合 的 电 泳 缓 冲 液 电 泳 的 合 适 电 压 和 温 度 DNA 样 品 的 纯 度 和 状 态 常 用 的 缓 冲 液 有 TAE 和 TBE, 而 TBE 比 TAE 有 着 更 好 的 缓 冲 能 力 电 泳 时 使 用 新 制 的 缓 冲 液 可 以 明 显 提 高 电 泳 效 果 注 意 电 泳 缓 冲 液 多 次 使 用 后, 离 子 强 度 降 低,PH 值 上 升, 缓 冲 性 能 下 降, 可 能 使 DNA 电 泳 产 生 条 带 模 糊 和 不 规 则 的 DNA 带 迁 移 的 现 象 电 泳 时 电 压 不 应 该 超 过 20V/cm, 电 泳 温 度 应 该 低 于 30, 对 于 巨 大 的 DNA 电 泳, 温 度 应 该 低 于 15 注 意 如 果 电 泳 时 电 压 和 温 度 过 高, 可 能 导 致 出 现 条 带 模 糊 和 不 规 则 的 DNA 带 迁 移 的 现 象 特 别 是 电 压 太 大 可 能 导 致 小 片 段 跑 出 胶 而 出 现 缺 带 现 象 注 意 样 品 中 含 盐 量 太 高 和 含 杂 质 蛋 白 均 可 以 产 生 条 带 模 糊 和 条 带 缺 失 的 现 象 乙 醇 沉 淀 可 以 去 除 多 余 的 盐, 用 酚 可 以 去 除 蛋 白 注 意 变 性 的 DNA 样 品 可 能 导 致 条 带 模 糊 和 缺 失, 也 可 能 出 现 不 规 则 的 DNA 条 带 迁 移 在 上 样 前 不 要 对 DNA 样 品 加 热, 用 20mM Nal 缓 冲 液 稀 释 可 以 防 止 DNA 变 性 DNA 样 的 上 正 确 的 DNA 上 样 量 是 条 带 清 晰 的 保 证 注 意 太 多 的 DNA 上 样 量 可 能 导 致 DNA 带 型 模 糊, 而 太 小 的 DNA 上 样 量 则 导 致 带 信 号 弱 甚 至 缺 失 TIANGEN 公 司 DNA 分 子 量 标 准 每 次 上 样 6ul 即 可 得 到 清 晰 均 匀 的 条 带 Marker 的 选 择 凝 胶 的 染 色 和 观 察 DNA 电 泳 一 定 要 使 用 DNA Marker 或 已 知 大 小 的 正 对 照 DNA 来 估 计 DNA 片 段 大 小 Marker 应 该 选 择 在 目 标 片 段 大 小 附 近 ladder 较 密 的, 这 样 对 目 标 片 段 大 小 的 估 计 才 比 较 准 确 TIANGEN 公 司 的 DNA Marker 条 带 清 晰, 亮 度 均 匀, 质 量 稳 定, 是 您 实 验 的 首 选 需 要 注 意 的 是 Marker 的 电 泳 同 样 也 要 符 合 DNA 电 泳 的 操 作 标 准 如 果 选 择 λdna/hindiii 或 者 λdna/ecori 的 酶 切 Marker, 需 要 预 先 65 加 热 5min, 冰 上 冷 却 后 使 用 从 而 避 免 HindIII 或 EcoRI 酶 切 造 成 的 粘 性 接 头 导 致 的 片 段 连 接 不 规 则 或 条 带 信 号 弱 等 现 象 实 验 室 常 用 的 核 酸 染 色 剂 是 溴 化 乙 啶 (EB), 染 色 效 果 好, 操 作 方 便, 但 是 稳 定 性 差, 具 有 毒 性 而 其 他 系 列 例 如 SYBR Green,GelRed, 虽 然 毒 性 小, 但 价 格 昂 贵 TIANGEN 公 司 的 GeneGreen 相 比 则 是 性 价 比 高 的 低 毒 替 代 染 料, 其 灵 敏 度 比 传 统 EB 染 料 高 10 倍 以 上 注 意 观 察 凝 胶 时 应 根 据 染 料 不 同 使 用 合 适 的 光 源 和 激 发 波 长, 如 果 激 发 波 长 不 对, 条 带 则 不 易 观 察, 出 现 条 带 模 糊 的 现 象 影 响 电 泳 分 离 的 主 要 因 素 影 响 电 泳 分 离 的 因 素 很 多, 下 面 简 单 讨 论 一 些 主 要 的 影 响 因 素 : (1) 待 分 离 生 物 大 分 子 的 性 质 待 分 离 生 物 大 分 子 所 带 的 电 荷 分 子 大 小 和 性 质 都 会 对 电 泳 有 明 显 影 响 一 般 来 说, 分 子 带 的 电 荷 量 越 大 直 径 越 小 形 状 越 接 近 球 形, 则 其 电 泳 迁 移 速 度 越 快 (2) 缓 冲 液 的 性 质 缓 冲 液 的 ph 值 会 影 响 待 分 离 生 物 大 分 子 的 解 离 程 度, 从 而 对 其 带 电 性 质 产 生 影 响, 溶 液 ph 值 离 等 电 点 愈 远, 其 所 带 净 电 荷 量 就 越 大, 电 泳 的 速 度 也 就 越 大, 尤 其 对 于 蛋 白 质 等 两 性 分 子, 缓 冲 液 ph 还 会 影 响 到 其 电 泳 方 向, 当 缓 冲 液 ph 大 于 蛋 白 质 分 子 的 等 电 点, 蛋 白 质 分 子 带 负 电 荷, 其 电 泳 的 方 向 是 指 向 正 极 为 了 保 持 电 泳 过 程 中 待 分 离 生 物 大 分 子 的 电 荷 以 及 缓 冲 液 ph 值 的 稳 定 性, 缓 冲 液 通 常 要 保 持 一 定 的 离 子 强 度, 一 般 在 , 离 子 强 度 过 低, 则 缓 冲 能 力 差, 但 如 果 离 子 强 度 过 高, 会 在 待 分 离 分 子 周 围 形 成 较 强 的 带 相 反 电 荷

79 79 的 离 子 扩 散 层 ( 即 离 子 氛 ), 由 于 离 子 氛 与 待 分 离 分 子 的 移 动 方 向 相 反, 它 们 之 间 产 生 了 静 电 引 力, 因 而 引 起 电 泳 速 度 降 低 另 外 缓 冲 液 的 粘 度 也 会 对 电 泳 速 度 产 生 影 响 (3) 电 场 强 度 电 场 强 度 (V/cm) 是 每 厘 米 的 电 位 降, 也 称 电 位 梯 度 电 场 强 度 越 大, 电 泳 速 度 越 快 但 增 大 电 场 强 度 会 引 起 通 过 介 质 的 电 流 强 度 增 大, 而 造 成 电 泳 过 程 产 生 的 热 量 增 大 电 流 在 介 质 中 所 做 的 功 (W) 为 : W=I 2 R t 上 式 中 :I 为 电 流 强 度,R 为 电 阻,t 为 电 泳 时 间 电 流 所 作 的 功 绝 大 部 分 都 转 换 为 热, 因 而 引 起 介 质 温 度 升 高, 这 会 造 成 很 多 影 响 :1 样 品 和 缓 冲 离 子 扩 散 速 度 增 加, 引 起 样 品 分 离 带 的 加 宽 ;2 产 生 对 流, 引 起 待 分 离 物 的 混 合 ; 3 如 果 样 品 对 热 敏 感, 会 引 起 蛋 白 变 性 ;4 引 起 介 质 粘 度 降 低 电 阻 下 降 等 等 电 泳 中 产 生 的 热 通 常 是 由 中 心 向 外 周 散 发 的, 所 以 介 质 中 心 温 度 一 般 要 高 于 外 周, 尤 其 是 管 状 电 泳, 由 此 引 起 中 央 部 分 介 质 相 对 于 外 周 部 分 粘 度 下 降, 摩 擦 系 数 减 小, 电 泳 迁 移 速 度 增 大, 由 于 中 央 部 分 的 电 泳 速 度 比 边 缘 快, 所 以 电 泳 分 离 带 通 常 呈 弓 型 降 低 电 流 强 度, 可 以 减 小 生 热, 但 会 延 长 电 泳 时 间, 引 起 待 分 离 生 物 大 分 子 扩 散 的 增 加 而 影 响 分 离 效 果 所 以 电 泳 实 验 中 要 选 择 适 当 的 电 场 强 度, 同 时 可 以 适 当 冷 却 降 低 温 度 以 获 得 较 好 的 分 离 效 果 (4) 电 渗 液 体 在 电 场 中, 对 于 固 体 支 持 介 质 的 相 对 移 动, 称 为 电 渗 现 象 由 于 支 持 介 质 表 面 可 能 会 存 在 一 些 带 电 基 团, 如 滤 纸 表 面 通 常 有 一 些 羧 基, 琼 脂 可 能 会 含 有 一 些 硫 酸 基, 而 玻 璃 表 面 通 常 有 Si-H 基 团 等 等 这 些 基 团 电 离 后 会 使 支 持 介 质 表 面 带 电, 吸 附 一 些 带 相 反 电 荷 的 离 子, 在 电 场 的 作 用 下 向 电 极 方 向 移 动, 形 成 介 质 表 面 溶 液 的 流 动, 这 种 现 象 就 是 电 渗 在 ph 值 高 于 3 时, 玻 璃 表 面 带 负 电, 吸 附 溶 液 中 的 正 电 离 子, 引 起 玻 璃 表 面 附 近 溶 液 层 带 正 电, 在 电 场 的 作 用 下, 向 负 极 迁 移, 带 动 电 极 液 产 生 向 负 极 的 电 渗 流 如 果 电 渗 方 向 与 待 分 离 分 子 电 泳 方 向 相 同, 则 加 快 电 泳 速 度 ; 如 果 相 反, 则 降 低 电 泳 速 度 (5) 支 持 介 质 的 筛 孔 支 持 介 质 的 筛 孔 大 小 对 待 分 离 生 物 大 分 子 的 电 泳 迁 移 速 度 有 明 显 的 影 响 在 筛 孔 大 的 介 质 中 泳 动 速 度 快, 反 之, 则 泳 动 速 度 慢 本 实 验 室 电 泳 房 的 注 意 事 项 1. 本 实 验 室 主 要 进 行 电 泳 实 验, 实 验 中 用 到 的 EB 为 致 癌 物 质, 请 进 入 该 房 间 的 朋 友 们 注 意 安 全, 请 初 次 操 作 的 同 学 先 了 解 后 再 进 行 实 验, 最 好 由 熟 悉 的 同 学 指 导 2. 进 行 有 关 电 泳 实 验 时 请 用 靠 窗 的 水 槽 ( 倾 倒 废 液, 洗 涤 电 泳 槽 和 制 胶 板 等 ); 3. 电 泳 房 的 抹 布 请 在 本 屋 使 用 ; 4. 随 身 携 带 的 包 包 之 类 的 东 西 请 勿 放 置 实 验 台 面 上 ; 5. 实 验 的 同 学 在 实 验 过 程 中 小 心 注 意 安 全 问 题, 如 不 慎 接 触 到 EB, 请 用 大 量 的 清 水 冲

80 80 洗 2.2 常 用 生 物 试 剂 的 保 存 与 配 制 ( 杨 柳 提 供 ) 常 用 生 物 试 剂 的 保 存 试 剂 的 保 存 : 一 些 易 变 性 的 试 剂 要 低 温 保 存, 如 DNA, 蛋 白 质, 酶 等 酶 保 存 时 一 般 需 以 高 浓 度 保 存 以 防 变 性 实 验 所 用 试 剂 一 般 都 配 成 高 浓 度 保 存, 稀 释 成 使 用 浓 度 后 进 行 分 装, 每 次 使 用 独 立 包 装 以 防 交 叉 污 染, 依 试 剂 性 质 低 温 或 避 光 保 存 配 好 的 试 剂 标 好 名 称, 浓 度, 配 制 日 期 常 用 生 物 试 剂 的 配 制 ( 一 ) DNA 探 针 标 记 常 用 试 剂 的 配 制 (1)10 缺 口 平 移 缓 冲 液 :200mmol/l Tris-Hl,pH7.4 含 50mmol/L Mgl2;100mmol/L β- 巯 基 乙 醇 1mg/ml BSA (2) 缺 口 平 移 反 应 终 止 液 :200mmol/L Nal;10mmol/l Tris-Hl,pH7.4; 11mmol/L EDTA; 0.5% SDS (3)DNaseⅠ: 干 粉 状 DNaseⅠ(2000~3000u/mg) 溶 于 20mmol/l Tris-Hl, ph7.5 中 (1mg/ml),10μl 分 装,-20 保 存 一 年 (4)10 DNA 聚 合 酶 Ⅰ(Klenow 片 段 ) 缓 冲 液 :500mmol/l Tris-Hl,pH6.6;100mmol/L Mg-l2;10mmol/L DTT;0.5mg BSA (5)10 激 酶 缓 冲 液 :500mmol/L Tris-Hl,pH7.4,50mmol/L Mgl2;20mmol/L DTT; 1.0mmol/L 亚 精 胺 (6)10 随 机 引 物 标 记 缓 冲 液 ;500mmol/l Tris-Hl,pH6.6;100mmol/L Mgl2;10mmol/L β- 巯 基 乙 醇 ;500μg/ml BSA (7)1 加 尾 缓 冲 液 :100mmol/L 二 甲 胂 化 钾,pH7.0,1mmol/l ol2 0.2mmol/L DTT (8)1mol/L Mgl2:Mgl g 溶 于 500ml 水 中,100ml 分 装, 高 压 灭 菌, 室 温 保 存 (9)0.25mol/L EDTA(Ph8.0):EDTA 52.02g 溶 于 400ml 水 中, 调 ph 至 8.0, 加 水 至 500ml, 100ml 分 装, 高 压 灭 菌, 室 温 保 存 (10)4mol/L 醋 酸 钠 : 取 无 水 醋 酸 钠 82g 溶 于 200ml 水 中, 用 醋 酸 调 ph 至 6.5, 加 水 至 250ml, 高 压 灭 菌, 或 0.45μm 膜 过 滤, 室 温 保 存 (11)10% SDS:10g SDS( 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ) 溶 于 50ml 水 中, 加 水 至 100ml, 分 装 后 室 温 保 存 (12)20 SS: 取 Nal 175.3g; 柠 檬 酸 钠 88.2g; 加 水 至 1000ml, 用 10mol/l NaH 调 ph 至 7.0; 高 压 灭 菌, 室 温 保 存

