第 16 卷第 2 期 2018 年 3 月 生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol 16 No 2 Mar. 2018 doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2018 02 005 发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机理和快速检测方法研究进展 周凯 1, 唐冰娥 1, 徐振林 1, 刘占 2, 孙远明 1 2, 陈穗 (1. 华南农业大学食品学院广东省食品质量安全重点实验室, 广东广州 510642; 2. 广东美味鲜调味食品有限公司, 广东中山 528000) 摘要 : 氨基甲酸已酯 (EC) 是一种广泛存在于酒类 腐乳和酱油等发酵食品中的 2A 级致癌物, 近年来其安全性引起研究者关注 为了更好地监测和控制发酵食品中的 EC 含量, 从 EC 污染情况出发, 分析了发酵食品中 EC 的形成原因和对应的控制方法, 系统阐述了目前发酵食品中 EC 的快速检测方法, 以期为发展高效 快速 经济的 EC 快速检测方法提供一定的参考 关键词 : 氨基甲酸乙酯 ; 发酵食品 ; 快速检测 ; 致癌物中图分类号 :Q815 文献标识码 :A 文章编号 :1672-3678(2018)02-0031-11 Research progress in formation and rapid detection of ethyl carbamate in fermentation foods ZHOU Kai 1,TANG Binger 1,XU Zhenlin 1,LIU Zhan 2,SUN Yuanming 1,CHEN Hui 2 (1 College of Food Science,Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety,South China Agricultural University, Guangzhou 510642,China; 2 Guangdong Meiweixian Flavoring Food Co.,Ltd.,Zhongshan,528000,China) Abstract:Ethyl carbamate( EC),a group 2A carcinogen,is widely spread in many fermentation foods, particularly in alcoholic beverages,fermented bean curd and soy sauce.increasing researches on EC risks have been assessed in recent years.for better determination and mitigation of EC in fermented foods,we review here EC occurrence,formation mechanism and prevention methods in different fermentation foods and alcoholic beverages,and the rapid detection methods of EC were introduced systematically.this review will provide theoretical basis for development of efficient,quick and economic EC detection methods. Keywords:ethyl carbamate; fermentation food; rapid detection; carcinogen 氨基甲酸乙酯 (EC), 又称尿烷, 在水和醇类溶剂中溶解性良好, 化学工业上有多种用途 [1], 还曾 收稿日期 :2017-10-30 修回日期 :2018-01-06 基金项目 : 国家重点基础研究发展计划 ( 973 计划 ) ( 2012CB720803); 广东省科技计划 ( 2015B020205002); 中山市协同创新中心项目 (2016C1013); 阳江市科技计划 (2016052); 华南农业大学博士生国 ( 境 ) 外联合培养项目 (2017LHPY008) 作者简介 : 周凯 (1990 ), 男, 江西吉安人, 博士研究生, 研究方向 : 食品安全与营养 ; 孙远明 ( 联系人 ), 教授,E mail:ymsun@ scau.edu.cn; 陈穗 ( 联系人 ), 高级工程师,E mail:13286312902@ 163.com 引文格式 : 周凯, 唐冰娥, 徐振林, 等. 发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机理和快速检测方法研究进展 [J]. 生物加工过程,2018,16(2):31-41. ZHOU Kai,TANG Binger,XU Zhenlin,et al.research progress in formation and rapid detection of ethyl carbamate in fermentation foods[ J]. Chin J Bioprocess Eng,2018,16(2):31-41.
