乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus) 檢驗標準作業手冊 1. 目的 : 乙型鏈球菌 (Group B Streptococcus; GBS; 學名 Streptococcus agalactiae) 被認為是嬰兒出生前後感染及死亡的重要原因 被乙型鏈球菌感染的嬰兒往往會導致嚴重的併發症, 包括敗血症 肺炎及腦膜炎等, 嚴重則會造成死亡及永久性的神經性後遺症 乙型鏈球菌感染新生兒的途徑, 通常是在分娩的時候經由母體感染, 所以若能在孕婦懷孕時期早期診斷出是否感染乙型鏈球菌, 就可以有效預防新生兒感染的危險 因此, 美國疾病管制局建議懷孕 35-37 週的婦女應做全面性的篩檢, 採檢的部位為陰道及直腸末端, 可以增加乙型鏈球菌的診斷機率約 50 %以上, 若在確定診斷後給予孕婦抗生素的治療, 新生兒感染乙型鏈球菌的機率則可以降低 75 %以上 2. 範圍 : 懷孕 35-37 週的婦女 ( 包括計畫性剖腹產孕婦 ) 3. 材料及試劑 : 3.1 Amies 或 Stuart s 的運送培養基 3.2 增菌培養基 : 可選擇使用, 步驟中以 LIM broth 為例說明之 3.2.1 LIM broth ( 含 10 μg/ml 的 cloistin 及 15 μg/ml 的 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養液 ) 3.2.2 含 5% 綿羊血的 Trans-Vag broth ( 含 8 μg/ml 的 gentamicin 及 15 μg/ml 的 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養液 ) 3.2.3 StrepB carrot broth( 含 Granada medium 可偵測溶血型的 GBS 菌株 ) 3.3 建議培養基 3.3.1 Blood agar plate (BAP) 3.3.2 Columbia colistin-nalidixic acid agar (CNA) 3.3.3 乙型鏈球菌產色培養基 (CHROMagar GBS): 依產品說明使用 3.4 二氧化碳 (5%) 培養箱 3.5 觸媒 (3% catalase): 10 ml, 30% H 2 O 2 + 90 ml 無菌水,2-8 保存 3.6 革蘭氏染色套組 (Gram stain kit) 3.7 標準菌株 3.7.1 Staphylococcus aureus ATCC 25923
3.7.2 Streptococcus agalactiae ATCC 12386 3.7.3 S. pyogenes ATCC 19615 3.8 Hippurate (1%) 試劑 :1 g sodium hippurate + 100 ml 無菌水, 分裝 0.4 ml 備用, 保存於 -20, 直到品管異常後丟棄 3.9 Ninhydrin (3.5%) 試劑 :50 ml acetone + 50 ml 1-butanol + 3.5 g ninhydrin; 存放於棕色瓶內, 室溫下可保存 6 個月 3.10 自動化鑑定儀器或其他商業試劑套組 4. 培養步驟 : 4.1 LIM broth 4.1.1 將陰道 - 肛門拭子接種到 LIM broth 中 4.1.2 將接種後之 LIM broth 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中, 培養 18-24 小時 4.1.3 無論是否混濁, 將 LIM broth 次培養於 BAP( 或其他建議培養基 ) 上 4.1.4 將次培養之 BAP( 或其他建議培養基 ) 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 4.1.5 若無懷疑菌落, 則延長培養 18-24 小時後再行觀察 4.2 StrepB carrot broth 4.2.1 將陰道 - 肛門拭子接種到 StrepB carrot broth 中 4.2.2 將接種後之 StrepB carrot broth 於 35-37 培養箱中, 培養 18-24 小時 4.2.3 若 broth 產生橘色至紅色的變化, 則判定為 GBS 陽性 (1) 將 broth 次培養於 BAP( 或 CNA) 上 (2) 將次培養之培養基, 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 (3) 挑取 GBS 菌落進行藥物感受性試驗 4.2.4 若 broth 無顏色變化 (1) 將 broth 次培養於 BAP( 或 CNA) 上 (2) 將次培養之培養基於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 (3) 選取懷疑的菌落進行 5.2~5.4 之鑑定流程 5. 鑑定流程 ( 圖二 ): 5.1 觀察 BAP 培養基上灰色半透明菌落 ( 窄型之 Beta 溶血或無溶血 )