81 81 (13) 无 菌 水 :100ml 去 离 子 水 或 双 蒸 水, 分 装, 高 压 灭 菌, 室 温 保 存, 开 瓶 后 仅 限 一 周 使 用 ( 14 ) 10 激 酶 缓 冲 液 : 500mmol/L Tris-Hl,pH7.4;100mmol/L Mgl2;50mmol/l DTT;10mmol/L 亚 精 胺 ( 非 必 需 ) (15)T4 多 聚 核 苷 酸 激 酶 :10u/μl, 保 存 在 甘 油 中,-20 (16)TE 缓 冲 液 (Tris/EDTA):Tris,10mmol/l ph7.4(0.5ml 2mol/L 贮 存 液 ),1.0mmol/l ED-TA,pH8.0(20μl 0.5mol/L) 贮 存 液, 加 水 至 100ml, 室 温 保 存 (17)2mol/L Tris-Hl ph7.4:tris242.2g 溶 于 850ml, 加 浓 Hl 75ml, 边 加 边 缓 慢 搅 动, 至 ph7.4, 于 加 水 至 1000ml (18)1mol/L DTT( 二 硫 苏 糖 醇 ):3.0g DTT 溶 于 20ml 水 中, 分 装, 于 -20 贮 存 (19)0.5mol/L EDTA( 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 盐 ): 在 烧 杯 中 先 加 入 300ml 水, 加 入 93.5g EDTA -Na2 2H2, 充 分 混 匀, 加 10mol/l NaH 调 ph 至 8.0, 加 水 至 500ml (20)10mol/L NaH:200g NaH 溶 于 450ml 水 中, 混 匀, 再 加 水 至 500ml (21)5mol/L Nal:292.25g Nal, 加 水 至 1000ml (22)1mol/L Hl: 加 86.2ml 浓 盐 酸 至 913.8ml 水 中 (23)1mol/L al2:147g al2:2h2, 溶 于 1000ml 水 中, 高 压 灭 菌, 室 温 保 存 ( 二 ) LB(Luria-Bertani) 培 养 液 平 板 的 配 制 配 制 每 升 LB 培 养 液, 应 在 950ml 去 离 子 水 中 加 入 : 细 菌 培 养 用 酵 母 提 取 物 (bacto-yeastextract) 5g 细 菌 培 养 用 胰 化 蛋 白 胨 (bacto-tryptone)10g Nal 10g 摇 动 容 器 直 至 溶 质 完 全 溶 解, 用 5mol/LNaH( 约 0.2ml) 调 节 ph 值 至 7.0, 加 入 去 离 子 水 至 总 体 积 为 1L, 在 15 1bf/in2( Pa) 高 压 下 蒸 汽 灭 菌 20min LB 琼 脂 平 板 的 配 制 : 先 按 上 述 配 方 配 制 液 体 培 养 基, 临 高 压 灭 菌 前 加 入 琼 脂 糖 15g /L, 同 法 高 压 蒸 汽 灭 菌 20min 从 高 压 灭 菌 器 取 出 培 养 基 时 应 轻 轻 旋 动 以 使 熔 解 的 琼 脂 糖 能 均 匀 分 布 于 整 个 培 养 基 溶 液 中, 应 使 培 养 基 降 温 至 50 时, 加 入 抗 生 素 等 不 耐 热 的 物 质 为 避 免 产 生 气 泡, 混 匀 培 养 基 时 应 采 取 旋 动 的 方 式, 然 后 可 直 接 从 烧 瓶 中 倾 出 培 养 基 铺 制 平 板 90mm 直 径 的 培 养 皿 约 需 30-50ml 培 养 基, 培 养 基 完 全 凝 结 后, 应 倒 置 平 皿 并 贮 存 于 4 备 用 ( 三 ) 琼 脂 糖 凝 胶 的 配 制 根 据 所 需 凝 胶 的 浓 度 秤 取 琼 脂 糖, 加 入 相 应 电 泳 缓 冲 液 中, 用 微 波 炉 加 热 煮 沸 至 琼 脂 糖 完 全 溶 解, 加 入 适 量 EB 混 匀, 适 当 冷 却 后 倾 入 凝 胶 铸 槽 中, 插 入 梳 子, 凝 胶 厚 度 不 超 过 梳 孔, 如 有 气 泡 产 生 则 用 玻 璃 棒 驱 除, 不 能 过 早 拔 除 梳 子, 应 待 凝 胶 完 全 凝 结 后 才 能 拔 除 梳 子 3.P1 P2 P3 的 配 制 P1 的 配 制 : 在 800ml 去 离 子 水 中 溶 入 Tris 碱 6.06g,Na2EDTA 2H2

82 g, 用 Hl 调 整 ph 至 8.0, 用 去 离 子 水 调 整 容 积 至 1 升, 每 升 P1 内 加 入 RNaseA100mg P2 的 配 制 : 在 950ml 去 离 子 水 中 溶 入 NaH 8.0g,20%SDS 50ml, 调 整 容 积 至 1 升 P3 的 配 制 : 在 500ml 去 离 子 水 中 溶 入 醋 酸 钾 294.5g, 用 冰 醋 酸 调 整 ph 值 至 5.5, 用 去 离 子 水 调 整 容 积 至 1 升 2.3 灭 菌 方 法 及 注 意 事 项 ( 杨 柳 协 助 ) 常 用 的 灭 菌 方 法 可 分 为 物 理 的 和 化 学 的 两 类, 即 : 物 理 方 法 如 干 热 ( 烘 烧 和 灼 烧 ) 湿 热 ( 常 压 或 高 压 蒸 煮 ) 射 线 处 理 ( 紫 外 线 超 声 波 微 波 ) 过 滤 清 洗 和 大 量 无 菌 水 冲 洗 等 措 施 ; 化 学 方 法 是 使 用 升 汞 甲 醛 过 氧 化 氢 高 锰 酸 钾 来 苏 水 漂 白 粉 次 氯 酸 钠 抗 菌 素 酒 精 化 学 药 品 处 理 这 些 方 法 和 药 剂 要 根 据 工 作 中 的 不 同 材 料 不 同 目 的 适 当 选 用 物 理 方 法 1. 温 度 1 干 热 灭 菌 法 : a. 灼 烧 灭 菌 法 : 利 用 火 焰 直 接 把 微 生 物 烧 死 此 法 彻 底 可 靠, 灭 菌 迅 速, 但 易 焚 毁 物 品, 所 以 使 用 范 围 有 限, 只 适 合 于 接 种 针 环 试 管 口 及 不 能 用 的 污 染 物 品 或 实 验 动 物 的 尸 体 等 的 灭 菌 ; b. 干 热 空 气 灭 菌 法 : 这 是 实 验 室 中 常 用 的 一 种 方 法, 即 把 待 灭 菌 的 物 品 均 匀 地 放 入 烘 箱 中, 升 温 至 160, 恒 温 1 小 时 即 可 此 法 适 用 于 玻 璃 皿 金 属 用 具 等 的 灭 菌 2 湿 热 灭 菌 法 在 同 样 的 温 度 下, 湿 热 灭 菌 的 效 果 比 干 热 灭 菌 好, 这 是 因 为 一 方 面 细 胞 内 蛋 白 质 含 水 量 高, 容 易 变 性 另 一 方 面 高 温 水 蒸 汽 对 蛋 白 质 有 高 度 的 穿 透 力, 从 而 加 速 蛋 白 质 变 性 而 迅 速 死 亡 a. 巴 氏 消 毒 法 : 有 些 食 物 会 因 高 温 破 坏 营 养 成 分 或 影 响 质 量, 如 牛 奶 酱 油 啤 酒 等, 所 以 只 能 用 较 低 的 温 度 来 杀 死 其 中 的 病 原 微 生 物, 这 样 既 保 持 食 物 的 营 养 和 风 味, 又 进 行 了 消 毒, 保 证 了 食 品 卫 生 该 法 一 般 在 62,30 分 钟 既 可 达 到 消 毒 目 的 此 法 为 法 国 微 生 物 学 家 巴 斯 德 首 创, 故 名 为 巴 氏 消 毒 法 b. 煮 沸 消 毒 法 : 直 接 将 要 消 毒 的 物 品 放 入 清 水 中, 煮 沸 15 分 钟, 即 可 杀 死 细 菌 的 全 部 营 养 和 部 分 芽 孢 若 在 清 水 中 加 入 1% 碳 酸 钠 或 2% 的 石 炭 酸, 则 效 果 更 好 此 法 适 用 于 注 射 器 毛 巾 及 解 剖 用 具 的 消 毒 c. 间 歇 灭 菌 法 : 上 述 两 种 方 法 在 常 压 下, 只 能 起 到 消 毒 作 用, 而 很 难 做 到 完 全 无 菌 若 采 用 间 歇 灭 菌 的 方 法, 就 能 杀 灭 物 品 中 所 有 的 微 生 物 具 体 做 法 是 : 将 待 灭 菌 的 物 品 加 热 至 100,15~30 分 钟, 杀 死 其 中 的 营 养 体 然 后 冷 却, 放 入 37 恒 温 箱 中 过 夜, 让 残 留

83 83 的 芽 孢 萌 发 成 营 养 体 第 2 天 再 重 复 上 述 步 骤, 三 次 左 右, 就 可 达 到 灭 菌 的 目 的 此 法 不 需 加 压 灭 菌 锅, 适 于 推 广, 但 操 作 麻 烦, 所 需 时 间 长 d. 加 压 蒸 汽 灭 菌 法 : 这 是 发 酵 工 业 医 疗 保 健 食 品 检 测 和 微 生 物 学 实 验 室 中 最 常 用 的 一 种 灭 菌 方 法 它 适 用 于 各 种 耐 热 体 积 大 的 培 养 基 的 灭 菌, 也 适 用 于 玻 璃 器 皿 工 作 服 等 物 品 的 灭 菌 加 压 蒸 汽 灭 菌 是 把 待 灭 菌 的 物 品 放 在 一 个 可 密 闭 的 加 压 蒸 汽 灭 菌 锅 中 进 行 的, 以 大 量 蒸 汽 使 其 中 压 力 升 高 由 于 蒸 汽 压 的 上 升, 水 的 沸 点 也 随 之 提 高 在 蒸 汽 压 达 到 公 斤 / 2 厘 米 时, 加 压 蒸 汽 灭 菌 锅 内 的 温 度 可 达 到 121 在 这 种 情 况 下, 微 生 物 ( 包 括 芽 孢 ) 在 15~20 分 钟 便 会 被 杀 死, 而 达 到 灭 菌 目 的 如 灭 菌 的 对 象 是 砂 土 石 蜡 油 等 面 积 大 含 菌 多 传 热 差 的 物 品, 则 应 适 当 延 长 灭 菌 时 间 使 用 高 压 锅 的 步 骤 为 : 加 水 至 水 位 线 装 锅 加 盖 加 热 升 温 压 力 至 0.5 公 斤 / 平 方 厘 米 时, 打 开 排 气 阀 排 除 锅 内 冷 空 气, 压 力 降 至 0, 排 气 阀 有 大 量 热 蒸 汽 冲 出 时, 关 闭 排 气 阀 继 续 升 温, 压 力 升 至 规 定 指 标, 温 度 达 到 规 定 指 标 时, 开 始 调 火 稳 压 规 定 时 间 灭 火 降 压 开 盖 取 物 在 加 压 蒸 汽 灭 菌 中, 要 引 起 注 意 的 两 个 问 题 是, 一 是 装 锅 之 前 要 检 查 是 否 加 水 至 水 位 线 ; 二 是 在 恒 压 之 前, 一 定 要 排 尽 灭 菌 锅 中 的 冷 空 气, 否 则 表 上 的 蒸 汽 压 与 蒸 汽 温 度 之 间 不 具 对 应 关 系, 这 样 会 大 大 降 低 灭 菌 效 果 使 用 高 压 蒸 气 灭 菌 锅 时 的 注 意 事 项 第 一, 紧 盖 和 开 盖 时, 都 应 采 用 对 角 式 均 匀 地 转 动 紧 固 螺 栓, 并 且 双 手 同 时 操 作 切 不 可 采 用 将 紧 固 螺 栓 逐 个 拧 紧 或 松 开 的 方 法 第 二, 灭 菌 结 束 以 后, 切 勿 过 早 打 开 排 气 阀, 否 则, 开 盖 时 试 管 内 的 培 养 基 会 由 于 内 外 压 力 不 平 衡 而 冲 出 管 口, 使 棉 塞 上 沾 染 培 养 基 而 发 生 污 染 第 三, 在 灭 菌 过 程 中, 应 注 意 排 净 锅 内 冷 空 气, 锅 内 冷 空 气 如 排 放 不 净, 会 影 响 灭 菌 效 果, 达 不 到 彻 底 灭 菌 的 目 的 2 辐 射 利 用 辐 射 进 行 灭 菌 消 毒, 可 以 避 免 高 温 灭 菌 或 化 学 药 剂 消 毒 的 缺 点, 所 以 应 用 越 来 越 广, 目 前 主 要 应 用 在 以 下 几 个 方 面 : 1 接 种 室 手 术 室 食 品 药 物 包 装 室 常 应 用 紫 外 线 杀 菌 2 应 用 β 射 线 作 食 品 表 面 杀 菌,γ 射 线 用 于 食 品 内 部 杀 菌 经 辐 射 后 的 食 品, 因 大 量 微 生 物 被 杀 灭, 再 用 冷 冻 保 藏, 可 使 保 存 期 延 长 无 菌 室 一 支 200 伏 3 瓦 的 紫 外 线 灯 管, 每 次 开 20~30 分 钟, 就 能 达 到 空 间 杀 菌 的 目 的 照 射 结 束 后, 罩 黑 布 半 小 时, 以 增 强 杀 菌 效 果 注 意 事 项 : 进 行 无 菌 操 作 时 应 检 查 紫 外 灯 是 否 关 掉, 以 免 造 成 伤 害 如 果 不 幸 被 轻 微 射 伤 时 要 特 别 注 意 眼 睛 的 保 护, 频 繁 滴 眼 药 水, 以 缓 解 症 状 严 重 时 要 尽 快 去 医 院 检 查

84 84 3 过 滤 采 用 机 械 方 法, 设 计 一 种 滤 孔 比 细 菌 还 小 的 筛 子, 做 成 各 种 过 滤 器 通 过 过 滤, 只 让 液 体 培 养 基 从 筛 子 中 流 下, 而 把 各 种 微 生 物 菌 体 留 在 筛 子 上 面, 从 而 达 到 除 菌 的 目 的 这 种 灭 菌 方 法 适 用 于 一 些 对 热 不 稳 定 的 体 积 小 的 液 体 培 养 基 的 灭 菌 以 及 气 体 的 灭 菌 它 的 最 大 优 点 是 不 破 坏 培 养 基 中 各 种 物 质 的 化 学 成 分 但 是 比 细 菌 还 小 的 病 毒 仍 然 能 留 在 液 体 培 养 基 内, 有 时 会 给 实 验 带 来 一 定 的 麻 烦 化 学 方 法 常 用 消 毒 剂 现 将 常 用 的 消 毒 药 品 及 其 配 制 使 用 方 法, 介 绍 如 下 : 1.35% 甲 醛 水 溶 液 (HH): 又 名 福 尔 马 林, 使 蛋 白 质 变 性 用 于 培 养 室 无 菌 室 的 灭 菌 2.0.1% 的 升 汞 水 (HgL3): 能 使 蛋 白 质 变 性, 抑 制 酶 类 0.1% 升 汞 配 制 方 法 是 称 取 升 汞 0.1 克, 用 少 许 酒 精 溶 解, 再 加 水 至 100 毫 升 即 成 用 于 无 菌 箱 培 养 箱 培 养 皿 四 周 表 面 以 及 手 指 的 灭 菌 3. 石 炭 酸 (6H5H),5% 浓 度 喷 雾 后, 能 使 蛋 白 变 性 沉 淀 石 炭 酸 ( 苯 酚 )50 毫 升, 加 水 950 毫 升 配 成 用 于 工 作 服 实 验 桌 的 灭 菌 杀 菌 效 果 同 升 汞 4. 高 锰 酸 钾 (KMn4): 氧 化 剂 0.1% 浓 度 能 使 蛋 白 质 与 氨 基 酸 氧 化, 失 去 酶 的 活 性, 用 于 消 毒, 能 抑 制 或 杀 死 杂 菌 5. 乙 醇 (H3H3H): 又 称 酒 精 消 毒 以 75% 浓 度 的 效 果 最 好 它 能 使 蛋 白 质 脱 水 变 性 高 浓 度 酒 精 会 使 蛋 白 质 很 快 脱 水 凝 固, 消 毒 作 用 反 而 减 弱 6. 新 洁 尔 灭 :0.25% 新 洁 尔 灭 用 于 无 菌 箱 无 菌 室 的 灭 菌 一 般 新 洁 尔 灭 5% 原 液 50 毫 升 ; 加 水 950 毫 升 配 成 7. 漂 白 粉 水 : 取 漂 白 粉 10 克, 加 水 140 毫 升 配 成 通 常 在 使 用 前 临 时 配 制, 静 置 1~ 2 小 时, 取 上 清 液 喷 射, 进 行 室 内 消 毒, 每 平 方 米 用 1 升 8. 药 皂 : 煤 酚 皂 硼 酸 皂 等 各 种 药 皂 的 水 溶 液, 均 可 用 于 器 具 橡 皮 塞 及 手 指 的 消 毒 9. 多 菌 灵 : 用 于 杀 灭 真 菌 半 知 茵 1:800 倍 拌 料 或 1:500 倍 喷 洒 均 可 2.4 细 胞 培 养 注 意 事 项 ( 杨 柳 提 供 ) 1. 建 立 无 菌 操 作 的 概 念, 规 范 操 作, 防 止 细 胞 染 菌. 所 有 与 细 胞 接 触 的 设 备 器 材 和 溶 等, 都 必 须 保 持 绝 对 无 菌, 避 免 细 胞 外 微 生 物 的 污 染 目 前 最 可 靠 和 最 常 用 的 灭 菌 方 法 是 高 压 蒸 汽 灭 菌 试 管 吸 管 等, 则 可 采 用 干 热 灭 菌 ; 一 切 不 适 于 加 热 灭 菌 的 液 体, 如 人 工 合 成 培 养 液 小 牛 血 清 胰 蛋 白 酶 等 溶 液, 可 采 用 过 滤