32 生物加工过程第 16 卷 [2] 经用于麻醉和肿瘤治疗 [3] 然而, 自从 1943 年 EC 被发现具有潜在的致癌性开始 [4], 众多有关其 危害的研究陆续展开, 在 1974 年 EC 被国际癌症研 究机构 ( IARC) 列为 2B 级致癌物 ( 人类可能致癌 物 ) 此后, 有证据显示 EC 能够直接导致人类产生 肝癌 [5], 在 2007 年,EC 致癌等级被提升至 2A 级 从食品中摄入的 EC, 除了大部分被水解和少部分直 接排出之外, 其致癌性主要由 EC 被线粒体中的细 胞色素 P450 通过 N 羟基化和侧链氧化形成 N 羟 基氨基甲酸乙酯和乙烯基氨基甲酸乙酯导致的 2005 年, 联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品 添加剂联合专家委员会 (JECFA) 对 EC 摄入进行安 全评估, 认为日常饮食中摄入的 EC 为 15 ng / ( kg bw d), 低于基准摄入量下限 0 3 mg / ( kg bw d), 但该评估结果不包括酒精饮料, 因此评估风险较 [6] 低 但 Schlatte 等认为, 假定人一生患癌风险为 10-6, 摄入 EC 含量在 20 ~ 80 ng / ( kg bw d) 是安全 的, 以此计算, 人类暴露 EC 中风险依然较高, 尤其 是在饮酒人群中 [7-8] 目前, 针对食品中 EC 的研究 主要集中在致癌风险 含量检测 形成原因和控制 方法 4 个方面 ( 图 1) Fig 1 图 1 发酵食品中 EC 的主要研究内容 Recent researches on EC in fermentation foods 1 发酵食品中 EC 含量 EC 是发酵食品生产过程中自发产生的一种有 害物, 在酒类 酱油 豆瓣酱和泡菜等发酵酒类和食 品中均有检出 [9-11], 甚至在一些面包和香烟中也有 检出 [12] 表 1 为近年来国内外报道的一些发酵食 品中 EC 的污染情况 从表 1 中可以看出, 除了啤 酒以外, 酒类中 EC 含量普遍高于其他发酵食品, 国 内黄酒和米酒中 EC 含量要显著高于其他酒类 而 在其他国家, 蒸馏酒和烈酒中 EC 含量更高 参考 世界各国对酒中 EC 标准限量的最严格值 ( 葡萄酒 15 μg / L, 白兰地 1 000 μg / L, 蒸馏酒 150 μg / L, 烈酒 60 μg / L, 清酒 200 μg / L), 依然有大量酒类中 EC 含 量超标 此外, 在非酒类食品中, 酱油和红腐乳中 EC 含量要显著高于其他食品, 鉴于部分亚洲国家生 产和食用酱油量较大 [13], 酱油在某些人群中可能成 为日常摄入 EC 的主要食物 [14], 值得关注 2 发酵食品中 EC 主要形成原因和控制方法 目前针对发酵食品中 EC 的形成已经有了较为 确定的描述, 主要认为由乙醇和氨甲酰化合物发生 醇解反应生成, 发酵食品中的氨甲酰化合物主要有 尿素 瓜氨酸 氨甲酰磷酸和焦碳酸二乙酯等 此 外, 氰化物经过发酵转变成氰酸也能与乙醇反应形 成 EC, 而影响 EC 形成的环境因素主要有温度 催 化剂 ph 光照和贮藏时间 由于焦碳酸二乙酯主 要由外源添加, 已有证据显示其与酒精能反应形成 EC [15], 目前在葡萄酒酿造过程中已基本不再使用 氨甲酰磷酸主要通过酵母中氨甲酰磷酸合酶和细 菌精氨酸脱亚氨基途径产生, 一般不被释放到细胞 外, 因此大多数情况下被忽略 2 1 前体物质 乙醇是 EC 形成的主要前体物质之一, 所有的 氨甲酰化合物只有在乙醇存在下才能转化成 EC 在大多数 EC 含量高的酒类中, 酒精度数一般高于 8%, 有些能够达到 60% 甚至更高, 因此, 在这些发 酵食品中, 乙醇不再是 EC 形成的制约因素 而另 一些发酵食品, 如酱油 豆瓣酱和面包等, 乙醇只 是发酵副产物, 一般含量在 2% 以下, 而其他前体 物质如瓜氨酸能达到 2 000 mg / L 尿素约为 50 mg / L, 此时乙醇成为 EC 最重要的前体 [15], 在高盐 稀态发酵酱油中, 酒精与 EC 含量成显著正相 关 [27] 此外, 在氨基甲酸乙酯的合成中也明确发 现, 乙醇和尿素的配比随着浓度的提高而增大, 同 时也逐渐变缓 [28] 然而在发酵食品中, 乙醇要么 是酒类饮料的主要成分, 要么对发酵食品风味有 强烈影响, 难以通过降低乙醇含量来达到降低 EC 的目的 尿素是大部分发酵酒类中最主要的前体物 质 [29-30], 也是被研究最为深入和透彻的影响因素之 一 一定浓度的尿素和发酵产生的乙醇在偏酸性 条件下反应生成 EC, 尿素主要来源于酿酒酵母的尿
第 2 期周凯等 : 发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机理和快速检测方法研究进展 33 Table 1 表 1 各种发酵食品中氨基甲酸乙酯含量调查 Survey of EC content in fermentation foods and alcohol beverages 国家 / 地区年份食品种类平均值含量范围文献 发酵红豆 - (150~ 650) μg / kg 中国香港 2007 2008 黄酒 - (140~ 390) μg / L 腌制蔬菜 - (ND~ 10) μg / kg 红茶 - (ND~ 15) μg / L 葡萄酒 14 7 μg / L (ND~ 44 5) μg / L 中国 2010 蒸馏酒 33 8 μg / L (2 9~ 129) μg / L 酱油 8 7 μg / L (ND~ 63 3) μg / L 米酒 160 μg / L (8-515) μg / L 白酒 72 μg / L (12~ 192) μg / L 中国 2011 酱油 22 μg / L (8~ 108) μg / L 醋 11 μg / L (2~ 51) μg / L 红腐乳 182 