5.2 做觸媒 (3% catalase) 試驗 5.3 若觸媒試驗陰性, 進一步做革蘭氏染色 5.4 若染色呈現革蘭氏陽性鏈球菌 (Gram positve coccus in chains), 則進行下列任一個確定試驗來鑑定 5.4.1 CAMP test (Christie, Atkins, Munch-Peterson test)( 圖一 ) (1) 以直線劃法將標準菌株 Staphylococcus aureus ATCC 25923 劃於 BAP 中間的位置 (2) 同樣以直線劃法, 將測試菌株垂直步驟 (1) 之菌線劃於 BAP 上, 切勿碰觸步驟 (1) 之菌線 (3) 將 BAP 於 35-37, 二氧化碳 (5%) 培養箱中培養 18-24 小時 (4) 觀察在 Staphylococcus aureus 與測試菌株之交界處是否產生箭頭狀 (arrowhead) 的加強溶血現象, 有的話則為陽性反應, 確認為乙型鏈球菌 (5) 陰性則不會產生箭頭狀 (arrowhead) 的加強溶血現象 5.4.2 Hippurate hydrolysis test (1) 取出三管已分裝好的 Hippurate 試劑 ( 每管 0.4 ml) (2) 分別加入培養 18-24 小時的測試菌株 陽性對照菌株 (S. agalactiae ATCC 12386) 與陰性對照菌株 (S. pyogenes ATCC 19615), 濃度約需達 McFarland No.3. ( 注意勿將培養基挑起, 以免內含之蛋白質影響試驗結果 ) (3) 於 35-37 培養 2 小時 (4) 加入 4 滴的 ninhydrin 試劑 (5) 於 35-37 培養 30 分鐘 (6) 每隔 10 分鐘觀察一次顏色, 陽性反應會於 30 分鐘內出現深藍色變化, 陰性則呈現淡淡的紫色或不變色 5.4.3 鏈球菌血清分型乳膠凝集試驗 (Latex serologic test for streptococcal grouping): 依試劑操作說明執行 5.4.4 自動化鑑定儀器或商業化套組 (Vitek 2, Phoenix, 或 API 等 ): 依儀器或套組操作說明執行 6. 報告 : 6.1 陰性報告 : 乙型鏈球菌培養陰性 6.2 陽性報告 : 乙型鏈球菌培養陽性 7. 品管 :
7.1 CLSI M22-A3 規範之排除品管項目 :Lim broth, BAP, CNA. 7.2 觸媒 (3% catalase) 7.2.1 陽性對照 :S. aureus ATCC 25923, 產生氣泡 7.2.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 無氣泡產生 7.3 CAMP test 7.3.1 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 產生箭頭狀加強溶血 7.3.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 無加強溶血的現象 7.4 Hippurate test 7.4.1 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 30 分鐘內出現深藍色反應 7.4.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 淡紫色或不變色 7.5 StrepB carrot broth 7.5.1 陽性對照 :S. agalactiae ATCC 12386, 產生橘色至紅色 7.5.2 陰性對照 :S. pyogenes ATCC 19615, 無顏色變化 8. 參考文獻 : 8.1 Clinical microbiology procedure handbook, 3 rd ed., Section 3.9.2, Group B Streptococcus Culture. 8.2 CDC website: www.cdc.gov/groupbstrep/lab 8.3 Clinical Laboratory Standard Institute M22-A3 8.4 CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report, No. RR-10, Vol. 59, 2010. 9. 附圖 : 9.1 圖一,CAMP test 操作結果示意圖 9.2 圖二, 乙型鏈球菌檢驗鑑定流程圖
附圖一 CAMP test BAP 中間直立菌線 :Staphylococcus aureus ATCC 25923; 左側水平菌線 :Group B streptococcus, 與 Staphylococcus aureus ATCC 25923 交界處可見箭頭狀加強溶血區 ; 右側水平菌線 :Group A streptococcus, 與 Staphylococcus aureus ATCC 25923 交界處可見無加強溶血的現象 CAMP test positive control: Group B streptococcus Staphylococcus aureus ATCC 25923 CAMP test negative control: Group A streptococcus
附圖二 乙型鏈球菌檢驗鑑定流程圖 資料來源 : 參考自美國 CDC 網站 ( 部分修改 )