85 85 法 除 菌 2. 必 须 有 足 够 的 营 养 供 应, 而 绝 对 不 可 有 有 害 的 物 质, 包 括 极 微 量 的 有 害 离 子 的 掺 入, 为 此 必 须 注 意 器 材 的 清 洗 和 配 液 用 水 的 质 量 3. 保 证 有 适 量 的 氧 气 供 应 细 胞 代 谢 需 要 有 空 气, 否 则 细 胞 死 亡 在 用 培 养 瓶 进 行 静 止 培 养, 或 用 转 瓶 进 行 旋 转 培 养 时, 只 要 培 养 的 液 体 量 不 超 过 总 容 量 的 30%, 通 过 与 液 面 的 空 气 交 换, 可 以 保 证 细 胞 有 足 够 的 氧 气 当 用 罐 子 深 层 培 养 时, 则 必 须 通 气, 一 般 采 用 含 5%2 的 空 气, 或 根 据 需 要 将 2 N 2 2 和 空 气 以 不 同 比 例 混 合, 过 量 的 氧 对 细 胞 的 生 长 也 不 利 4. 需 随 时 清 除 细 胞 代 谢 中 产 生 的 有 害 产 物 细 胞 在 代 谢 过 程 中 会 产 生 大 量 代 谢 废 物, 如 2 乳 酸 氨 尿 素 吲 哚 等, 这 些 产 物 对 细 胞 的 生 存 有 害, 必 须 及 时 清 除 在 小 量 培 养 时, 当 培 养 基 中 酚 红 指 示 剂 显 示 黄 色, 表 示 已 有 相 当 量 乳 酸 产 生, 要 及 时 更 换 新 鲜 的 培 养 基 在 大 量 培 养 时, 则 需 随 时 测 定 葡 萄 糖 和 乳 酸 等 含 量, 并 调 节 灌 流 速 度, 使 代 谢 产 物 保 持 在 无 害 水 平 下 5. 有 良 好 的 适 于 其 生 存 的 外 界 环 境, 包 括 温 度 ph 渗 透 压 和 离 子 浓 度 等 不 同 的 细 胞 对 ph 的 要 求 不 同, 一 般 来 说 适 于 细 胞 生 长 的 ph 在 6.8~7.4, 过 高 或 过 低 均 不 利 于 细 胞 生 长 如 上 所 述, 细 胞 在 代 谢 过 程 中 会 产 生 大 量 乳 酸, 使 培 养 的 ph 下 降 为 了 保 持 培 养 液 的 ph, 常 在 培 养 液 内 加 入 各 种 缓 冲 系 统, 如 Na2HP4/Na2HP4 NaH3/H23(2) Tricineglycine, 以 及 加 缓 冲 剂 Hepes 液 ( 常 用 浓 度 为 10~50mol/L). 6. 及 时 分 种, 保 持 合 适 的 细 胞 密 度 ( 见 细 胞 传 代 ) 一 些 细 节 问 题 (1) 操 作 过 程 注 意 事 项 实 验 进 行 前, 无 菌 室 及 无 菌 操 作 台 (laminar flow) 以 紫 外 灯 照 射 分 钟 灭 菌, 以 70 %ethanol 擦 拭 无 菌 操 作 抬 面, 并 开 启 无 菌 操 作 台 风 扇 运 转 10 分 钟 后, 才 开 始 实 验 操 作 实 验 中 要 用 到 的 试 剂 及 器 材 都 要 事 先 消 毒 灭 菌 明 确 实 验 步 骤, 一 次 性 将 所 需 实 验 器 材 和 物 品 要 准 备 好, 避 免 开 始 实 验 后, 因 物 品 不 全 往 返 拿 取 而 增 加 污 染 机 会 为 拿 取 方 便, 工 作 台 面 上 的 用 品 要 有 合 理 的 布 局, 原 则 上 应 是 右 手 使 用 的 东 西 放 置 在 右 侧, 左 手 用 品 在 左 侧, 酒 精 灯 置 于 中 央 在 无 菌 环 境 进 行 培 养 或 做 其 它 无 菌 工 作 时, 首 先 要 点 燃 酒 精 灯 或 煤 气 灯 操 作 前 用 酒 精 擦 拭 超 净 台 面 及 双 手 以 后 一 切 操 作, 都 需 在 火 焰 近 处 并 经 过 烧 灼 进 行 如 果 实 验 过 程 中 手 触 及 可 能 污 染 的 物 品 和 出 入 培 养 室 都 要 重 新 用 消 毒 液 洗 手 小 心 取 用 无 菌 之 实 验 物 品, 避 免 造 成 污 染 勿 碰 触 吸 管 尖 头 部 或 是 容 器 瓶 口, 亦 不 要 在 打 开 之 容 器 正 上 方 操 作 实 验 容 器 打 开 后, 以 手 夹 住 瓶 盖 并 握 住 瓶 身, 倾 斜 约 45 角 取 用, 尽 量 勿 将 瓶 盖 盖 口 朝 上 放 置 桌 面 每 次 操 作 只 处 理 一 株 细 胞 株, 以 避 免 失 误 混 淆 或 细 胞 间 污 染 实 验 完 毕 后, 将 实 验 物 品 带 出 工 作 台, 以 70 % ethanol 擦 拭 无 菌 操 作 抬 面 操 作 间 隔

86 86 应 让 无 菌 操 作 台 运 转 10 分 钟 以 上 后, 再 进 行 下 一 个 细 胞 株 之 操 作 (2) 细 胞 传 代 培 养 或 更 换 培 养 液 时 注 意 区 分 清 是 贴 壁 培 养 细 胞 还 是 悬 浮 培 养 细 胞 贴 壁 细 胞 : 对 于 贴 壁 细 胞 应 先 吸 ( 倒 ) 尽 培 养 基, 吸 的 越 干 净 越 好, 以 免 中 和 后 加 入 的 消 化 液, 使 强 度 减 弱.50ml 培 养 瓶 加 入 消 化 液 约 0.6ml, 按 此 比 例 进 行 消 化,( 根 据 配 制 强 度 经 验 ), 晃 动 使 消 化 液 铺 均 匀 置 37 度 培 养 箱 约 2 分 钟, 镜 下 见 细 胞 收 缩 变 圆 或 少 数 脱 落 后, 轻 轻 振 动 瓶 底 使 细 胞 全 部 脱 落, 加 入 2-3ml 完 全 培 养 基 后, 轻 轻 吹 打, 使 细 胞 基 本 成 单 个 悬 浮, 然 后 分 置 其 它 无 菌 培 养 瓶 内, 加 入 完 全 培 养 基 后 继 续 培 养 或 实 验. 悬 浮 细 胞 : 一 般 传 代 可 直 接 将 细 胞 原 液 分 置 其 它 培 养 瓶 内, 加 入 完 全 培 养 基 继 续 培 养, 如 要 高 浓 度 可 先 离 心 500rpm,5min 后 加 入 完 全 培 养 基, 轻 轻 吹 匀 后, 分 置 其 它 培 养 瓶 内 加 入 完 全 培 养 基 继 续 培 养. (3) 操 作 完 成 后 在 培 养 瓶 上 要 标 记 好 细 胞 的 来 源, 类 型, 培 养 的 日 期, 操 作 人 (4) 注 意 安 全 在 酒 精 灯 旁 操 作 时, 在 注 意 无 菌 操 作 的 同 时 要 避 免 被 酒 精 灯 灼 伤 对 于 来 自 人 类 或 是 病 毒 感 染 之 细 胞 株 应 特 别 小 心 操 作, 并 选 择 适 当 等 级 之 无 菌 操 作 台 ( 至 少 lass II) 操 作 过 程 中, 应 避 免 引 起 aerosol 之 产 生, 小 心 毒 性 药 品, 例 如 DMS 及 TPA 等, 并 避 免 尖 锐 针 头 之 伤 害 等 2.5 核 酸 的 分 离 与 纯 化 及 注 意 事 项 ( 陈 小 洪 提 供 ) 核 酸 的 分 离 与 化 纯 核 酸 存 在 于 多 种 细 胞, 如 病 毒 细 菌 寄 生 虫 动 植 物 细 胞 ; 多 种 标 本 中, 如 血 液 组 织 唾 液 尿 液 等 其 它 来 源 的 标 本 因 此 分 离 方 法 复 杂 而 多 样 又 因 各 种 DNA RNA 的 丰 度 差 异, 各 种 分 析 方 法 对 核 酸 的 纯 度 与 量 的 要 求 有 差 异, 因 此 在 实 验 前 应 对 采 用 的 方 法 有 所 了 解 和 选 择 总 的 说 来 核 酸 的 分 离 与 纯 化 是 在 溶 解 细 胞 的 基 础 上, 利 用 苯 酚 等 有 机 溶 剂 抽 提 ( 核 酸 溶 于 缓 冲 液, 即 水 相 ), 分 离, 纯 化 ; 乙 醇 丙 酮 等 有 机 溶 剂 沉 淀, 收 获 溶 解 细 胞 的 方 法 因 标 本 不 同 而 不 同, 有 用 SDS 加 NaH, 有 用 蛋 白 酶, 有 的 用 超 声 波 破 碎 等 方 法, 苯 酚 提 取 主 要 使 蛋 白 质 变 性 沉 淀 于 有 机 相, 而 核 酸 保 留 在 水 相, 达 到 分 离 核 酸 的 目 的 实 验 上 生 物 标 本 中 含 量 最 多 的 就 是 蛋 白 质 为 了 除 去 分 离 过 程 中 残 留 的 有 机 溶 剂, 常 用 的 方 法 是 加 冷 乙 醇 和 盐 沉 淀 核 酸, 通 过 离 心 回 收 核 酸, 然 后 用 70%-80% 乙 醇 洗 涤 沉 淀, 除 去 多 余 的 盐, 以 免 影 响 核 酸 溶 解 和 抑 制 后 续 步 骤 的 酶 促 反 应 为 了 得 到 纯 的 核 酸 可 用 蛋 白 酶 除 去 蛋 白, 用 RNA 酶 除 去 RNA, 得 到 纯 的 DNA, 用 DNA 酶 除 去 DNA 而 获 得 RNA 目 前 开 发 了 许 多 商 品 化 的 核

87 87 酸 分 离 柱, 可 简 单 快 速 地 分 离 得 到 纯 度 很 高 的 DNA 或 RNA 其 分 离 原 理 有 的 利 用 核 酸 的 分 子 量 差 异, 有 的 利 用 需 分 离 核 酸 的 特 点 与 其 特 异 性 结 合 达 到 分 离 回 收 的 目 的 1. 质 粒 的 分 离 与 纯 化 含 质 粒 的 E. oli cells 经 LB 培 养 液 250ml 扩 大 培 养, 倒 入 50ml 离 心 管,4,3000rpm, 离 心 15 分 钟 弃 去 上 清 液 ( 弃 去 液 丢 弃 前 应 作 消 毒 处 理, 以 免 污 染 环 境 ) 加 lysis buffer(50mmol/l Glucose,10mmol/l EDTA,25mmol/l Tris-Hl,pH8.0)1-2ml 使 之 悬 浮 放 置 室 温 5 分 钟, 加 3.5-7ml 新 配 制 SDS/NaH 溶 液 (1mol/l NaH 8ml,20%SDs 2ml, 蒸 馏 水 30ml) 上 下 摇 匀, 置 冰 水 浴 5 分 钟 禁 用 混 匀 器, 以 免 DNA 分 子 断 裂 ), 加 2.5mol/L 醋 酸 钾 缓 冲 液 (ph4.8) ml, 上 下 摇 匀, 冰 浴 5 分 钟 4,3000rpm, 离 心 15 分 钟 沉 淀 蛋 白 质 取 上 清 液, 加 无 水 乙 醇 12-24ml( 上 清 液 的 二 倍 ) 放 室 温 15 分 钟 后,10000rpm 离 心, 弃 上 清 液 加 约 为 沉 淀 物 体 积 的 0.4 倍 TE(10mmol/l Tris-Hcl ph8.0,10mmol/l EDTA) 溶 解 沉 淀 后, 加 0.2 倍 的 7.5mol/L 醋 酸 铵 可 用 混 匀 器 混 匀, 置 冰 浴 10 分 钟 4,10000rpm 离 心 5min, 弃 上 清 液 加 沉 淀 物 0.4 倍 的 10mmol/l Tris-Hl ph7.5,10mmol/l EDTA 缓 冲 液,1/10 体 积 的 5mg/ml RNase,37,30 分 钟 保 温 加 等 量 的 phenol( 酚 )/IAA(480ml 氯 仿,20ml 异 戊 醇 ), 混 匀 4,10000rpm, 离 心 5 分 钟 取 上 层 液 加 酚 /IAA 重 复 一 次 取 上 层 液 加 1/10 体 积 5mol/l Nal 和 2 倍 无 水 乙 醇, 20 过 夜 或 70 2 小 时 以 上 4, 10000rpm, 离 心 10 分 钟, 弃 上 清 液 加 80% 乙 醇 不 摇 动, 直 接 10000rpm 离 心, 弃 上 清 液, 真 空 干 燥 加 适 量 ( 约 200μl)TE 溶 解 测 定 含 量 后 备 用 2. 重 组 质 粒 中 目 的 基 因 的 分 离 与 纯 化 先 取 少 量 纯 化 的 重 组 质 粒, 用 限 制 性 内 切 酶 切 出 目 的 基 因, 经 电 泳 分 离, 确 认 以 200μl 含 2mg DNA( 重 组 质 粒 ) 为 例 : 取 10μl 含 100μg DNA, 加 90μl TE 按 1μg DNA 加 2-5U 限 制 性 内 切 酶,1/10 体 积 缓 冲 液,1-2 小 时 保 温 缓 冲 液 种 类 和 酶 反 应 温 度 因 内 切 酶 种 类 而 异 1/10 体 积 3mol/l NaAc,2 倍 无 水 乙 醇,-70,2 小 时 (-20 过 夜 ),10000rpm, 10 分 钟 离 心, 弃 上 清 液 ( 乙 醇 沉 淀 ) 适 量 TE 溶 解 沉 淀 ( 切 断 的 DNA 质 粒 与 目 的 基 因 混 合 物 ), 电 泳 分 离 ( 用 相 应 分 子 量 DNA 标 准 同 时 电 泳 ), 在 紫 外 光 下 观 察 结 果, 与 标 准 DNA 分 子 量 比 较, 确 认 目 的 基 因 和 内 切 酶 的 切 割 效 果 核 酸 纯 化 系 统 程 序 操 作 注 意 事 项 纯 化 前 处 理 ( 一 ) 开 机 步 骤 1. 首 先 打 开 仪 器 电 源, 等 待 电 导 检 测 和 紫 外 检 测 自 检 完 毕, 而 泵 的 检 测 出 现 press K to start 状 态 2. 此 时 开 启 计 算 机, 然 后 打 开 软 件