μg / L (87~ 344) μg / kg 米酒 24 9 μg / L - 中国 2013 酱油 2 2 μg / L - 白酒 36 9 μg / L - 葡萄酒 12 0 μg / L - 酱油 38 μg / L (ND~ 93) μg / L 方便面料包 8 9 μg / kg (ND-49) μg / kg 中国 2014 米酒 197 μg / L (13~ 575) μg / L 葡萄酒 18 μg / L (8~ 46) μg / L 啤酒 咖哩 西红柿和沙拉酱 <2 μg / L(μg / kg) (ND~ 8) μg / L( μg / L / kg) 浓香型白酒 32 2 μg / L - 清香型白酒 14 7 μg / L - 中国 2015 酱香型白酒 25 3 μg / L - 米香型白酒 35 0 μg / L - 兼香型白酒 45 0 μg / L - 红酒 57 34 μg / L (32 14~ 94 18) μg / L 中国 2015 中国白酒 54 43 μg / L (27 52~ 66 48) μg / L 黄酒 100 63 μg / L (15 8~ 236 91) μg / L 葡萄酒 - (ND~ 164) μg / L 强化酒 - (ND~ 60) μg / L 英国 2004 烈酒 - (ND~ 6 131) μg / L 酱油 - (ND~ 10) μg / L 醋 - (ND~ 33) μg / L 啤酒 起司 豆瓣酱 酸奶 - ND 韩国 2008 2013 发酵食品 - (ND~ 18 8) μg / L 酒精饮料 - (ND~ 166 5) μg / L 西班牙 2004 西班牙红酒 10 431 μg / L (ND~ 23 5) μg / L 日本 2010 酒 12 μg / L (20~ 330) μg / L 巴西 2007 2012 甘蔗酒 - (10~ 930) μg / L 注 : - 表示文献未涉及, ND 表示含量在检测限以下 [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [14] [24] [25] [26] 素循环和原料, 部分尿素在无偏好型氮源存在下被 水解利用, 但在氮阻遏效应调控下, 尿素水解酶表 达受到抑制, 从而造成尿素的积累, 通过主动运输 释放到细胞外 降低尿素含量的方法主要有 3 种
３４ 生 物 加 工 过 程 第 １６ 卷 ①通过定向选育 诱变育种或杂交育种等方式筛选 素含量 ９ ３９ 定向改造现有酿酒酵母 主要分为两类 一类是直 要前体之一 发酵液中含量可达 ２ ０００ ｍｇ Ｌ 瓜氨 低产尿素的酿酒酵母 ３１ ３２ ②通过基因工程手段 接通过改造尿素代谢和运输相关基因来实现 如将 编码精氨酸酶的 ＣＡＲ１ 基因敲除 从而切断精氨酸 转化成鸟氨酸和尿素 ３３ ３５ 但该方法容易造成原料 精氨酸 浪 费 又 或 者 过 表 达 尿 酰 胺 酶 编 码 基 因 ＤＵＲ１ ２ ３６ 和尿素运转蛋白编码基因 ＤＵＲ３ ３７ 从 瓜氨酸被证明是某些酒类 ４０ ４１ 和酱油 ２７ 的主 酸是一种非蛋白质氨基酸 发酵液中的乳酸菌能够 通过精氨酸脱亚氨基途径 ＡＤＩ 将精氨酸转变成瓜 氨酸 并 通 过 主 动 运 输 释 放 到 环 境 中 有 研 究 证 实 环境因素 ｐｈ 盐胁迫等 是导致乳酸菌 ａｒｃａ 和 ａｒｃｂ 转录水平不等比例下降 从而导致瓜氨酸积累 而加速尿素分解或将环境中的尿素吸收 但两者共 的主要原因 ４２ 图 ２ ｂ 而瓜氨酸的释放与菌株 通过代谢调控影响尿素代谢相关基因表达 此类调 化导致的精氨酸和鸟氨酸的变化 这种区别并未给 同实施并未显示协同效果 ３８ 图 ２ ａ 另一类是 控因子较多 赵鑫悦 ２９ 将磷酸化调控因子 Ｇｌｎ３ｐ 和 Ｇａｔ１ｐ 共表达的基因工程菌株酿酒酵母 Ｎ８５ 应用于 黄酒发酵 尿素含量降低了 ６３ 且发酵特性变化 很小 ③直接向发酵液中添加酸性脲酶以降低尿 图２ Ｆｉｇ ２ 两种代谢工程技术抑制尿素积累 ａ ３０ 的细胞通透性变化紧密相关 ３０ 然而细胞通透性变 予充分说明 目前 筛选瓜氨酸利用菌株并接种至 发酵液中是降低瓜氨酸含量最有效的方法 但对于 如何干扰高产瓜氨酸的魏斯氏菌和葡萄球菌等积 累瓜氨酸 并未过多探讨 和盐胁迫对乳酸片球菌 ＡＤＩ 途径的调节 ｂ １５ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｕｒｅａ ａ ａｎｄ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ＮａＣｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＡＤＩ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｂ 氰化物是果酒 ４３ ４４ 和蒸馏酒 ２１ 中最主要的前 解反应需要在偏酸性 ｐｈ 条件下形成 但是由于同 物主要是异氰酸 而且该反应速率常数与乙醇和氰 前研究较少 值得注意的是 前体之一的氰化物形 体物质 目前已经证实与酒精反应生成 ＥＣ 的氰化 化物浓度无关 随着温度的升高而增加 随着 ｐｈ 的 升高而降低 ４４ 异氰酸主要由发酵原料中的生氰 糖苷水解生成的氰酸异构化产生 受环境 ｐｈ 和温 度影响最大 由于氰酸和 ＥＣ 沸点差异 在蒸馏过 类食品中 ｐｈ 变化较小 故对 ＥＣ 形成影响较小 目 成需要经过水解等步骤转化才能与乙醇反应 这个 过程中 氧气和金属离子催化剂对 ＥＣ 含量影响很 大 ４７ ４８ 尤其是 Ｃｕ ２ 与氰酸形成的中间体更容易 与乙醇反应形成 ＥＣ 因此 在氰酸为主要 ＥＣ 前体 成的 ＥＣ 去除 物质的果酒蒸馏酒中 选择合适的蒸馏器皿是降低 ＥＣ 的有效方法 而在尿素与乙醇反应中 ＺｎＣｌ ２ 的影 温度几乎是所有前体物质反应形成 ＥＣ 最重要 的影响因素 不同发酵温度 ４３ 灭菌温度 ４５ 和蒸 馏温度 ２１ 均与 ＥＣ 含量成显著正相关 在预测 ＥＣ 际效果有限 ４７ 从化学反应角度来说 多羟基的酚类 程中可通过 掐头去尾 的方式将大部分氰酸和生 ２ ２ 环境因素 生成模型中 需要区分不同的加工贮藏温度 ４６ 醇 响更大 ２８ 在食品发酵过程中 金属离子浓度变化 不大 ２７ 故对 ＥＣ 形成的影响有限 此外 某些抗氧 化剂比如焦亚硫酸钾的添加能够降低 ＥＣ 含量 但实 抗氧化剂能够与乙醇竞争发生醇解反应 从而降低
第 2 期周凯等 : 发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机理和快速检测方法研究进展 35 EC 含量 总的来说, 降低加工温度 O 2 含量 金属离 子催化剂以及适当的 ph 能够控制发酵食品中 EC 含 [49] [50] 量 直接添加 EC 降解酶或者利用吸附材料除 去 EC 也是可取的方法, 但是存在降解酶不耐酸和酒 精 吸附材料对风味有影响且效率低等问题 3 检测方法 由于发酵食品中 EC 含量较低且基质干扰较 多, 合适的检测方法对于评估和控制 EC 的污染水 平十分必要 对于检测方法来说, 灵敏度 可靠性 和精密度需要严格考量, 甚至在某些时候检测的经 济性和操作的方便性也是选择的重要依据 3 1 色谱检测 气相色谱质谱联用 ( GC -MS) 是检测 EC 的主 要方法, 也是许多组织机构和政府部门设立的检测 方法 使用 d 5 -EC 作为内标, 样品经过处理后通过 GC-MS 测定在各种食品和不同实验室中均呈现良 好的重复性和回收率 [19,51], 由于不同食品杂质干扰 不同, 导致前处理各异, 不同样品之间检测限差异 较大, 基本在 1 ~ 20 μg / L 之间, 回收率为 90% ~ 110%, 相对标准偏差 ( RSD) 低于 15%( 表 2), 可靠 性良好 为了降低检测限, 更好地排除基质干扰, 分辨特征离子, 三重串联四级杆质谱法 ( GC MS / MS) 能够更好地用于低含量 EC 的检测 [20], 液质联 用 (HPLC MS / MS) 方法能够大幅缩短检测所需时 间并避开气相色谱需要严格限制水分的要求, 检出 限更低的同时, 能够保证良好的稳定性, 最低检测 时间可在 6 min 之内, 但对于不同检测对象, 离子化 方式 ( ESI 和 APCI) 上选择不同 [12,22] [52] Deák 等 选择在检测之前用 9 占吨醇将 EC 衍生, 发现电离 后更倾向于生成 [M+Na] +, 更容易定量且稳定性良 好, 但显著延长了前处理时间和检测时间 虽然基 本上所有的色谱质谱联用检测技术都能够很好地 分离 EC 并精确定量, 然而对于大部分发酵食品生 产的中小企业和基层检测单位来说, 即使具备这些 大型检测仪器也缺乏相应操作人才 而液相色谱 的应用则非常普及, 采用高效液相色谱结合荧光检 测器 (HPLC 与 9 FLD) 检测 EC, 进样前在酸性条件下 占吨醇衍生, 通过优化衍生条件 激发与发射 波长 流动相在某些样品中检测限甚至能低于 5 μg / kg 然而, 这种方法还具有一些缺陷 : 首先对于 酒精含量较高的酒类, 乙醇会干扰衍生反应, 甚至 在衍生时进一步形成 EC 造成误差, 因此需要对样 品进行稀释, 间接提高了定量限 其次, 在一些颜 色较深的发酵食品如腐乳和酱油中, 衍生前需要添 加一步除杂和富集的步骤, 直接延长了每个样品的检 测时间 ( 目前至少需要 60 min) [21] 此外, 由于衍生 剂 9 占吨醇与 EC 的反应是一个酸性条件的可逆反 应, 衍生后到检测这段时间也会对结果有影响, 衍生 产物在 230 nm 激发波长下有两个显著的发射波长, 308 和 600 nm, 不同样品的干扰效应不同, 需要确定 不同的发射波长 [27] 目前, 采用仪器方法检测 EC 的报道已经屡见 不鲜, 综述报道也不少 [31,53], 但是由于 EC 分子量太 低且分子特征不显著, 对 EC 的快速检测方法缺乏 系统和深入的分析 目前即将出台的黄酒中 EC 限 量 EC 快速筛查方法的推广, 前景广阔 3 2 3 2 1 快速检测 酶法 有机磷和一些带苯环或杂环氨基甲酸酯类农药 能够抑制乙酰胆碱酯酶的水解作用, 因此, 目前常用 酶抑制法对这一类物质进行快速检测 EC 分子也具 有氨基甲酸酯结构, 但其分子特征不显著, 对乙酰胆 碱酯酶的抑制作用不明显, 通过加入一些增敏试剂, 如 3% 的溴水 NaOH 溶液, 能够显著提高 EC 的抑制 作用, 在缓冲溶液中对 EC 的检出限可低至 41 77 μg / L [54] 酒类中乙醇本身对乙酰胆碱酯酶就具有强 烈的抑制作用, 采用溶剂萃取等前处理方法对酒中 EC 提取和净化, 乙酸乙酯的残留也会抑制酶活, 故不 适用于 EC 的实际样品检测, 但为此提供了一个思 路 : 如果采用某种方式对 EC 分子进行改造, 通过衍 生的方法使得衍生产物能够增强对乙酰胆碱酯酶的 抑制效果, 能够大大提高检测灵敏度和精密性 酶法检测目标分子的另一个思路是 : 采用水解 酶将目标分子水解后, 通过检测产物从而定量目标 物, 在与 EC 密切相关的精氨酸检测中有应用先 例 [55] 目前, 国内外筛选出来的 EC 降解酶已经有 数十种, 部分降解酶对乙醇的耐受度可达 20%, 仍 具有 50% 以上的酶活力 [49], 但是只有具备能够水解 EC 酰胺键生成 NH 3 分子, 且需要足够灵敏度的方 法检测水解后的氨分子的量才能进行精确定量 [56] 卢晓霞通过构建双酶体系的电化学传感器对模 拟黄酒中 EC 进行检测, 检测限低至 5 26 nmol / L, 精密度和稳定性良好 ( 图 3) 该方法只需在检测前 构建传感器, 并不需要对样品进行处理 不过目前 电化学传感器还未广泛用于实际样品检测, 且酶的