88 88 ( 二 ) 程 序 运 行 前 的 准 备 1. 首 先 对 缓 冲 液 进 行 超 声 波 脱 气, 十 分 钟 左 右 即 可 2. 软 件 启 动 后 出 现 四 个 模 块, 点 击 system control 模 块, 并 在 该 模 块 中 点 击 manual 进 行 手 动 操 作 3. 手 动 操 作 对 泵 进 行 排 气 具 体 过 程 : (1) 点 击 manual 在 出 现 的 对 话 框 中 点 击 pump 在 接 下 来 出 现 的 子 对 话 框 中 点 击 flow, 将 流 速 设 定 在 ml/min 之 间 (2) 点 击 gradient, 在 出 现 的 子 对 话 框 中 将 缓 冲 液 B 的 梯 度 设 定 在 50% (3) 点 击 flowpath, 将 会 自 动 弹 出 InjectionValve 的 子 对 话 框, 并 自 动 默 认 为 load 状 态, 我 们 要 将 其 选 择 为 "waste" 状 态 这 时, 即 可 对 A1, B1 进 行 抽 气 ( 若 需 要 对 A2, B2 抽 气, 则 在 flowpath 对 话 框 点 击 PumpAInlet 并 在 出 现 的 子 对 话 框 点 击 A2 并 按 下 Execute 即 可 执 行,B2 同 理 ) 4. 对 系 统 设 定 报 警 压 选 择 不 同 的 分 离 柱 需 要 设 定 不 同 的 报 警 压, 这 样 才 能 让 仪 器 处 于 一 个 安 全 的 状 态 工 作! 在 点 击 manual 后, 在 出 现 的 对 话 框 中 点 击 Alams&Mon 这 将 会 出 现 一 个 子 对 话 框, 点 击 其 中 的 HighAlams, 即 可 设 定 不 同 的 报 警 压 针 对 目 前 本 实 验 室 的 情 况, 此 处 可 以 提 供 几 个 参 考 数 据 (1)HPL 本 身 的 最 大 压 力 为 10MP, 所 以, 无 论 是 用 什 么 样 的 柱 子, 设 定 的 最 大 报 警 压 都 不 可 以 超 过 10MP,( 在 一 般 情 况 下, 甚 至 最 好 不 要 接 近 10MP, 报 警 压 设 在 8MP 以 下 为 宜 ) (2) 本 实 验 室 有 SURE TM 5RP 反 相 柱, 可 承 受 的 最 大 报 警 压 力 为 40MP, 但 是 用 在 本 仪 器 上 时, 是 不 能 超 过 10MP 的 (3)SURE TM Q 离 子 交 换 柱, 可 承 受 最 大 压 力 为 1.5MP, 报 警 压 设 定 要 小 于 1.5MP (4)HiTrap TM 5ml Desalting 凝 胶 过 滤 柱, 可 承 受 最 大 压 力 为 0.3MP 5. 上 柱 选 择 相 应 的 分 离 柱 接 入 仪 器 平 台, 用 相 应 的 缓 冲 液 约 30ml 以 合 适 流 速 冲 洗 柱 子 进 行 柱 平 衡 纯 化 操 作 当 以 上 步 骤 正 确 操 作 完 成, 即 可 开 始 进 行 纯 化 分 离 1. 上 样 根 据 分 离 目 的 采 用 不 同 的 loop 环 进 样 对 于 离 子 交 换 柱 和 反 相 柱, 使 用 0.1ml 的 loop 环, 对 于 凝 胶 过 滤 ( 脱 盐 ) 柱, 则 可 以 使 用 0.5ml 的 loop 环 首 先 使 用 1ml 的 微 量 注 射 器 各 吸 取 1ml 上 样 缓 冲 液 ( 一 般 为 A 液 ) 冲 洗 loop 环 三 次, 然 后 吸 取 样 品 ( 注 意 不 要 有 气 泡

89 89 产 生, 如 有, 请 排 出 之 ) 注 射 进 loop 环 即 可 2. 收 集 样 品 准 备 在 收 集 器 处 摆 放 好 1.5ml 已 灭 过 菌 的 离 心 管, 将 收 集 臂 处 于 工 作 状 态 准 备 收 集 3. 运 行 程 序 根 据 自 己 的 需 要, 选 择 不 同 的 柱 子 和 不 同 的 程 序 点 击 UNIRN manager 板 块 并 在 其 中 找 到 自 己 需 要 运 行 的 程 序 按 右 键, 操 作 Run, 在 出 现 的 对 话 框 中 点 击 show details, 即 可 显 示 该 程 序 中 的 所 有 参 数, 特 别 注 意 观 察 其 中 的 报 警 压 设 定 与 所 选 择 的 分 离 柱 子 最 大 压 力 是 否 协 调 继 续 点 击 下 一 步 直 至 最 后 一 个 对 话 框 出 现, 点 击 对 话 框 中 的 Browse.. 将 本 次 就 要 运 行 的 结 果 储 存 在 自 己 的 文 件 夹 中, 并 在 该 对 话 框 中 的 Name 中 命 名 本 实 验 室 为 了 方 便 对 文 件 作 统 一 管 理, 对 文 件 的 命 名 作 了 如 下 的 统 一 规 定 : (1) 命 名 时 将 年 月 日 期 写 在 最 前 边 如 (2) 然 后 写 上 该 样 品 的 名 字 如 P53 MB, 即 是 指 P53 分 子 信 标 (3) 写 上 该 样 品 所 有 者 的 名 字 的 拼 音 ( 或 拼 音 的 简 写 ) 如 ZhangSan 或 ZS (4) 标 注 上 该 样 品 是 在 脱 盐 (Desalting), 离 子 交 换 (IEX), 或 是 进 行 反 相 (RP) 如 06 年 11 月 8 日 王 二 麻 子 的 P53 分 子 信 标 进 行 反 相 分 离, 即 可 写 成 P53 MB WangErmazi RP 命 名 后, 点 击 START 即 可 运 行 程 序 4. 样 品 的 收 集 刚 UV 检 测 器 检 测 到 样 品 的 时 候, 我 们 就 要 注 意 对 样 品 进 行 收 集 点 击 Manual, 在 出 现 的 下 拉 对 话 框 中 点 击 Frac 则 在 接 下 来 出 现 的 对 话 框 中 点 击 Fractionation 900 就 会 显 示 FracSize, 在 其 中 手 动 规 定 每 一 管 要 收 集 的 量 收 集 结 束 时, 在 同 一 对 话 框 中 点 击 Fractionation-stop-900, 并 按 Excute 执 行, 则 将 收 集 停 止 在 收 集 中, 流 向 收 集 的 管 道 中 将 会 保 存 部 分 我 们 所 要 收 集 的 样 品, 形 成 一 种 系 统 误 差 为 了 对 此 进 行 纠 正, 我 们 可 以 在 要 收 集 结 束 处 延 迟 0.2ml, 才 能 完 全 收 集 到 我 们 要 的 样 品 5. 程 序 结 束 后 的 操 作 当 程 序 运 行 结 束 后, 我 们 需 要 对 仪 器 和 分 离 柱 进 行 清 洗 在 卸 柱 子 之 前, 要 采 用 手 动 操 作, 将 柱 子 中 充 满 对 应 的 储 存 液 (1) 对 于 凝 胶 过 滤 ( 脱 盐 ) 柱 和 离 子 交 换 柱, 其 保 护 液 为 20% 的 乙 醇 这 时 我 们 需 要 将 浸 入 在 缓 冲 液 中 的 A 管 放 入 到 盛 有 20% 乙 醇 的 试 剂 瓶 中, 参 照 前 面 所 讲 的 手 动 操 作, 先 抽 气, 然 后 冲 洗 3 个 柱 体 积 (V)(12ml 左 右 ), 将 运 行 Pause, 卸 下 柱 子 柱 子 卸 下 之 后, 仍 用 20% 的 乙 醇 冲 洗 管 道 约 20ml 即 可 (2) 对 于 反 相 柱, 其 保 护 液 为 20% 的 乙 腈, 则 需 要 将 浸 入 在 缓 冲 液 中 的 A 管 放 入 到 盛 有 20% 乙 腈 的 试 剂 瓶 中, 按 照 上 面 的 操 作 冲 洗 柱 子, 卸 下 来 然 后, 由 于 管 道 中 需 要 使 用 20%

90 90 的 乙 醇 保 护, 我 们 还 需 要 将 管 道 使 用 20% 的 乙 醇 冲 洗 大 约 20ml 即 可 (3) 注 意 : 一 定 记 得 冲 洗 收 集 管 道, 这 样 才 能 避 免 对 下 次 的 样 品 收 集 造 成 污 染 2.6 抗 原 抗 体 反 应 ( 石 慧 提 供 ) 什 么 是 抗 原 抗 体 反 应? 抗 原 与 相 应 抗 体 的 特 异 性 结 合 反 应 称 为 抗 原 抗 体 反 应 (antigen-antibody reaction) 抗 原 抗 体 反 应 既 可 在 体 内 作 为 体 液 免 疫 应 答 的 效 应 机 制 自 然 发 生, 也 可 在 体 外 作 为 免 疫 学 实 验 的 结 果 出 现 在 体 内, 可 表 现 为 溶 菌 杀 菌 促 进 吞 噬 或 中 和 毒 素 等 作 用, 有 时 亦 可 引 起 免 疫 病 理 损 伤 在 体 外, 依 相 应 抗 原 物 理 性 状 ( 颗 粒 状 或 可 溶 性 ) 以 及 反 应 的 条 件 ( 电 解 质 补 体 等 ) 不 同, 可 出 现 凝 集 沉 淀 细 胞 溶 解 和 补 体 结 合 等 反 应 抗 原 抗 体 反 应 原 理 抗 原 抗 体 结 合 反 应 是 抗 原 决 定 簇 和 抗 体 分 子 超 变 区 之 间 的 相 互 作 用, 是 一 种 分 子 表 面 的 特 异 的 可 逆 的 弱 结 合 力 这 些 弱 结 合 力 只 能 在 极 短 距 离 内 才 能 发 生 效 应 因 此 抗 原 抗 体 结 合 反 应 的 最 重 要 的 先 决 条 件 是 抗 原 与 抗 体 间 的 特 定 部 位 的 空 间 结 构 必 须 相 互 吻 合, 具 有 互 补 性 其 次, 抗 原 决 定 簇 与 抗 体 超 变 区 必 须 紧 密 接 触, 才 能 有 足 够 的 结 合 力, 使 抗 原 抗 体 分 子 结 合 在 一 起 抗 原 和 抗 体 的 结 合 虽 然 是 互 补 性 的 特 异 性 结 合, 但 并 不 形 成 牢 固 的 共 价 键, 只 是 通 过 非 共 价 键 结 合, 结 合 方 式 类 似 蛋 白 质 和 细 胞 受 体 或 酶 与 底 物 之 间 的 结 合 抗 原 与 抗 体 这 种 弱 的 结 合 力 涉 及 下 列 几 种 分 子 间 的 作 用 力 1. 静 电 引 力 抗 原 和 抗 体 分 子 带 有 相 反 电 荷 的 氨 基 和 羧 基 基 团 之 间 相 互 的 引 力, 称 为 静 电 引 力, 又 称 库 伦 引 力 例 如, 抗 体 分 子 上 带 电 荷 的 碱 性 氨 基 酸 的 游 离 氨 基 (--NH 3+ ) 和 酸 性 氨 基 酸 的 游 离 羧 基 ( -- ) 可 与 抗 原 分 子 上 带 相 反 电 荷 的 对 应 基 团 相 互 吸 引 这 种 引 力 的 大 小 与 两 个 相 互 作 用 基 团 间 的 距 离 的 平 方 成 反 比 2. 范 德 华 引 力 抗 原 和 抗 体 相 互 接 近 时, 由 于 分 子 的 极 化 作 用 而 出 现 的 引 力, 称 范 德 华 引 力 结 合 力 的 大 小 与 两 个 相 互 作 用 基 团 的 极 化 程 度 的 乘 积 成 正 比 与 它 们 之 间 距 离 的 7 次 方 成 反 比, 键 能 约 为 kJ/mol 这 种 引 力 的 能 量 小 于 静 电 引 力 3. 氢 键 结 合 力 供 氢 体 上 的 氢 原 子 与 受 氢 体 原 子 间 的 引 力 在 抗 原 抗 体 反 应 中, 羧 基 氨 基 和 羟 基 是 主 要 供 氢 体, 而 羧 基 氧 羧 基 碳 和 肽 键 氧 等 原 子 是 主 要 受 氢 体, 能 的 大 小 取 决 于 方 向 即 氢 键 具 有 高 度 的 方 向 性, 因 此 范 德 华 力 更 具 有 特 异 性 氢 键 结 合 力 与 供 氢 体 和 受 氢 体 之 间 距 离 的 6

91 91 次 方 成 反 比, 键 能 约 20.9kJ/mol 4. 疏 水 作 用 力 两 个 疏 水 基 团 在 水 溶 液 中 相 互 接 触 时, 由 于 对 水 分 子 排 斥 而 趋 向 聚 集 的 力 称 为 疏 水 作 用 力, 或 称 为 疏 水 键 当 抗 原 抗 体 反 应 时, 抗 原 决 定 簇 与 抗 体 上 的 结 合 点 靠 近, 互 相 间 正 负 极 性 消 失, 由 静 电 作 用 形 成 的 亲 水 层 立 即 失 去, 从 而 促 进 抗 原 与 抗 体 的 相 互 吸 引 而 结 合 疏 水 作 用 力 在 抗 原 抗 体 反 应 中 的 结 合 是 很 重 要 的 提 供 的 作 用 力 最 大, 约 占 总 结 合 力 的 50% 抗 体 和 大 多 数 抗 原 同 属 蛋 白 质 在 通 常 的 血 清 学 反 应 条 件 下 均 带 有 负 电 荷, 使 极 化 的 水 分 子 在 其 周 围 形 成 水 化 层, 成 为 亲 水 胶 体, 因 此 蛋 白 质 不 会 自 行 凝 集 出 现 沉 淀 当 抗 原 与 抗 体 结 合 后, 表 面 电 荷 减 少, 水 化 层 变 薄 ; 而 且 由 于 抗 原 抗 体 复 合 物 形 成 后, 与 水 接 触 的 表 面 积 减 少, 由 亲 水 胶 体 转 化 为 疏 水 胶 体 此 时 在 电 解 质 ( 如 Nal 的 作 用 下, 使 各 疏 水 胶 体 之 间 进 一 步 靠 拢 沉 淀, 形 成 可 见 的 抗 原 抗 体 复 合 物 抗 原 抗 体 反 应 的 特 点 1. 特 异 性 特 异 性 (specificity) 是 指 任 何 一 种 抗 原 分 子, 只 能 与 由 它 刺 激 所 产 生 的 抗 体 结 合 而 起 反 应 的 专 一 性 能 特 异 性 是 抗 原 抗 体 反 应 的 最 重 要 特 征 之 一, 是 由 抗 原 决 定 簇 和 抗 体 分 子 超 变 区 之 间 空 间 结 构 的 互 补 性 决 定 的 抗 体 分 子 N 端 可 变 区 形 成 大 小 约 为 3nm 1.5nm 0.7nm 的 槽 沟, 其 中 超 变 区 氨 基 酸 残 基 的 变 异 性 使 槽 形 状 千 变 万 化, 只 有 与 其 空 间 结 构 互 补 的 抗 原 决 定 簇 才 能 如 楔 状 嵌 入, 其 关 系 如 锁 和 钥 匙, 因 此, 抗 原 抗 体 结 合 反 应 具 有 高 度 特 异 性 这 种 高 度 的 反 应 特 异 性 是 一 切 抗 原 抗 体 反 应 的 主 体, 所 以 在 传 染 病 的 诊 断 防 治 等 医 学 和 生 物 学 领 域 都 已 得 到 了 广 泛 的 应 用 多 数 的 天 然 抗 原 物 质 的 构 成 十 分 复 杂, 如 微 生 物 抗 原, 常 含 有 多 个 不 同 的 抗 原 决 定 簇 如 果 两 种 不 同 的 抗 原 物 质 具 有 部 分 相 同 或 类 似 结 构 的 抗 原 决 定 簇, 则 可 与 彼 此 相 应 的 抗 血 清 出 现 交 叉 反 应 2. 比 例 性 比 例 性 是 指 抗 原 与 抗 体 发 生 可 见 反 应 需 遵 循 一 定 的 量 比 关 系, 只 有 当 二 者 浓 度 比 例 适 当 时, 才 出 现 可 见 反 应 以 沉 淀 反 应 为 例, 在 加 入 固 定 量 抗 体 的 一 排 试 管 中 再 依 次 加 入 一 定 体 积 的 递 增 浓 度 的 抗 原 进 行 反 应 时, 发 现 随 着 抗 原 浓 度 的 增 加, 沉 淀 很 快 大 量 出 现, 但 超 过 一 定 范 围 之 后, 沉 淀 速 度 和 沉 淀 量 随 抗 原 浓 度 增 加 反 而 迅 速 降 低, 甚 至 到 最 后 不 出 现 沉 淀 沉 淀 反 应 的 速 度 反 映 了 参 加 反 应 的 抗 原 和 抗 体 浓 度 的 适 合 程 度, 适 合 程 度 高 反 应 快, 反 之 则 慢 通 常 把 最 迅 速 出 现 沉 淀 时 的 抗 原 抗 体 的 浓 度 比 或 量 比 称 为 抗 原 抗 体 反 应 的 最 适 比 3. 可 逆 性 可 逆 是 指 抗 原 与 抗 体 结 合 成 复 合 物 后, 在 一 定 条 件 下 可 解 离 为 游 离 抗 原 与 抗 体 的 特 性 由 于 抗 原 抗 体 反 应 是 分 子 表 面 的 非 共 价 键 结 合, 所 形 成 的 复 合 物 并 不 牢 固, 在 一 定 条 件 下 ( 如 低 ph 高 浓 度 盐 等 ) 可 以 解 离 常 用 于 解 离 抗 原 抗 体 复 合 物 的 物 质 有 3mol/L 硫 氰 化 钾,7mol/L