36 生物加工过程第 16 卷 特异性 ( 对尿素和氨基甲酸酯的同系物也有部分降 解作用 ) 也有待深入探讨 3 2 2 Fig 3 图 3 [56] 双酶传感器检测 EC 的原理 Schematic illustration of EC determination 薄层色谱法 薄层色谱法是一种不需要借助仪器手段可以 对样品进行分离和定性甚至定量的色谱分析技术 主要步骤包括展开剂的选择 点样 展开 显色和分 析, 通常包括计算比移值 ( R f ) 和确定斑点颜色深 浅 目前由于成像系统的改善并引入先进的数字 处理技术, 对 EC 的检测限甚至能达到 mg / L 甚至是 [57] μg / L 级别 Jaryj 等首先采用该方法分离烈酒中 的 EC, 随后在酸性环境下使分离的 EC 与肉桂醛在 高温下反应, 测定荧光范围为 445 ~ 460 nm, 该方法 [58] 定量范围为 320 μg / L ~ 8 1 mg / L 王浩采用同 样的方法, 通过简化成像系统和优化分离条件运用 于多种酒类检测中, 但是该方法回收率过低 检测 限过高, 基本只能用于 EC 含量超过 1 mg / L 的酒类 检测, 且通过简单的氮吹浓缩后, 由于糖类等黏性 物质的存在, 该方法不再适用, 而通过前处理净化 浓缩, 也大大延长了检测时间 3 2 3 光谱法 光谱法检测食品中污染物的主要优点在于简便 快速且能做到无损检测, 但难点在于如何找出其特征 光谱并建立模型去定量检测物, 通常还需要增强目标 物的信号 目前用于检测 EC 的光谱法主要有两种 : 表面增强拉曼光谱 (SERS) 和傅立叶红外变换光谱 (FT IR) 理论上 C O 和 NH 3 是 EC 分子的特征 结构, 在红外光谱中有特征吸收峰, 然而酒类复杂的 食品环境中, 这些吸收峰难以被区分 Lachenmeier [59] 利用同时确定 EC 和前体物质氢氰酸 的 FTIR 红外光谱结合偏最小二乘法用于果酒中 EC 的检测, 只需 2 min 就能够筛查出超过 0 8 mg / L EC 含量的果酒样品, 将筛查后的样品再用 GC MS 检 测, 将大大减少工作量 然而随着 EC 控制技术的发 展, 目前大部分食品中 EC 含量已经降至 1 mg / kg 以 [60] 下 杨丹婷对 SERS 检测 EC 进行了深入的研究, 首先确定了 C C 键与 SERS 与活性基底 Ag NPs 的 表面吸附最强, 归属于 C C 和 C H 的震动模式的 拉曼峰是 1 006 cm -1 随后建立了一种基于 Au@ Ag NPs 表面增强拉曼光谱技术的 EC 定量检测方法, 在 伏特加 白朗姆和果酒中检测限分别为 0 8 11 6 和 6 9 μg / L 该方法不需要前处理, 检测限范围较宽 (10-9 ~10-7 mol / L), 且线性不错 (R 2 [61] >0 8) Li 等 进一步筛选了 SERS 活性基底进行 EC 检测, 发现银 纳米星粒子效果最好, 对 EC 的检出限低至 1 37 10-9 [62] mol / L 同时,Du 等采用从头计算方法和离散偶 极子分配法研究 EC 的 SERS 增强检测机制, 发现 EC 与 Ag20 簇形成复合物是通过静电和化学键相互作 用, 二者共同作用增强因子可达 3 6 10-10 虽然 SERS 能够大大缩短 EC 的检测时间 简化测定步骤, 但是对于不同食品基质中增强物的筛选和合成以及 确定定量光谱值上还需要进行大量工作, 且定量光谱 值与 EC 浓度在线性相关性上依然有待于提高 3 2 4 免疫检测法 免疫检测是目前快速检测方法中普及率最高 的检测方法, 对于大分子毒素来说, 各种免疫检测 试纸条和试剂盒已经开发出来并开始在市场推广 然而对于小分子有害物而言, 由于分子量过小 分 子特征不明显, 难以直接制备特异性抗体, 因此需 要对 EC 分子进行改造, 制备 EC 衍生物的特异性抗 体, 通过检测前的快速衍生化, 实现对 EC 的快速 灵敏 低成本和可靠的检测 笔者所在实验室借鉴 液相色谱检测方法, 合成 EC 占吨醇半抗原, 其中 添加的羧酸手臂与占吨醇分子直接相连或间隔一 个碳原子 采用异源包被, 得到的抗体效价达 1 28 10 5, 在间接竞争法下,100 ng / ml 的 EC 占吨醇衍 生产物抑制率达 95%, 说明该方法得到的抗体针对 [63] 衍生产物有很强的特异性 Luo 等利用得到的 抗体建立了间接 ELISA 检测黄酒中的 EC 含量, 该 方法检测限低至 166 μg / L, 回收率在 84 4% ~ 100 9% 之间, 与 GC MS 所得的结果相符合图 4 (a) 但是该方法在检测前需要在酸性条件下进行 衍生, 且衍生率对检测有结果有显著影响, 在实际 检测时还需要经过大量测试 此外, 该方法检出限 高于目前蒸馏酒和葡萄酒中 EC 的限量, 目前已经通 过引入荧光硅纳米材料增敏的方法将检测限降低到 2 6 μg / L [64] 图 4(b) 但就目前而言, 针对 EC 免疫 检测的方法依然少之又少, 主要原因在于 EC 分子特 征不明显, 又不像丙烯酰胺一样能够通过 C C 键进 行衍生, 分子改造困难, 导致抗体特异性差