92 92 尿 素,pH2.4 0.lmol/L 甘 氨 酸 等 解 离 后 的 抗 原 或 抗 体 分 子, 仍 保 持 原 来 的 理 化 特 性 及 生 物 学 性 状 4. 敏 感 性 抗 原 抗 体 反 应 具 有 高 度 的 敏 感 性, 不 仅 可 以 定 性, 而 且 可 以 定 量 其 敏 感 度 大 大 超 过 目 前 所 有 化 学 方 法 其 敏 感 度 因 反 应 种 类 不 同 而 异 5. 抗 原 抗 体 反 应 的 二 阶 段 性 第 一 阶 段 为 抗 原 抗 体 特 异 性 结 合 阶 段, 反 应 速 度 快, 几 秒 钟 或 几 分 钟 即 可 完 成, 但 不 出 现 肉 眼 可 见 反 应 第 二 阶 段 为 可 见 阶 段, 表 现 为 凝 集 沉 淀 补 体 结 合 等 反 应, 本 阶 段 有 两 个 特 点, 一 是 反 应 进 行 慢, 需 要 几 分 钟 几 十 分 钟 或 更 长 其 二 是 受 电 解 质 温 度 酸 碱 度 等 多 种 因 素 影 响 抗 原 抗 体 反 应 影 响 因 素 影 响 抗 原 抗 体 反 应 的 因 素 较 多, 主 要 有 两 方 面 : 一 方 面 是 受 到 抗 原 抗 体 的 自 身 因 素 的 影 响, 另 一 方 面 是 受 到 电 解 质 酸 碱 度 温 度 及 时 间 等 实 验 环 境 因 素 的 影 响 1. 反 应 物 自 身 因 素 a. 抗 原 的 理 化 性 状 抗 原 决 定 簇 的 数 目 和 种 类 均 可 影 响 血 清 学 反 应 结 果 例 如, 可 溶 性 抗 原 与 相 应 抗 体 反 应 出 现 沉 淀, 而 颗 粒 性 抗 原 与 相 应 抗 体 反 应 则 出 现 凝 集 ; 单 价 抗 原 与 抗 体 结 合 不 出 现 可 见 反 应 ; 粗 糙 型 细 菌 在 生 理 盐 水 中 易 出 现 自 凝 ; 红 细 胞 与 IgG 类 抗 体 结 合 不 出 现 直 接 凝 集 等 b. 抗 体 抗 体 是 血 清 学 反 应 中 的 关 键 因 素, 对 反 应 的 影 响 表 现 在 以 下 三 个 方 面 : (1) 来 源 : 来 自 不 同 动 物 的 免 疫 血 清, 其 反 应 性 有 差 异 家 兔 等 大 多 数 动 物 的 免 疫 血 清 具 有 较 宽 的 等 价 带, 通 常 在 抗 原 过 量 时 才 易 出 现 可 溶 性 免 疫 复 合 物 ; 马 等 大 动 物 和 人 的 免 疫 血 清 等 价 带 较 窄, 少 量 的 抗 原 或 抗 体 过 剩, 均 可 形 成 可 溶 性 免 疫 复 合 物 ; 家 禽 免 疫 血 清 不 能 结 合 哺 乳 动 物 的 补 体, 并 且 在 高 盐 浓 度 (80g/L Nal 溶 液 中 沉 淀 现 象 明 显 单 克 隆 抗 体 一 般 不 适 用 于 沉 淀 反 应 或 凝 集 反 应 (2) 特 异 性 与 亲 和 力 : 特 异 性 和 亲 和 力 是 影 响 血 清 学 反 应 的 两 个 关 键 因 素, 它 们 共 同 影 响 试 验 结 果 的 准 确 程 度 免 疫 动 物 早 期 获 得 的 抗 血 清 特 异 性 较 好, 但 亲 和 力 低 ; 后 期 获 得 的 抗 血 清 一 般 亲 和 力 较 高, 但 长 期 免 疫 易 使 免 疫 血 清 中 抗 体 的 类 型 和 反 应 性 变 得 更 为 复 杂 因 此, 用 于 诊 断 的 试 剂 必 须 尽 量 选 用 特 异 性 高 亲 和 力 强 的 抗 体, 才 能 保 证 和 提 高 试 验 结 果 的 可 靠 性 (3) 浓 度 : 抗 体 的 浓 度 往 往 是 与 抗 原 相 对 而 言 合 适 的 浓 度 才 出 现 明 显 的 反 应 现 象 因 此 许 多 试 验

93 93 应 进 行 抗 体 预 滴 定, 找 出 最 适 反 应 浓 度 2. 环 境 条 件 a. 电 解 质 抗 原 抗 体 结 合 后 由 亲 水 性 变 为 疏 水 性, 此 时 易 受 电 解 质 影 响, 如 有 适 当 浓 度 电 解 质 存 在, 就 会 使 抗 原 抗 体 失 去 一 部 分 电 荷 而 相 互 凝 集 或 沉 淀, 出 现 可 见 反 应 ; 若 无 电 解 质 存 在, 则 不 出 现 可 见 反 应 通 常 在 血 清 学 试 验 中, 以 8.5g/LNal 溶 液 作 为 抗 原 抗 体 的 稀 释 液 及 反 应 液, 其 中 Na + 和 l - 可 分 别 中 和 胶 体 颗 粒 上 的 电 荷, 使 胶 体 颗 粒 的 电 势 下 降, 形 成 可 见 的 沉 淀 物 或 凝 集 物 但 如 果 电 解 质 浓 度 过 高, 则 会 出 现 非 特 异 性 蛋 白 质 沉 淀, 即 盐 析 补 体 参 与 的 溶 细 胞 反 应, 除 需 要 等 渗 的 Nal 溶 液 外, 还 需 适 虽 的 Mg 2+ 和 a 2+ 离 子 参 与 b. 酸 碱 度 合 适 的 ph 是 抗 原 抗 体 反 应 的 必 要 条 件 之 一 血 清 学 试 验 一 般 以 ph6--9 为 宜, 超 出 此 范 围 可 影 响 抗 原 和 抗 体 的 理 化 性 质, 导 致 假 阳 性 或 假 阴 性 结 果 当 ph 为 3 左 右 时, 接 近 细 菌 抗 原 的 等 电 点, 可 出 现 非 特 异 性 酸 凝 集, 造 成 假 象 c. 温 度 抗 原 抗 体 反 应 一 般 在 15 一 40 范 围 内 均 可 进 行, 最 适 温 度 为 37 在 此 范 围 内 温 度 越 高, 分 子 运 动 速 度 加 快, 增 加 抗 原 抗 体 接 触 机 会, 反 应 速 度 越 快, 但 亦 容 易 引 起 复 合 物 解 离 ; 温 度 越 低, 反 应 速 度 缓 慢, 但 抗 原 抗 体 结 合 牢 固, 易 于 观 察 某 些 特 殊 的 抗 原 抗 体 反 应 需 要 特 定 的 温 度, 如 冷 凝 集 素 在 4 时 与 红 细 胞 结 合,20 以 上 反 而 解 离 e. 作 用 时 间 抗 原 抗 体 反 应 应 有 足 够 的 时 间, 不 同 反 应 时 间 不 同 此 外, 抗 原 抗 体 反 应 在 液 相 中 反 应 时, 适 当 振 荡 与 搅 拌, 也 可 促 进 抗 原 抗 体 分 子 的 接 触, 加 速 反 应 2.7 蛋 白 质 化 学 修 饰 ( 刘 剑 波 提 供 ) 在 20 种 构 成 蛋 白 质 的 氨 基 酸 中, 只 有 具 有 极 性 的 氨 基 酸 残 基 的 侧 链 基 团 才 能 够 进 行 化 学 修 饰, 这 些 基 团 的 反 应 性 取 决 于 他 们 的 亲 核 性 很 多 因 素 都 可 以 影 响 亲 核 性 的 大 小, 这 些 因 素 对 于 蛋 白 质 的 化 学 修 饰 反 应 会 造 成 很 大 的 影 响 选 择 性 修 饰 试 剂 首 先 必 须 要 能 够 与 某 一 特 定 的 氨 基 酸 残 基 的 侧 链 基 团 发 生 化 学 反 应, 并 形 成 紧 密 的 共 价 连 接, 但 是 一 般 的 试 剂 专 一 性 不 强 因 此 人 们 开 始 使 用 亲 和 性 标 记 试 剂 氨 基 酸 蛋 白 质 由 20 种 氨 基 酸 所 组 成, 氨 基 酸 根 据 其 亲 疏 水 性 质 可 以 按 照 如 下 形 式 划 分 :

94 94 H 2 N H H H Glycine 甘 氨 酸 pi 5.97 Gly G 疏 水 性 侧 链 H 2 N H H 3 H Alanine 丙 氨 酸 pi 6.00 Ala A H 2 N H H H 3 H 3 H Valine 缬 氨 酸 pi 5.96 Val V H 2 N H H 2 H H 3 H H 3 Leucine 亮 氨 酸 pi 5.98 Leu L H 2 N H H H 3 H 2 H H 3 Isoleucine 异 亮 氨 酸 pi 5.94 Ile I H 2 N H H 2 H 2 S H H 3 Methionine 蛋 氨 酸 pi 5.74 Met M H 2 N H H 2 H H 2 N H H 2 H H 2 N H H 2 H H HN HN Phenylalanine 苯 丙 氨 酸 pi 5.48 Phe F Tryptophan 色 氨 酸 pi 5.89 Trp W H Tyrosine 酪 氨 酸 pi 5.66 Tyr Y Proline 脯 氨 酸 pi 6.30 Pro P 亲 水 中 性 侧 链 H 2 N H H 2 H Serine 丝 氨 酸 pi 5.68 Ser S H H 2 N H H H H 3 H Threonine 苏 氨 酸 pi 5.64 Thr T H 2 N H H 2 H 2 NH 2 H Glutamine 谷 氨 酰 胺 pi 5.65 Gln Q H 2 N H H 2 NH 2 H Asparagine 天 冬 酰 胺 pi 5.41 Asn N

95 95 亲 水 酸 性 侧 链 H 2 N H H 2 H H 2 N H H H 2 H Glutamic acid 谷 氨 酸 pi 3.22 Glu E 亲 水 碱 性 侧 链 H 2 H Aspartic acid 天 冬 氨 酸 pi 2.77 Asp D H 2 N H H H 2 N H H H 2 H 2 N H H H 2 N H H 2 H H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 NH H 2 SH ysteine 半 胱 氨 酸 pi 5.02 ys N NH Histidine 组 氨 酸 pi 7.47 His H H 2 NH 2 L ysine 赖 氨 酸 pi 9.59 Lys K NH NH 2 Arginine 精 氨 酸 pi Arg R 蛋 白 质 侧 链 基 团 的 修 饰 反 应 蛋 白 质 的 反 应 主 要 是 通 过 表 面 的 极 性 氨 基 酸 作 用 的 酰 化 反 应 这 类 化 学 修 饰 试 剂 如 乙 酰 咪 唑 二 异 丙 基 磷 酰 氟 酸 酐 磺 酰 氯 硫 代 三 氟 乙 酸 乙 酯 和 - 甲 基 异 脲 等, 它 们 在 常 温 (20-25 ),ph 的 条 件 下 可 以 与 蛋 白 质 的 某 些 侧 链 基 团 发 生 酰 化 反 应 被 作 用 的 蛋 白 质 分 子 侧 链 基 团 有 氨 基 羟 基 巯 基 以 及 酚 基 等 P H SH NH 2 + H R X P R S R HN R + HX R 烷 基 化 反 应 烷 基 化 试 剂 一 般 是 卤 代 烃, 他 们 很 容 易 导 致 蛋 白 质 的 亲 核 试 剂 ( 如 -NH2 -SH 等 ) 发 生 烷 基 化 属 于 这 类 修 饰 试 剂 的 有 :2,4- 二 硝 基 氟 苯 碘 代 乙 酸 碘 代 乙 酰 胺 苯 甲 酰 卤 代 物 和 碘 甲 烷 等 被 修 饰 的 蛋 白 质 残 基 的 侧 链 基 团 有 氨 基 巯 基 羧 基 硫 醚 基 和 咪 唑 基 等

96 96 H 2 -S-H 3 SH H 2 -S R H 3 S-R P NH 2 H P + RX NH-R + HX R 氧 化 还 原 反 应 N NH N NR 氧 化 性 试 剂, 比 如 H22,N- 溴 代 琥 珀 酰 亚 胺 等, 他 们 可 以 将 侧 链 基 团 氧 化, 可 以 将 肽 链 断 裂, 因 此 在 修 饰 过 程 中 要 控 制 好 氧 化 条 件 光 敏 剂 存 在 下 的 光 氧 化 是 一 种 比 较 温 和 的 养 护 方 式, 容 易 被 氧 化 的 侧 链 基 团 有 巯 基 硫 醚 基 吲 哚 基 咪 唑 基 以 及 酚 基 等 作 用 于 二 硫 键 的 还 原 性 试 剂 主 要 有 2- 巯 基 乙 醇 巯 基 乙 酸 和 二 硫 苏 糖 醇 等 连 四 硫 酸 钠 或 者 连 四 硫 酸 钾 常 作 为 巯 基 的 可 逆 保 护 剂 芳 香 环 取 代 反 应 蛋 白 质 氨 基 酸 残 基 的 酚 羟 基 在 3 和 5 位 上 很 容 易 发 生 亲 电 取 代 的 碘 化 和 硝 基 化 反 应 比 如 四 硝 基 甲 烷, 它 可 以 作 用 于 酪 氨 酸 的 酚 羟 基, 形 成 3- 硝 基 酪 氨 酸 衍 生 物 P H + (N 2 ) 4 P H + (N 2 ) 3 H N 2 溴 化 氰 裂 解 溴 化 氰 裂 解 甲 硫 氨 酸 残 基 的 羧 基 侧 链 肽 键 的 反 应 机 理, 如 下 : H N H H 2 HN H 2 S R H H 3 Br N H N H H 2 H 2 HS HN R H H 3 N Br H N H H 2 H 2 H 2 HN H R + N S H 3 H N H H H 2 H 2 H 2 H N H H 2 H 2 + HN H R H ED 交 联 法 ED/NHS 可 以 在 温 和 的 水 环 境 下, 连 接 羧 基 以 及 氨 基

97 97 R 羧 酸 H 3 H 2 N + N H 2 H 2 R H 3 H NH N H 2 H 2 R 2 NH 2 R 2 SH H 2 R R R HN R2 S R 2 H + H 3 H 2 NH NH H 2 H 2 H 2 N H 3 H 3 H 2 N H 3 H 3 H 2 N H 3 H 3 ED 活 化 酯 中 间 体 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 固 定 化 羧 基 末 端 手 臂 + H N S 3 Na Sulfo-NHS ED ph 7.3 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 N S 3 Na R-NH 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 HN R NHS 酯 中 间 体 巯 基 的 化 学 修 饰

98 98 (1) P SH + 2 N S S N 2 ph>6.8 P S S N 2 + S N 2 + H (2) P SH + N N S S P S S N + S NH (3) ph~5 P SH + Hg P S Hg + H (4) P SH + Hg H P S Hg H + H N 2 N 2 (5) P SH + NH 2 H 3 ph>5 P S NH 2 H 3 (6) P SH P S S P P SH P S S P P S 2 H P S 3 H 巯 基 的 化 学 修 饰 (1)DTNB;(2)4,4'- 二 硫 二 吡 啶 (4-PDS);(3) 对 氯 汞 苯 甲 酸 (PMB);(4) 2- 氯 汞 -4- 硝 基 苯 酚 (MNP);(5)N- 乙 基 马 来 酰 亚 胺 (NEM);(6) 过 氧 化 氢 氧 化 羧 基 的 化 学 修 饰 (1) P (2) P H + N N R R' + H ph ~5 P HX H 3 + BF ph 4~5 4 H 3 H 3 P P X NHR NHR' NHR + + H NHR' H 3 + H 3 H 3 + BF 4 (3) P H + H 3 H 0.02~0.1mol/L Hl 0 ~ 25 o P H 3 + H 2 羧 酸 的 化 学 修 饰 (1) 通 过 水 溶 液 的 碳 化 二 亚 胺 进 行 醋 化 反 应 或 胺 化 反 应, 式 中 R,R'= 烷 基 ;HX= 卤 素 一 级 或 二 级 胺 ;(2) 硼 氟 化 三 甲 钅 羊 盐 ;(3) 用 甲 醇 -Hl 的 酯 化 反 应 组 氨 酸 的 化 学 修 饰