第 2 期周凯等 : 发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机理和快速检测方法研究进展 37 Fig 4 图 4 EC 间接免疫检测方法示意图 (a) [63] 和基于荧光硅纳米颗粒的增敏方法原理图 (b) [64] Schematic illustration of an indirection ELISA(a) and fluorescent silicon nanoparticles based ratiometric fluorescence immunoassay( b) for EC sensitive detection 目前, 几乎所有的 EC 快速检测方法均存在干扰因素较多 检测限过高 稳定性较低的特点, 尚未应用于实际检测, 而仪器分析方法也需要排除各种干扰因素, 因此样品前处理在目前的检测条件下依然必不可少 一般需要考察以下几个方面 :1 根据各国对食品中 EC 的限量标准以及发酵食品中 EC 的含量, 对葡萄酒 酱油 醋和腐乳中 EC 的分析方法的定量限应该低于 10 μg / kg, 对黄酒 蒸馏酒和白兰地等酒类来说, 方法的定量限应低于 100 μg / kg 而 3 3 色谱仪器分析检测和快速检测的比较 GC MS 和 HPLC MS / MS 等分析方法的定量限一 色谱仪器检测方法和快速检测方法对发酵食品中 EC 含量检测的比较如表 2 所示 通过对比仪器检测方法和快速检测方法在灵敏度 重复性 易用性以及价格和时间上的花费, 以决定在不同的食品种类和检测情形中采用何种检测方法 般在 1 ~ 10 μg / kg 之间, 能充分满足各种发酵食品中 EC 的检测要求, 有针对性地优化后的 HPLC FLD 也能满足绝大多数的检测场景 对于快速检测方法来说,SERS 检测和衍生后的免疫检测能基本满足黄酒和白兰地等限量要求较高的酒类 在 表 2 色谱仪器检测方法和快速检测方法对发酵食品中 EC 含量检测的应用 Table 2 Applications of chromatography instrument detection methods and rapid methods for detecting EC in fermentation foods 方法样品前处理 检测限 / (μg L -1 ) 定量限 / (μg L -1 ) 回收率 / % 相对标准偏差 / % 文献 GC MS 苹果汁玉米油烧酒牛奶米粥花生酱牛肉扁鱼裙带菜 低脂液体 :Chem Elut SPE column 净化低脂固体 : 水提后 SPE 净化高脂液体 : 通过 Hydromatrix 除脂后再净化高脂固体 : 水提后, 再除脂再净化 2 06 6 03 1 20 0 89 4 39 6 08 4 44 2 62 0 69 6 24 18 27 3 65 2 69 13 32 18 43 13 47 7 93 2 10 96 85~ 121 82 90 76~ 111 26 82 12~ 103 59 101 05~ 116 02 97 88~ 103 89 78 84~ 100 75 83 92~ 118 57 94 72~ 104 77 98 43~ 100 84 1 6~ 13 82 2 02~ 12 53 0 80~ 5 64 1 85~ 9 33 4 58~ 11 12 1 79~ 11 84 7 80~ 13 10 2 28~ 5 22 0 75~ 6 57 [51] 米酒白酒葡萄酒酱油 硅藻土固相萃取柱 - a 5 0 96~ 103 99~ 107 98~ 111 99~ 103 1 8~ 9 6 1 8~ 9 0 1 2~ 9 0 1 5~ 9 2 [19] 法国面包德国泡菜豆腐乳 选择性加压液相萃取 0 3 1 0 98~ 107 低于 7% [10]
38 生物加工过程第 16 卷 续表 2 方法样品前处理 检测限 / (μg L -1 ) 定量限 / (μg L -1 ) 回收率 / % 相对标准偏差 / % 文献 烟草制品 0 1% 甲酸溶液提取并超声, 通过 Strata X cartridge 净化 0 8~ 63 2 5~ 210 b 45~ 80 低于 10% [12] HPLC MS / MS 水果白兰地与 9 吨氢醇衍生 2 0~ 2 8 5 1~ 8 0 高于 97 [52] 红葡萄酒 中国白酒和黄酒 蒸馏水稀释 1 8 4 0 98 58~ 110 71 0 8~ 1 9 [22] GC MS / MS 核果酒 顶空固相微萃取 30 110 3 8~ 8 2 [65] 酱油 米酒 方便 面调料包和 Na 2 SO 4 PSA 和硅藻土 1 8 4 7 91 7~ 112 4 4~ 10 2 [20] 番茄酱 HPLC FLD 中国白酒稀释后与 9 吨氢醇衍生 1 82 5 34 85 8~ 102 5 1 75~ 6 59 [21] 酱油 红葡萄酒 白兰地和黄酒 液液萃取后与 9 氢醇衍生 吨 3 91 13 03 65 4~ 95 4 0 8~ 8 9 [27] 稀释后与 9 吨氢醇衍生 4 8 16 90 7~ 104 8 1 0~ 4 8 [66] ELISA 中国黄酒与 9 吨氢醇衍生 16 6 FTIR 果酒无 SERS 红星二锅头 与银纳米粒子混合 800 μg / L ( 作为临界标准则 ) 1 37 10-9 mol / L 18 3~ 488 2 84 4~ 100 9 8 2~ 9 5 [63] 85~ 91; 77~ 85 c - [59] - 96 8~ 107 6 - [61] 水溶液与银纳米粒子混合 17 8 - - - [67] 伏特加啤酒朗姆酒 与金和银纳米颗粒混合 0 8 11 6 6 9 - - - - - [68] 薄层色谱法酒无 595-60 12~ 84 70 9 7 [58] 酶抑制法低端酒与对二甲基苯甲醛反应 