99 99 (1) H N P + N H 2 H 3 H 2 H 3 ph 4~7 P N N H 2 H 3 + H 3 H 2 H + 2 (2) H N P + IH 2 ph >5.5 N P N N H 2 + I + H (3) H N P + I 3 N P I H N H N 组 氨 酸 咪 唑 基 的 化 学 修 饰 P I N N + 2I + H I + I + H 氨 基 的 化 学 修 饰 (1) 焦 碳 酸 二 乙 酯 ;(2) 碘 代 乙 酸 ;(3) 碘 化 反 应 (1) P NH 2 + H 3 H 3 ph>7 P NHH 3 + H 3 + H 2 N (2) P NH 2 + S 3 H N 2 2 N ph>7 P 2 N H N 2 N N2 + S 3 H + H (3) P NH 2 + F N 2 2 N ph>8.5 P N N 2 H 2 N +H + F (4) P NH 2 + IH 2 ph>8.5 P NH H 2 + H + I (5) P NH 2 + RR' - H 2 + H 2 P N RR' ph~9 NaBH 4 P H N HRR' N(H 3 ) 2 N(H 3 ) 2 (6) P NH 2 + H N P S 2 + H + l S 2 l 氨 基 的 化 学 修 饰 (1) 乙 酸 酐 ;(2)2,4,6- 三 硝 基 苯 酚 (TNBS);(3)2,4- 二 硝 基 氟 苯 (DNFB) 或 称 Sanger 试 剂 ;(4) 碘 代 乙 酸 (IAA);(5) 还 原 烷 基 化 ;(6) 丹 磺 酰 氯 (DNS) 酚 和 脂 肪 族 羟 基 的 化 学 修 饰

100 100 (1) P + N H 3 + H ph7.5 P H N 3 + N I NH (2) P + I 3 P I + H + 2I P + H + 2I I N 2 (3) P + (N 2 ) 4 P + H + (N 2 ) 3 ph~9 (4) P + N 2 Ar P 0 + H N NAr + N 2 Ar N NAr P + H N NAr (5) P H + H 3 H H 3 H 3 H 3 P H P P H F H 3 H H 3 + H + F H 3 H 3 吲 哚 基 的 化 学 修 饰 酚 基 和 羟 基 的 化 学 修 饰 (1)N- 乙 酰 咪 唑 ;(2) 碘 化 反 应 ;(3) 四 硝 基 甲 烷 (TNM); (4) 偶 氮 化 反 应 ;(5) 二 异 丙 基 氟 磷 酸 (DFP) (1) P NH + N2 H2Br ph<7.5 P + HBr H NH (2) P NH P HN H + P NH 2 N2 (3) S NH 20%~60% NH P + ls N 2 P H 3 H + H + + l - 胍 基 的 化 学 修 饰 吲 哚 基 的 化 学 修 饰 (1) 2- 羟 基 -5- 硝 基 苄 溴 或 Koshland 试 剂 (HNBB);(2) 光 氧 化 反 应 ;(3) 4- 硝 基 苯 硫 氯

101 101 (1) P N NH 2 NH 2 + H H ph 7~9 25 HN NH N 硼 酸 盐 H H B HN N NH P P H H H H B (2) P N NH 2 + NH 2 ph 7~9 25 HN NH N P 硼 酸 盐 HN N P NH (3) P N NH 2 + NH 2 ph 7~8 25 HN N NH 胍 基 的 化 学 修 饰 P 甲 硫 基 的 化 学 修 饰 (2) (3) (4) (1) 在 硼 酸 盐 存 在 下 丁 二 酮 ;(2) 在 硼 酸 盐 存 在 下 1,2- 环 已 二 酮 ;(3) 苯 乙 二 醛 (1) P ph<5 S H 3 + H 2 2 P S H 3 P S H 3 hν/ο 2 /ph<4-10 P S H HH P S H 3 + IH 2 NH 2 二 硫 键 的 化 学 修 饰 P S H 3 ph<4 甲 硫 基 的 化 学 修 饰 + H 2 P S H 3 (1) 过 氧 化 氢 ; (2) 光 氧 化 ;(3) 过 氧 酸 ;(4) 碘 代 乙 酸 胺 P S + 2 HH H 3 + H 2 NH 2 I

102 102 (1) S SH ph ~8 P + H2 H 2 H S P SH S HSH2H2H SH 2 H 2 H P SH SH + SH 2 H 2 H SH 2 H 2 H (2) S P + S H H SH SH ph ~8 P SH S HS S SH H P + H SH S S (3) S P + 5 HH + H 2 S 约 -10 H H S 3 H P + 5 HH S 3 H 二 硫 键 的 化 学 修 饰 (1)2- 巯 基 乙 醇 ;(2) 二 硫 苏 糖 醇 (DTT) 或 二 硫 赤 藓 糖 醇 (DTE);(3) 过 甲 酸 蛋 白 质 的 化 学 交 联 不 可 断 裂 的 试 剂 - 戊 二 醛 H H 2 H 2 H 2 H 可 切 断 试 剂 表 7-1 几 种 常 用 的 可 切 断 化 学 交 联 试 剂 交 联 剂 缩 写 交 联 剂 桥 长 度 /A 2,2 - 二 硫 双 ( 丙 氨 酸 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 酯 ) (2,2 -dithiobis(succinimidyl propionate)) 3,3 - 二 硫 双 ( 丙 氨 酸 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 酯 ) (3,3 -dithiobis(succinimidyl propionate)) 3,3 - 二 硫 双 ( 丙 氨 酸 N- 羟 基 硫 代 琥 珀 酰 亚 胺 酯 ) (3,3 -dithiobis(sulfsuccinimidyl propionate)) 丙 醇 二 酸 二 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 酯 (disuccinimidyl tartranate) 己 二 酸 二 甲 酯 (dimethyl adipimidate) 1- 乙 基 -3-[3-( 二 甲 氨 基 ) 丙 基 ] 碳 二 亚 胺 (1-ethyl-3-[3-(dimethyamino)propyl]carbodiimide) 1,2,3,4- 二 环 氧 丁 烷 (1,2,3,4-diepoxybutane) 2,2 -DSP 3,3 -DSP DTSSP DST DMA ED DEB 蛋 白 质 分 子 固 定 化

103 103 (1) NH 2 HN 3 Hl N N l P H 2 H H N N (2) NH 2 S l l NS H 2 P P NH 2 H N S (3) NHNH 2 HN 2 HN N 3 P P NH 2 H N (4) NH 2 + H P H N P H + H 2 N P N N H N P SH + H P S P (5) H(H 3 ) 2 H H 2 H P NH 2 H H 2 H N P H H 2 (6) SH + HS H 2 P H H 2 S S H 2 P

104 104 (7) P NH 2 H H N P (8) H S H 2 P H H 2 H SH P P NH 2 H NH P H 2 SH N (9) H + l N l N Z P NH 2 l N N N Z H N N N N Z P (10) S S N + P SH S S S P + H N ( ): 表 示 水 不 溶 性 的 载 体 ;( ): 表 示 酶 分 子 P 固 定 化 方 法 中 常 见 的 参 数 反 应 的 氨 基 酸 残 基 2.8 PR 技 术 ( 文 建 辉 提 供 ) PR 技 术 的 基 本 原 理 PR 技 术 的 基 本 原 理 类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程, 其 特 异 性 依 赖 于 与 靶 序 列 两 端 互 补 的 寡 核 苷 酸 引 物 PR 由 变 性 -- 退 火 -- 延 伸 三 个 基 本 反 应 步 骤 构 成 : 1 模 板 DNA 的 变 性 : 模 板 DNA 经 加 热 至 93 左 右 一 定 时 间 后, 使 模 板 DNA 双 链 或 经 PR 扩 增 形 成 的 双 链 DNA 解 离, 使 之 成 为 单 链, 以 便 它 与 引 物 结 合, 为 下 轮 反 应 作 准 备 ; 2 模 板 DNA 与 引 物 的 退 火 ( 复 性 ): 模 板 DNA 经 加 热 变 性 成 单 链 后, 温 度 降 至 55 左 右, 引 物 与 模 板 DNA 单 链 的 互 补 序 列 配 对 结 合 ; 3 引 物 的 延 伸 :DNA 模 板 -- 引 物 结 合 物 在 TaqDNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 以 dntp 为 反 应 原 料, 靶 序 列 为 模 板, 按 碱 基 配 对 与 半 保 留 复 制 原 理, 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 互 补 的 半 保 留

105 105 复 制 链 重 复 循 环 变 性 -- 退 火 -- 延 伸 三 过 程, 就 可 获 得 更 多 的 半 保 留 复 制 链, 而 且 这 种 新 链 又 可 成 为 下 次 循 环 的 模 板 每 完 成 一 个 循 环 需 2~4 分 钟, 2~3 小 时 就 能 将 待 扩 目 的 基 因 扩 增 放 大 几 百 万 倍 (Plateau) 到 达 平 台 期 所 需 循 环 次 数 取 决 于 样 品 中 模 板 的 拷 贝 PR 反 应 体 系 与 反 应 条 件 标 准 的 PR 反 应 体 系 : 10 扩 增 缓 冲 液 10ul 4 种 dntp 混 合 物 各 200umol/L 引 物 各 10~100pmol 模 板 DNA 0.1~2ug Taq DNA 聚 合 酶 2.5u Mg mmol/L 加 双 或 三 蒸 水 至 100ul PR 反 应 五 要 素 : 参 加 PR 反 应 的 物 质 主 要 有 五 种 即 引 物 酶 dntp 模 板 和 Mg 引 物 引 物 是 PR 特 异 性 反 应 的 关 键,PR 产 物 的 特 异 性 取 决 于 引 物 与 模 板 DNA 互 补 的 程 度 理 论 上, 只 要 知 道 任 何 一 段 模 板 DNA 序 列, 就 能 按 其 设 计 互 补 的 寡 核 苷 酸 链 做 引 物, 利 用 PR 就 可 将 模 板 DNA 在 体 外 大 量 扩 增 设 计 引 物 应 遵 循 以 下 原 则 : 1 引 物 长 度 : 15-30bp, 常 用 为 20bp 左 右 2 引 物 扩 增 跨 度 : 以 bp 为 宜, 特 定 条 件 下 可 扩 增 长 至 10kb 的 片 段 3 引 物 碱 基 :G+ 含 量 以 40-60% 为 宜,G+ 太 少 扩 增 效 果 不 佳,G+ 过 多 易 出 现 非 特 异 条 带 ATG 最 好 随 机 分 布, 避 免 5 个 以 上 的 嘌 呤 或 嘧 啶 核 苷 酸 的 成 串 排 列 4 避 免 引 物 内 部 出 现 二 级 结 构, 避 免 两 条 引 物 间 互 补, 特 别 是 3' 端 的 互 补, 否 则 会 形 成 引 物 二 聚 体, 产 生 非 特 异 的 扩 增 条 带 5 引 物 3' 端 的 碱 基, 特 别 是 最 末 及 倒 数 第 二 个 碱 基, 应 严 格 要 求 配 对, 以 避 免 因 末 端 碱 基 不 配 对 而 导 致 PR 失 败 6 引 物 中 有 或 能 加 上 合 适 的 酶 切 位 点, 被 扩 增 的 靶 序 列 最 好 有 适 宜 的 酶 切 位 点, 这 对 酶 切 分 析 或 分 子 克 隆 很 有 好 处 7 引 物 的 特 异 性 : 引 物 应 与 核 酸 序 列 数 据 库 的 其 它 序 列 无 明 显 同 源 性 引 物 量 : 每 条 引 物 的 浓 度 0.1~1umol 或 10~100pmol, 以 最 低 引 物 量 产 生 所 需 要 的 结 果 为 好, 引 物 浓 度 偏 高 会 引 起 错 配 和 非 特 异 性 扩 增, 且 可 增 加 引 物 之 间 形 成 二 聚 体 的 机 会 2. 酶 目 前 有 两 种 Taq DNA 聚 合 酶 供 应, 一 种 是 从 栖 热 水 生 杆 菌 中 提 纯 的 天 然 酶, 另 一 种 为

106 106 大 肠 菌 合 成 的 基 因 工 程 酶 催 化 一 典 型 的 PR 反 应 约 需 酶 量 2.5ul ( 指 总 反 应 体 积 为 100ul 时 ), 浓 度 过 高 可 引 起 非 特 异 性 扩 增, 浓 度 过 低 则 合 成 产 物 量 减 少 3.dNTP dntp 的 质 量 与 浓 度 和 PR 扩 增 效 率 有 密 切 关 系,dNTP 粉 呈 颗 粒 状, 如 保 存 不 当 易 变 性 失 去 生 物 学 活 性 dntp 溶 液 呈 酸 性, 使 用 时 应 配 成 高 浓 度 后, 以 1M NaH 或 1M Tris HL 的 缓 冲 液 将 其 PH 调 节 到 7.0~7.5, 小 量 分 装, -20 冰 冻 保 存 多 次 冻 融 会 使 dntp 降 解 在 PR 反 应 中,dNTP 应 为 50~200umol/L, 尤 其 是 注 意 4 种 dntp 的 浓 度 要 相 等 ( 等 摩 尔 配 制 ), 如 其 中 任 何 一 种 浓 度 不 同 于 其 它 几 种 时 ( 偏 高 或 偏 低 ), 就 会 引 起 错 配 浓 度 过 低 又 会 降 低 PR 产 物 的 产 量 dntp 能 与 Mg2+ 结 合, 使 游 离 的 Mg2+ 浓 度 降 低 4. 模 板 模 板 核 酸 的 量 与 纯 化 程 度, 是 PR 成 败 与 否 的 关 键 环 节 之 一, 传 统 的 DNA 纯 化 方 法 通 常 采 用 SDS 和 蛋 白 酶 K 来 消 化 处 理 标 本 SDS 的 主 要 功 能 是 : 溶 解 细 胞 膜 上 的 脂 类 与 蛋 白 质, 因 而 溶 解 膜 蛋 白 而 破 坏 细 胞 膜, 并 解 离 细 胞 中 的 核 蛋 白,SDS 还 能 与 蛋 白 质 结 合 而 沉 淀 ; 蛋 白 酶 K 能 水 解 消 化 蛋 白 质, 特 别 是 与 DNA 结 合 的 组 蛋 白, 再 用 有 机 溶 剂 酚 与 氯 仿 抽 提 掉 蛋 白 质 和 其 它 细 胞 组 份, 用 乙 醇 或 异 丙 醇 沉 淀 核 酸 提 取 的 核 酸 即 可 作 为 模 板 用 于 PR 反 应 一 般 临 床 检 测 标 本, 可 采 用 快 速 简 便 的 方 法 溶 解 细 胞, 裂 解 病 原 体, 消 化 除 去 染 色 体 的 蛋 白 质 使 靶 基 因 游 离, 直 接 用 于 PR 扩 增 RNA 模 板 提 取 一 般 采 用 异 硫 氰 酸 胍 或 蛋 白 酶 K 法, 要 防 止 RNase 降 解 RNA 5.Mg 2+ 浓 度 Mg 2+ 对 PR 扩 增 的 特 异 性 和 产 量 有 显 著 的 影 响, 在 一 般 的 PR 反 应 中, 各 种 dntp 浓 度 为 200umol/L 时,Mg2+ 浓 度 为 1.5~2.0mmol/L 为 宜 Mg2+ 浓 度 过 高, 反 应 特 异 性 降 低, 出 现 非 特 异 扩 增, 浓 度 过 低 会 降 低 Taq DNA 聚 合 酶 的 活 性, 使 反 应 产 物 减 少 PR 反 应 条 件 的 选 择 1 温 度 与 时 间 的 设 置 基 于 PR 原 理 三 步 骤 而 设 置 变 性 - 退 火 - 延 伸 三 个 温 度 点 在 标 准 反 应 中 采 用 三 温 度 点 法, 双 链 DNA 在 90~95 变 性, 再 迅 速 冷 却 至 40 ~60, 引 物 退 火 并 结 合 到 靶 序 列 上, 然 后 快 速 升 温 至 70~75, 在 Taq DNA 聚 合 酶 的 作 用 下, 使 引 物 链 沿 模 板 延 伸 对 于 较 短 靶 基 因 ( 长 度 为 100~300bp 时 ) 可 采 用 二 温 度 点 法, 除 变 性 温 度 外 退 火 与 延 伸 温 度 可 合 二 为 一, 一 般 采 用 94 变 性,65 左 右 退 火 与 延 伸 ( 此 温 度 Taq DNA 酶 仍 有 较 高 的 催 化 活 性 ) 1 变 性 温 度 与 时 间 变 性 温 度 低, 解 链 不 完 全 是 导 致 PR 失 败 的 最 主 要 原 因 一 般 情 况 下,93 ~94 l min 足 以 使 模 板 DNA 变 性, 若 低 于 93 则 需 延 长 时 间, 但 温 度 不 能 过 高, 因 为 高 温 环 境 对 酶 的 活 性 有 影 响 此 步 若 不 能 使 靶 基 因 模 板 或 PR 产 物 完 全 变 性, 就 会 导 致 PR 失 败 2 退 火 ( 复 性 ) 温 度 与 时 间