1 436 10 4 - - 双酶传感器法 黄酒 双酶偶联反应体系溶胶凝胶体系 9 28 nmol / L 5 26 nmol / L - - 95 54~ 100 01 100 19~ 103 79 注 :a 表示未提及 ;b 表示根据不同的香烟和干湿状态,c 表示 85% ~ 91% 的校正集, 而 77% ~ 85% 为验证集 5%(1 12~ 1 25) <5%(24 11) [54] 1 634~ 4 611 2 86~ 7 14 [56] 没有富集步骤的前提下, 直接免疫检测和酶法检测基本不能满足检测要求 这是限制目前快速检测 EC 方法的最重要因素 2 大部分的色谱仪器检测方法能够检测绝大多数发酵食品, 适用于绝大多数使用场景, 且回收率基本在 80% ~ 120% 之间, 标准偏差低于 10%, 甚至有些低于 5% 而大部分 EC 快速检测方法缺乏足够的数据, 需要进一步评估, 免疫检测和薄层色谱法只针对一种酒类的相对标准偏差就接近于 10%, 这是确保 EC 检测方法用于实际检测场景急需克服的难题 3 一般而言, 色谱仪器检测方法需要经过 SPE 净化后上样检测, 或者经 过衍生以确保方法的高灵敏性, 但是大部分快速检测方法不需要富集和纯化步骤, 平均一个样品的检测时间均低于 20 min, 且花费更少 在目前条件下, 很难做到不对样品进行任何处理的实时在线检测 发展 EC 快速检测方法, 对于监测发酵食品中 EC 含量有重要意义, 同时有助于了解生产过程中的 EC 含量检测, 便于更好地控制发酵食品中 EC 水平 4 结论与展望 目前, 随着对发酵食品中 EC 形成机理更深入的了解, 提出了越来越多的 EC 含量控制方法, 然而
第 2 期周凯等 : 发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机理和快速检测方法研究进展 39 能够用于实际生产的措施依然很少, 酒中的 EC 含量高于国际标准的现象时有发生 因此, 应该综合考虑不同发酵食品中主要的 EC 前体物质与环境因素对 EC 形成的影响, 在研究控制 EC 含量方法时与实际生产过程紧密结合, 并进行验证 利用基因工程方法改造初始发酵菌株如敲除酿酒酵母中编码精氨酸酶的 CAR1 基因需要慎重考虑, 而调控酵母的氮代谢途径从而降低尿素积累的方法还应在实际发酵环境中作进一步验证 同时, 在发酵食品分离能够大量消耗 EC 前体物质又不显著改变发酵风味的菌株应用于同种发酵食品中 [69], 对于降低该发酵食品中 EC 含量应用前景广阔, 调整生产工艺和贮藏环境仍然是目前主要控制措施 对于 EC 检测方法,GC MS 作为标准检测方法具有灵敏度高 选择性好和稳定性强等特点, 而 GC MS / MS 和 HPLC MS / MS 能某种程度上降低检测限并具有更好的选择性, 甚至能简化前处理过程, 面对在线检测的要求以及大量样品需要筛查的情况下, 便宜和操作简便的快速 EC 检测方法更具优势, 更能满足企业 监管机构甚至是消费者的要求 然而, 目前迫切需要提高快速检测方法的灵敏度和重复性, 并简化前处理步骤, 针对不同的快速检测方法的缺点, 努力方向不同 : 酶抑制法 薄层色谱法和 FTIR 法检测限最高 ;SERS 法在增强物的筛选和定量过程上还需要深入研究 ; 由于能够同时检测大量样品,ELISA 检测法前景广阔, 但衍生步骤延长了检测时间, 迫切需要制备出更具 EC 特异性的抗体并研究 EC 直接检测的 ELISA 法 这些快速检测方法和含量控制方法的发展, 对于实时监测并降低发酵食品 EC 水平, 降低 EC 致癌风险具有重要意义 参考文献 : [ 1 ] NOMURA T. Urethan( ethyl carbamate) as a cosolvent of drugs commonly used parenterally in humans[ J].Cancer Res,1975,35 (10):2895 2899. [ 2 ] JOHNSON R,FOWLER J,ZANELLL G.Changes in mouse blood pressure, tumor blood flow, and core and tumor temperatures following nembutal or urethane anesthesia[ J]. Radiology,1976, 118(3):697 703. [ 3 ] HIRSCHBOECK J S, LINDERT M, CHASE J, et al. Effects of urethane in the treatment of leukemia and metastatic malignant tumors[ J].J Am Med Assoc,1948,136(2):90 95. [ 4 ] NETTLESHIP A, HENSHAW P S, MEYER H L. Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate( urethane) [ J]. Pediatr Int,1943,52(3):290 295. [ 5 ] CADRANEL J,LEGENDRE C,DESAINT B,et al. Liver disease from surreptitious administration of urethane [ J ]. J Clin Gastroenterol,1993,17(1):52 56. [ 6 ] SCHLATTER J,LUTZ W K. The carcinogenic potential of ethyl carbamate( urethane):risk assessment at human dietary exposure levels[ J].Food Chem Toxicol,1990,28(3):205 211. [ 7 ] CHEN D,REN Y,ZHONG Q,et al. Ethyl carbamate in alcoholic beverages from China:levels,dietary intake,and risk assessment [ J].Food Control,2017,72:283 288. [ 8 ] LACHENMEIER D W,LIMA M C N,BREGA I C,et al.cancer risk assessment of ethyl carbamate in alcoholic beverages from Brazil with special consideration to the spirits cachaça and tiquira [ J].BMC Cancer,2010,10(1):266 281. [ 9 ] KIM Y G, LYU J, KIM M K, et al. Effect of citrulline, urea, ethanol, and urease on the formation of ethyl carbamate in soybean paste model system[ J].Food Chem,2015,189:74 79. [10] LIAO Q G, LUO L G. Fast and selective pressurized liquid extraction with simultaneous in cell cleanup for the analysis of ethyl carbamate in fermented solid foods [ J]. Chromatographia, 2014,77(13 / 14):963 967. [11] LEE K G. Analysis and risk assessment of ethyl carbamate in various fermented foods [ J]. Eur Food Res Technol, 2013, 236 (5):891 898. [12] STEPAN H,PANI J,PUMMER S,et al. Sensitive Determination of ethyl carbamate in smokeless tobacco products and cigarette smoke using SPE and HPLC APCI MS / MS [ J ]. Chromatographia,2015,78(9 / 10):675 681. [13] LEE B Q, KHOR S M. 3 Chloropropane 1,2 diol ( 3 MCPD) in soy sauce:a review on the formation,reduction and detection of this potential carcinogen [ J]. Compr Rev Food Sci F,2015, 14 (1):48 66. [14] CHOI B,RYU D,KIM C,et al. Probabilistic dietary exposure to ethyl carbamate from fermented foods and alcoholic beverages in the Korean population[ J].Food Addit Contam,2017,Doi.org / 10. 1080 / 19440049.2017.1364433. [15] ZHANG J, FANG F, CHEN J, et al. The arginine deiminase pathway of koji bacteria is involved in ethyl carbamate precursor production in soy sauce[ J].FEMS Microbiol Lett,2014,358(1): 91 97. [16] TANG A S P,CHUNG S W C,KWONG K,et al.ethyl carbamate in fermented foods and beverages: dietary exposure of the Hong Kong population in 2007 2008[ J]. Food Addit Contam,2011,4 (3):195 204. [17] LIU Y,DONG B,QIN Z,et al.ethyl carbamate levels in wine and spirits from markets in Hebei Province, China [ J]. Food Addit Contam,2011,4(1):1 5. [18] WU P,PAN X,WANG L,et al. A survey of ethyl carbamate in fermented foods and beverages from Zhejiang, China [ J]. Food Control,2012,23(1):286 288. [19] HUANG Z,PAN X D,WU P G et al. Validation ( in house and
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