107 107 退 火 温 度 是 影 响 PR 特 异 性 的 较 重 要 因 素 变 性 后 温 度 快 速 冷 却 至 40 ~60, 可 使 引 物 和 模 板 发 生 结 合 由 于 模 板 DNA 比 引 物 复 杂 得 多, 引 物 和 模 板 之 间 的 碰 撞 结 合 机 会 远 远 高 于 模 板 互 补 链 之 间 的 碰 撞 退 火 温 度 与 时 间, 取 决 于 引 物 的 长 度 碱 基 组 成 及 其 浓 度, 还 有 靶 基 序 列 的 长 度 对 于 20 个 核 苷 酸,G+ 含 量 约 50% 的 引 物,55 为 选 择 最 适 退 火 温 度 的 起 点 较 为 理 想 引 物 的 复 性 温 度 可 通 过 以 下 公 式 帮 助 选 择 合 适 的 温 度 : Tm 值 ( 解 链 温 度 )=4(G+)+2(A+T) 复 性 温 度 =Tm 值 -(5~10 ) 在 Tm 值 允 许 范 围 内, 选 择 较 高 的 复 性 温 度 可 大 大 减 少 引 物 和 模 板 间 的 非 特 异 性 结 合, 提 高 PR 反 应 的 特 异 性 复 性 时 间 一 般 为 30~60sec, 足 以 使 引 物 与 模 板 之 间 完 全 结 合 3 延 伸 温 度 与 时 间 Taq DNA 聚 合 酶 的 生 物 学 活 性 : 70~ 核 苷 酸 /S/ 酶 分 子 核 苷 酸 /S/ 酶 分 子 核 苷 酸 /S/ 酶 分 子 高 于 90 时, DNA 合 成 几 乎 不 能 进 行 PR 反 应 的 延 伸 温 度 一 般 选 择 在 70~75 之 间, 常 用 温 度 为 72, 过 高 的 延 伸 温 度 不 利 于 引 物 和 模 板 的 结 合 PR 延 伸 反 应 的 时 间, 可 根 据 待 扩 增 片 段 的 长 度 而 定, 一 般 1Kb 以 内 的 DNA 片 段, 延 伸 时 间 1min 是 足 够 的 3~4kb 的 靶 序 列 需 3~4min; 扩 增 10Kb 需 延 伸 至 15min 延 伸 进 间 过 长 会 导 致 非 特 异 性 扩 增 带 的 出 现 对 低 浓 度 模 板 的 扩 增, 延 伸 时 间 要 稍 长 些 2. 循 环 次 数 循 环 次 数 决 定 PR 扩 增 程 度 PR 循 环 次 数 主 要 取 决 于 模 板 DNA 的 浓 度 一 般 的 循 环 次 数 选 在 30~40 次 之 间, 循 环 次 数 越 多, 非 特 异 性 产 物 的 量 亦 随 之 增 多 PR 反 应 操 作 步 骤 1. 在 冰 浴 中, 按 以 下 次 序 将 各 成 分 加 入 一 无 菌 0.5ml 离 心 管 中 10 PR buffer5 μl dntp mix (2mM)4 μl 引 物 1(10pM)2 μl 引 物 2(10pM)2 μl Taq 酶 (2U/μl)1 μl DNA 模 板 (50ng-1μg/μl)1 μl 加 ddh2 至 50 μl 视 PR 仪 有 无 热 盖, 不 加 或 添 加 石 蜡 油

108 调 整 好 反 应 程 序 将 上 述 混 合 液 稍 加 离 心, 立 即 置 PR 仪 上, 执 行 扩 增 一 般 : 在 93 预 变 性 3-5min, 进 入 循 环 扩 增 阶 段 :93 40s 58 30s 72 60s, 循 环 次, 最 后 在 72 保 温 7min 3. 结 束 反 应,PR 产 物 放 置 于 4 待 电 泳 检 测 或 -20 长 期 保 存 PR 反 应 特 点 1. 特 异 性 强 PR 反 应 的 特 异 性 决 定 因 素 为 : 1 引 物 与 模 板 DNA 特 异 正 确 的 结 合 ; 2 碱 基 配 对 原 则 ; 3Taq DNA 聚 合 酶 合 成 反 应 的 忠 实 性 ; 4 靶 基 因 的 特 异 性 与 保 守 性 其 中 引 物 与 模 板 的 正 确 结 合 是 关 键 引 物 与 模 板 的 结 合 及 引 物 链 的 延 伸 是 遵 循 碱 基 配 对 原 则 的 聚 合 酶 合 成 反 应 的 忠 实 性 及 Taq DNA 聚 合 酶 耐 高 温 性, 使 反 应 中 模 板 与 引 物 的 结 合 ( 复 性 ) 可 以 在 较 高 的 温 度 下 进 行, 结 合 的 特 异 性 大 大 增 加, 被 扩 增 的 靶 基 因 片 段 也 就 能 保 持 很 高 的 正 确 度 再 通 过 选 择 特 异 性 和 保 守 性 高 的 靶 基 因 区, 其 特 异 性 程 度 就 更 高 2. 灵 敏 度 高 PR 产 物 的 生 成 量 是 以 指 数 方 式 增 加 的, 能 将 皮 克 (pg=10-12) 量 级 的 起 始 待 测 模 板 扩 增 到 微 克 (ug=-6) 水 平 能 从 100 万 个 细 胞 中 检 出 一 个 靶 细 胞 ; 在 病 毒 的 检 测 中,PR 的 灵 敏 度 可 达 3 个 RFU( 空 斑 形 成 单 位 ); 在 细 菌 学 中 最 小 检 出 率 为 3 个 细 菌 3. 简 便 快 速 PR 反 应 用 耐 高 温 的 Taq DNA 聚 合 酶, 一 次 性 地 将 反 应 液 加 好 后, 即 在 DNA 扩 增 液 和 水 浴 锅 上 进 行 变 性 - 退 火 - 延 伸 反 应, 一 般 在 2~4 小 时 完 成 扩 增 反 应 扩 增 产 物 一 般 用 电 泳 分 析, 不 一 定 要 用 同 位 素, 无 放 射 性 污 染 易 推 广 4. 对 标 本 的 纯 度 要 求 低 不 需 要 分 离 病 毒 或 细 菌 及 培 养 细 胞,DNA 粗 制 品 及 总 RNA 均 可 作 为 扩 增 模 板 可 直 接 用 临 床 标 本 如 血 液 体 腔 液 洗 嗽 液 毛 发 细 胞 活 组 织 等 粗 制 的 DNA 扩 增 检 测 注 意 事 项 1.PR 反 应 应 该 在 一 个 没 有 DNA 污 染 的 干 净 环 境 中 进 行 最 好 设 立 一 个 专 用 的 PR 实 验 室 2. 纯 化 模 板 所 选 用 的 方 法 对 污 染 的 风 险 有 极 大 影 响 一 般 而 言, 只 要 能 够 得 到 可 靠 的 结 果, 纯 化 的 方 法 越 简 单 越 好 3. 所 有 试 剂 都 应 该 没 有 核 酸 和 核 酸 酶 的 污 染 操 作 过 程 中 均 应 戴 手 套 4.PR 试 剂 配 制 应 使 用 最 高 质 量 的 新 鲜 双 蒸 水, 采 用 0.22μm 滤 膜 过 滤 除 菌 或 高 压 灭 菌 5.

109 109 试 剂 都 应 该 以 大 体 积 配 制, 试 验 一 下 是 否 满 意, 然 后 分 装 成 仅 够 一 次 使 用 的 量 储 存, 从 而 确 保 实 验 与 实 验 之 间 的 连 续 性 6. 试 剂 或 样 品 准 备 过 程 中 都 要 使 用 一 次 性 灭 菌 的 塑 料 瓶 和 管 子, 玻 璃 器 皿 应 洗 涤 干 净 并 高 压 灭 菌 7.PR 的 样 品 应 在 冰 浴 上 化 开, 并 且 要 充 分 混 匀 2.9 细 胞 总 RNA 提 取 由 于 mrna 分 子 的 结 构 特 点, 容 易 受 RNA 酶 的 攻 击 反 应 而 降 解, 加 上 RNA 酶 极 为 稳 定 且 广 泛 存 在, 因 而 在 提 取 过 程 中 要 严 格 防 止 RNA 酶 的 污 染, 并 设 法 抑 制 其 活 性, 这 是 本 实 验 成 败 的 关 键 所 有 的 组 织 中 均 存 在 RNA 酶, 人 的 皮 肤 手 指 试 剂 容 器 等 均 可 能 被 污 染, 因 此 全 部 实 验 过 程 中 均 需 戴 手 套 操 作 并 经 常 更 换 ( 使 用 一 次 性 手 套 ) 所 用 的 玻 璃 器 皿 需 置 于 干 燥 烘 箱 中 200 烘 烤 2 小 时 以 上 凡 是 不 能 用 高 温 烘 烤 的 材 料 如 塑 料 容 器 等 皆 可 用 0.1% 的 焦 碳 酸 二 乙 酯 (DEP) 水 溶 液 处 理, 再 用 蒸 馏 水 冲 净 DEP 是 RNA 酶 的 化 学 修 饰 剂, 它 和 RNA 酶 的 活 性 基 团 组 氨 酸 的 咪 唑 环 反 应 而 抑 制 酶 活 性 DEP 与 氨 水 溶 液 混 合 会 产 生 致 癌 物, 因 而 使 用 时 需 小 心 试 验 所 用 试 剂 也 可 用 DEP 处 理, 加 入 DEP 至 0.1% 浓 度, 然 后 剧 烈 振 荡 10 分 钟, 再 煮 沸 15 分 钟 或 高 压 灭 菌 以 消 除 残 存 的 DEP, 否 则 DEP 也 能 和 腺 嘌 呤 作 用 而 破 坏 mrna 活 性 但 DEP 能 与 胺 和 巯 基 反 应, 因 而 含 Tris 和 DTT 的 试 剂 不 能 用 DEP 处 理 Tris 溶 液 可 用 DEP 处 理 的 水 配 制 然 后 高 压 灭 菌 配 制 的 溶 液 如 不 能 高 压 灭 菌, 可 用 DEP 处 理 水 配 制, 并 尽 可 能 用 未 曾 开 封 的 试 剂 除 DEP 外, 也 可 用 异 硫 氰 酸 胍 钒 氧 核 苷 酸 复 合 物 RNA 酶 抑 制 蛋 白 等 此 外, 为 了 避 免 mrna 吸 附 在 玻 璃 或 塑 料 器 皿 管 壁 上, 所 有 器 皿 一 律 需 经 硅 烷 化 处 理 TRIzol 法 提 取 细 胞 总 RNA TRIZL 试 剂 是 直 接 从 细 胞 或 组 织 中 提 取 总 RNA 的 试 剂 它 在 破 碎 和 溶 解 细 胞 时 能 保 持 RNA 的 完 整 性 加 入 氯 仿 后 离 心, 样 品 分 成 水 样 层 和 有 机 层 RNA 存 在 于 水 样 层 中 收 集 上 面 的 的 水 样 层 后,RNA 可 以 通 过 异 丙 醇 沉 淀 来 还 原 在 除 去 水 样 层 后, 样 品 中 的 DNA 和 蛋 白 也 能 相 继 以 沉 淀 的 方 式 还 原 乙 醇 沉 淀 能 析 出 中 间 层 的 DNA, 在 有 机 层 中 加 入 异 丙 醇 能 沉 淀 出 蛋 白 共 纯 化 DNA 对 于 样 品 间 标 准 化 RNA 的 产 量 十 分 有 用 无 论 是 人 动 物 植 物 还 是 细 菌 组 织, 该 方 法 对 少 量 的 组 织 ( mg) 和 细 胞 ( ) 以 及 大 量 的 组 织 ( 1 g) 和 细 胞 (>10 7 ) 均 有 较 好 的 分 离 效 果 TRIZL 试 剂 操 作 上 的 简 单 性 允 许 同 时 处 理 多 个 的 样 品 所 有 的 操 作 可 以 在 一 小 时 内 完 成 TRIZL 抽 提 的 总 RNA 能 够 避 免 DNA 和 蛋 白 的 污 染 故 而 能 够 作 RNA 印 迹 分 析 斑 点 杂 交 poly(a)+ 选 择 体 外 翻 译 RNA 酶 保 护 分 析 和 分 子 克 隆 如 果 是 用 于 PR, 当 两 条 引 物 位 于 单 一 外 显 子 内 时, 建 议 用 级 联 扩 大 的 DNase I(at. No ) 来 处 理 抽 提 的 总 RNA

110 110 TRIZL 试 剂 能 促 进 不 同 种 属 不 同 分 子 量 大 小 的 多 种 RNA 的 析 出 例 如, 从 大 鼠 肝 脏 抽 提 的 RNA 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 并 用 溴 化 乙 啶 染 色, 可 见 许 多 介 于 7 kb 和 15 kb 之 间 不 连 续 的 高 分 子 量 条 带,(mRNA 和 hnrna 成 分 ) 两 条 优 势 核 糖 体 RNA 条 带 位 于 ~5 kb (28S) 和 ~2 kb (18S), 低 分 子 量 RNA 介 于 0.1 和 0.3 kb 之 间 (trna, 5S) 当 抽 提 的 RNA 用 TE 稀 释 时 其 A260/A280 比 值 所 需 试 剂 异 丙 醇, 无 水 乙 醇, 氯 仿,PBS, 灭 菌 的 DEP 水,TRI201 试 剂 2. 实 验 步 骤 待 细 胞 在 培 养 瓶 中 贴 壁 满 后 ( 约 有 10 7 个 细 胞 ), 即 可 提 取 总 RNA (1) 在 工 作 台 面 上 铺 一 层 保 鲜 膜 用 70% 消 毒 乙 醇 ( 棉 ) 擦 洗 手 套 细 胞 培 养 瓶 和 移 液 枪 (2) 将 培 养 瓶 中 的 培 养 液 倒 入 废 液 缸, 吸 取 3mlPBS 洗 涤 细 胞, 倒 掉 PBS, 再 重 复 洗 涤 一 次 (Tip 头 均 用 镊 子 夹 取 ) (3) 更 换 Tip 头, 想 培 养 瓶 中 加 入 1-1.5mlTRI201 裂 解 液, 轻 轻 摇 晃 2min, 室 温 放 置 5min, 然 后 用 移 液 枪 将 TRI201 裂 解 液 平 均 移 取 至 2 个 1.5ml 的 Ep 管 中, 向 每 个 Ep 管 加 入 100μl 的 氯 仿, 用 力 摇 摆 15s 混 匀, 静 止 5min ( 每 1mlTri201 加 入 200μl 氯 仿 加 氯 仿 的 目 的 : 分 离 蛋 白 质 DNA 和 RNA) (4) 在 Eppendorf 离 心 机 上 4 下,1200g 离 心 15min ( 应 先 将 离 心 机 冷 冻 至 4, 再 放 入 Ep 管 离 心 后,DNA 在 下 层, 蛋 白 质 在 中 间,RNA 在 上 层 ) (5) 离 心 结 束 前 1-2 两 分 钟, 取 出 两 个 新 的 Ep 管 用 于 盛 RNA 离 心 后, 用 移 液 枪 吸 取 透 明 RNA 放 入 两 个 新 Ep 管 中 ( 注 意 : 移 取 时 应 小 心, 不 要 碰 到 蛋 白 质, 可 留 部 分 RNA 不 移 入 以 保 证 RNA 的 纯 度 ) (6) 向 2 个 盛 RNA 的 Ep 管 中 各 加 入 250μl 异 丙 醇, 混 合 均 匀, 室 温 静 置 10min( 异 丙 醇 的 作 用 为 沉 淀 RNA) 另 取 2 个 新 Ep 管, 每 管 中 各 加 入 300μlDEP 水 和 700μl 无 水 乙 醇, 用 于 RNA 的 洗 涤 (7)10min 后, 将 RNA 于 4 下,1200g 离 心 10min 离 心 后 弃 上 清 夜, 底 部 少 量 白 色 沉 淀 为 RNA (8) 将 配 好 的 乙 醇 洗 涤 液 加 入 2 份 RNA 中, 振 摇, 使 RNA 溶 解 再 于 4 下,1200g 离 心 5min 弃 上 层 乙 醇 溶 液, 将 Ep 管 倒 立 与 滤 纸 上 一 吸 干 乙 醇, 可 左 右 移 动 Ep 管 来 吹 干 管 内 的 乙 醇 (9) 向 其 中 一 个 Ep 管 中 加 入 30μlDEP 水, 溶 解 RNA, 用 移 液 枪 将 RNA 移 入 另 一 Ep 管 中, 合 并 两 份 RNA, 将 提 取 的 两 份 RNA 保 存 与 -20 的 冰 箱 中 3. 预 防 RNA 酶 污 染 : 在 抽 提 RNA 过 程 中 任 一 环 节 的 不 正 确 操 作 都 可 能 导 致 RNA 酶 的 污 染 由 于 RNA 酶 的 活 性

111 111 很 难 完 全 抑 制, 预 防 其 污 染 是 十 分 必 要 的 在 实 际 的 操 作 中 应 遵 循 以 下 指 南 : (1). 全 程 佩 戴 一 次 性 手 套 皮 肤 经 常 带 有 细 菌 和 霉 菌, 可 能 污 染 RNA 的 抽 提 并 成 为 RNA 酶 的 来 源 培 养 良 好 的 微 生 物 实 验 操 作 习 惯 预 防 微 生 物 污 染 (2). 使 用 灭 菌 的, 一 次 性 的 塑 料 器 皿 和 自 动 吸 管 抽 提 RNA, 避 免 使 用 公 共 仪 器 所 导 致 的 RNA 酶 交 叉 污 染 例 如, 使 用 RNA 探 针 的 实 验 室 可 能 用 RNA 酶 A 或 T1 来 降 低 滤 纸 上 的 背 景, 因 而 某 些 非 一 次 性 的 物 品 ( 如 自 动 吸 管 ) 可 能 富 含 RNA 酶 (3). 在 TRIZL 中,RNA 是 隔 离 在 RNA 酶 污 染 之 外 的 而 对 样 品 的 后 续 操 作 会 要 求 用 无 RNA 酶 的 非 一 次 性 的 玻 璃 器 皿 或 塑 料 器 皿 玻 璃 器 皿 可 以 在 150 的 烘 箱 中 烘 烤 4 小 时 塑 料 器 皿 可 以 在 0.5 M NaH 中 浸 泡 10 分 钟, 用 水 彻 底 漂 洗 干 净 后 高 压 灭 菌 备 用 4. 其 他 注 意 事 项 (1) 当 TRIZL 用 量 少 于 2-ml 时 建 议 使 用 清 洁 的 一 次 性 的 聚 丙 材 质 试 管 (2) 当 TRIZL 用 量 较 大 时, 可 以 使 用 玻 璃 试 管 (orex) 或 聚 丙 材 质 试 管 事 先 检 验 以 确 保 该 试 管 可 以 耐 受 加 入 TRIZL 和 氯 仿 后 12,000 g 的 离 心 力 不 可 使 用 有 裂 缝 或 者 破 损 的 试 管 (3) 离 心 前 小 心 平 衡 试 管 5. 抽 提 得 率 低 的 原 因 (1). 样 品 均 化 或 裂 解 不 完 全 (2). 终 RNA 不 完 全 再 溶 解 6. A260/A280 比 率 <1.65 的 原 因 (1) 在 分 光 光 度 计 测 量 前 用 水 而 不 是 用 TE 缓 冲 液 稀 释 RNA 样 品 低 离 子 强 度 和 低 ph 溶 液 会 增 加 280 nm 处 的 光 吸 收 值 (2) 样 品 匀 浆 化 时 所 加 的 TRIZL 量 太 少 (3) 匀 浆 化 后 样 品 没 有 在 室 温 下 放 置 5 分 钟 (4) 分 离 的 水 样 层 中 污 染 有 苯 酚 层 (5) 终 RNA 没 有 完 全 溶 解 7. RNA 降 解 的 原 因 (1) 用 于 抽 提 的 样 品, 或 抽 提 的 RNA 样 品 保 存 于 5 20, 而 不 是 存 放 (2) 细 胞 经 胰 酶 消 化 而 分 散 (3) 水 溶 液 或 试 管 污 染 有 RNA 酶 (4) 用 于 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 的 福 尔 马 林 ph 低 于 DNA 污 染 原 因 (1) 样 品 匀 浆 化 时 所 加 的 TRIZL 量 太 少 (2) 用 于 抽 提 的 样 品 包 含 有 机 溶 媒 ( 例 如, 乙 醇,DMS), 强 缓 冲 液, 或 碱 性 溶 液

112 基 因 组 DNA 的 提 取 ( 文 建 辉 提 供 ) 基 因 组 DNA 的 提 取 通 常 用 于 构 建 基 因 组 文 库 Southern 杂 交 ( 包 括 RFLP) 及 PR 分 离 基 因 等 利 用 基 因 组 DNA 较 长 的 特 性, 可 以 将 其 与 细 胞 器 或 质 粒 等 小 分 子 DNA 分 离 加 入 一 定 量 的 异 丙 醇 或 乙 醇, 基 因 组 的 大 分 子 DNA 即 沉 淀 形 成 纤 维 状 絮 团 飘 浮 其 中, 可 用 玻 棒 将 其 取 出, 而 小 分 子 DNA 则 只 形 成 颗 粒 状 沉 淀 附 于 壁 上 及 底 部, 从 而 达 到 提 取 的 目 的 在 提 取 过 程 中, 染 色 体 会 发 生 机 械 断 裂, 产 生 大 小 不 同 的 片 段, 因 此 分 离 基 因 组 DNA 时 应 尽 量 在 温 和 的 条 件 下 操 作, 如 尽 量 减 少 酚 / 氯 仿 抽 提 混 匀 过 程 要 轻 缓, 以 保 证 得 到 较 长 的 DNA 一 般 来 说, 构 建 基 因 组 文 库, 初 始 DNA 长 度 必 须 在 100kb 以 上, 否 则 酶 切 后 两 边 都 带 合 适 末 端 的 有 效 片 段 很 少 而 进 行 RFLP 和 PR 分 析, DNA 长 度 可 短 至 50kb, 在 该 长 度 以 上, 可 保 证 酶 切 后 产 生 RFLP 片 段 (20kb 以 下 ), 并 可 保 证 包 含 PR 所 扩 增 的 片 段 ( 一 般 2kb 以 下 ) 不 同 生 物 ( 植 物 动 物 微 生 物 ) 的 基 因 组 DNA 的 提 取 方 法 有 所 不 同 ; 不 同 种 类 或 同 一 种 类 的 不 同 组 织 因 其 细 胞 结 构 及 所 含 的 成 分 不 同, 分 离 方 法 也 有 差 异 在 提 取 某 种 特 殊 组 织 的 DNA 时 必 须 参 照 文 献 和 经 验 建 立 相 应 的 提 取 方 法, 以 获 得 可 用 的 DNA 大 分 子 DNA 提 取 的 几 种 方 法 (1) 浓 盐 法 利 用 RNP 和 DNP 在 电 解 溶 液 中 溶 解 度 不 同, 将 二 者 分 离, 常 用 的 方 法 是 用 1M 氯 纳 提 取 化 钠 抽 提, 得 到 的 DNP 粘 液 与 含 有 少 量 辛 醇 的 氯 仿 一 起 摇 荡, 使 乳 化, 再 离 心 除 去 蛋 白 质, 此 时 蛋 白 质 凝 胶 停 留 在 水 相 及 氯 仿 相 中 间, 而 DNA 位 于 上 层 水 相 中, 用 2 倍 体 积 95% 乙 醇 可 将 DNA 钠 盐 沉 淀 出 来. 也 可 用 0.15 MNaL 液 反 复 洗 涤 细 胞 破 碎 液 除 去 RNP, 再 以 1MNaL 提 取 脱 氧 核 糖 蛋 白, 再 按 氯 仿 --- 异 醇 法 除 去 蛋 白. 两 种 方 法 比 较, 后 种 方 法 使 核 酸 降 解 可 能 少 一 些. 以 稀 盐 酸 溶 液 提 取 DNA 时, 加 入 适 量 去 污 剂, 如 SDS 可 有 助 于 蛋 白 质 与 DNA 的 分 离 在 提 取 过 程 中 为 抑 制 组 织 中 的 DNase 对 DNA 的 降 解 作 用, 在 氯 化 钠 溶 液 中 加 入 柠 檬 酸 钠 作 为 金 属 离 子 的 烙 合 剂. 通 常 用.15MNaL,0.015M 柠 檬 钠, 并 称 SS 溶 液, 提 取 DNA. (2) 阴 离 子 去 污 剂 法 : 用 SDS 或 二 甲 苯 酸 钠 等 去 污 剂 使 蛋 白 质 变 性, 可 以 直 接 从 生 物 材 料 中 提 取 DNA. 由 于 细 胞 中 DNA 与 蛋 白 质 之 间 常 借 静 电 引 力 或 配 位 键 结 合, 因 为 阴 离 子 去 污 剂 能 够 破 坏 这 种 价 键, 所 以 常 用 阴 离 子 去 污 剂 提 取 DNA. (3) 苯 酚 抽 提 法 : 苯 酚 作 为 蛋 白 变 性 剂, 同 时 抑 制 了 DNase 的 降 解 作 用. 用 苯 酚 处 理 匀 浆 液 时, 由 于 蛋 白 与 DNA 联 结 键 已 断, 蛋 白 分 子 表 面 又 含 有 很 多 极 性 基 团 与 苯 酚 相 似 相 溶 蛋 白 分 子 溶 于 酚 相, 而 DNA 溶 于 水 相 离 心 分 层 后 取 出 水 层, 多 次 重 复 操 作, 再 合 并 含 DNA 的 水 相, 利 用 核 酸 不 溶 于 醇 的 性 质, 用 乙 醇 沉 淀 DNA 此 时 DNA 是 十 分 粘 稠 的 物 质, 可 用 玻 璃 漫 漫 绕 成 一 团, 取

113 113 出 此 法 的 特 点 是 使 提 取 的 DNA 保 持 天 然 状 态. (4) 水 抽 提 法 : 利 用 核 酸 溶 解 于 水 的 性 质, 将 组 织 细 胞 破 碎 后, 用 低 盐 溶 液 除 去 RNA, 然 后 将 沉 淀 溶 于 水 中, 使 DNA 充 分 溶 解 于 水 中, 离 心 后 收 集 上 清 液. 在 上 清 中 加 入 固 体 氯 化 钠 调 节 至 2.6M. 加 入 2 倍 体 积 95% 乙 醇, 立 即 用 搅 拌 法 搅 出. 然 后 分 别 用 66% ٠ 80% 和 95% 乙 醇 以 及 丙 铜 洗 涤, 最 后 在 空 气 中 干 燥, 既 得 DNA 样 品. 此 法 提 取 的 DNA 中 蛋 白 质 含 量 较 高, 故 一 般 不 用. 为 除 蛋 白 可 将 此 法 加 以 改 良, 在 提 取 过 程 中 加 入 SDS 从 动 物 组 织 提 取 基 因 组 DNA 1. 材 料 : 哺 乳 动 物 新 鲜 组 织 2. 设 备 : 移 液 管 高 速 冷 冻 离 心 机 台 式 离 心 机 水 浴 锅 3. 试 剂 (1) 分 离 缓 冲 液 :10mmol/L Tris l ph7.4, 10mmol/L Nal, 25mmol/L EDTA (2) 其 它 试 剂 :10% SDS, 蛋 白 酶 K (20mg/ml 或 粉 剂 ), 乙 醚, 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1), 无 水 乙 醇 及 70% 乙 醇,5mol/L Nal,3mol/L NaAc,TE 4 操 作 步 骤 : (1) 切 取 组 织 5g 左 右, 剔 除 结 缔 组 织, 吸 水 纸 吸 干 血 液, 剪 碎 放 入 研 钵 ( 越 细 越 好 ) (2) 倒 入 液 氮, 磨 成 粉 末, 加 10ml 分 离 缓 冲 液 (3) 加 1ml 10% SDS, 混 匀, 此 时 样 品 变 得 很 粘 稠 (4) 加 50ul 或 1mg 蛋 白 酶 K, 37 保 温 1-2 小 时, 直 到 组 织 完 全 解 体 (5) 加 1ml 5mol/L Nal, 混 匀,5000rpm 离 心 数 秒 钟 (6) 取 上 清 液 于 新 离 心 管, 用 等 体 积 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1) 抽 提 待 分 层 后,3000rpm 离 心 5 分 钟 (7) 取 上 层 水 相 至 干 净 离 心 管, 加 2 倍 体 积 乙 醚 抽 提 ( 在 通 风 情 况 下 操 作 ) (8) 移 去 上 层 乙 醚, 保 留 下 层 水 相 (9) 加 1/10 体 积 3mol/L NaAc, 及 2 倍 体 积 无 水 乙 醇 颠 倒 混 合 沉 淀 DNA 室 温 下 静 止 分 钟,DNA 沉 淀 形 成 白 色 絮 状 物 (10) 用 玻 棒 钩 出 DNA 沉 淀,70% 乙 醇 中 漂 洗 后, 在 吸 水 纸 上 吸 干, 溶 解 于 1ml TE 中,-20 保 存 (11) 如 果 DNA 溶 液 中 有 不 溶 解 颗 粒, 可 在 5000rpm 短 暂 离 心, 取 上 清 ; 如 要 除 去 其 中 的 RNA, 可 加 5μl RNaseA(10μg/μl), 37 保 温 30 分 钟, 用 酚 抽 提 后, 按 步 骤 9-10 重 沉 淀 DNA 细 菌 基 因 组 DNA 的 制 备 1. 材 料 : 细 菌 培 养 物

114 设 备 : 移 液 管, 高 速 冷 冻 离 心 机, 台 式 离 心 机, 水 浴 锅 3. 试 剂 (1)TAB/Nal 溶 液 :4.1g Nal 溶 解 于 80ml H2, 缓 慢 加 入 10g TAB, 加 水 至 100ml (2) 其 它 试 剂 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (24:1), 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1), 异 丙 醇,70% 乙 醇, TE,10% SDS, 蛋 白 酶 K (20mg/ml 或 粉 剂 ),5mol/L Nal 4. 操 作 步 骤 : (1)100ml 细 菌 过 夜 培 养 液, 5000rpm 离 心 10 分 钟, 去 上 清 液 (2) 加 9.5ml TE 悬 浮 沉 淀, 并 加 0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml( 或 1mg 干 粉 ) 蛋 白 酶 K, 混 匀, 37 保 温 1 小 时 (3) 加 1.5ml 5mol/L Nal, 混 匀 (4) 加 1.5ml TAB/Nal 溶 液, 混 匀, 65 保 温 20 分 钟 (5) 用 等 体 积 酚 : 氯 仿 : 异 戊 醇 (25:24:1) 抽 提, 5000rpm 离 心 10 分 钟, 将 上 清 液 移 至 干 净 离 心 管 (6) 用 等 体 积 氯 仿 : 异 戊 醇 (24:1) 抽 提, 取 上 清 液 移 至 干 净 管 中 (7) 加 1 倍 体 积 异 丙 醇, 颠 倒 混 合, 室 温 下 静 止 10 分 钟, 沉 淀 DNA (8) 用 玻 棒 捞 出 DNA 沉 淀, 70% 乙 醇 漂 洗 后, 吸 干, 溶 解 于 1ml TE, -20 保 存 如 DNA 沉 淀 无 法 捞 出, 可 5000rpm 离 心, 使 DNA 沉 淀 参 考 文 献 : 1 生 物 分 子 固 定 化 技 术 及 应 用, 蒋 中 华, 张 津 辉 主 编,1998.7, 化 学 工 业 出 版 社. 2 蛋 白 质 化 学 修 饰, 周 海 梦, 王 洪 睿 编 著,1998.8, 清 华 大 学 出 版 社. 3 基 础 化 学 实 验, 蔡 炳 新, 陈 贻 文 主 编 , 科 学 出 版 社. 4. 生 物 化 学 实 验 技 术. 袁 道 强, 黄 建 华 主 编. 中 国 轻 工 业 出 版 社. 5. 离 心 机 的 使 用 与 维 护. 刘 明, 赵 琦. 现 代 仪 器, 2003(6), 冻 干 机 的 选 型 使 用 及 维 护 保 养. 叶 永 明. 机 电 信 息, 2004(15),