咨询电话 :400 666 3029 Fasta-II 快速定点突变试剂盒 使用说明 一 产品概述本试剂盒是 Fasta 快速定点突变试剂盒的升级版, 采用同源重组的原理, 用 PCR 手段将目标质粒从待突变位点反向扩增, 其产物经重组环化后直接转化即可完成定点突变 与原 Fasta 试剂盒相比具有以下优势 : 1. 升级了原有的高保真酶, 采用新型的 2 Fasta-II Mix 高保真扩增体系, 扩增速 度比原有酶快了一倍 (15s/kb) 且降低了扩增过程中引入新突变的可能性 2. 酶 buffer dntp 均整合到 2 Fasta-II Mix 里,PCR 体系只需要加引物和模板 3. 长片段扩增能力卓越, 可以广泛适用于长度不超过 20kb 的任何质粒扩增 4. 省略了 Dpn 酶消化的步骤, 节省 1h 时间 PCR 扩增产物对模板的数量优势已 足够保证突变成功率 5. 大多数情况下 PCR 产物无需纯化即可直接做下一步重组反应 由于使用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环或连接成环, 因此使用本试剂 盒进行定点突变不但引物设计灵活, 还可以同时突变距离较远的两个点 二 产品组成 (15 次反应 ) 2 Fasta-II Mix:375ul 5 Fasta-II Recombination Buffer:30ul Fasta-II Recombination Enzyme: 15ul 三 贮藏与保质期 本产品应置于 -20 储存, 保质期一年 四 单碱基或连续多碱基定点突变实验方案
图 1 实验流程概况 4.1 引物设计向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变, 只需设计一对引物将质粒进行反向 PCR 扩增即可 引物设计原则为 : (1) 正 反向扩增引物 5 端包含 15-21 bp 反向互补区域,GC 含量 40-60% 为佳
(2) 各引物非互补区域长度至少为 15 bp (3) 待突变位点至引物 3 端区域 Tm 值高于 60 为佳 (4) 需要引入突变的位点首选使其包含在互补区域内, 即两条引物均引入点突变 (5) 若待突变点附近序列很难满足 GC 含量 40-60% 的要求, 则也可以将待突变点包含在任意一条引物的非互补区域, 即只在一条引物上引入点突变 (6) 请勿将突变位点置于引物 3 末端 以向 puc18 引入单碱基突变为例, 引物设计具体方案如下图所示 : 图 2 向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变引物设计示意图 注意 : 计算引物 Tm 值时, 应计算待突变位点至引物 3 端这一区域内的碱基, 调整引物长度 使这一段 Tm 值高于 60, 待突变位点至引物 5 端区域内的碱基不应参与计算 4.2 目标质粒扩增 使用 2 Fasta-II Mix 对目标质粒进行扩增 反应各组分解冻后请充分摇匀, 使用完毕 后及时放回 -20 推荐反应体系如下 : 2 Fasta-II Mix:25ul Template plasmid DNA:1~5 ng Primer_1(10μM):2ul Primer_2(10μM):2ul ddh20:up to 50ul 请勿使用带有尿嘧啶的引物或模板 在质粒能正常扩增的前提下, 应尽量减少使用量, 推荐使用 1 ng 新鲜提取的质粒作模板
体系配制完成后进行扩增反应, 推荐 PCR 反应条件 : 温度 时间 循环数 95 30s 1 95 15s 60~72 15s 25 72 15s/kb 72 5min 1 4 hold 1 对于大多数质粒, 变性温度使用 95 即可 2 Fasta-II Mix 能够促进模板和引物高效退火 一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值即可 如果需要, 可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度 退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 强烈建议扩增循环数 30 如果扩增效率良好的话, 推荐 25 个循环 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测 如目标质粒正确扩增, 则可进行下步实验 4.3 重组反应正反向扩增引物 5 端包含完全反向互补的一段序列, 因此在 Fasta-II Recombination Enzyme 催化下扩增产物 5 末端和 3 末端可以发生同源重组, 完成扩增产物环化过程 于冰水浴中, 将下列组分依次加到无菌的 PCR 管的管底 如果不慎将液体粘在管壁, 请务必通过短暂离心使其沉入管底 5 Fasta-II Recombination Buffer: 2ul Fasta-II Recombination Enzyme: 1ul 扩增产物 : 25~200ng ddh2o: up to 10ul Fasta-II Recombination Enzyme 单点突变重组反应体系最适 DNA 使用量为 0.015 pmol 该摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : 扩增产物最适使用量 = [0.01 目标质粒碱基对数 ] ng (0.015pmol) 例如, 向长度为 5 kb 的目标质粒引入单点突变, 扩增产物最适使用量应为 :0.01 5000 = 50ng 注意 :DNA 量太多或者太少都将降低环化效率 请务必通过琼脂糖电泳预先确认 DNA 浓度, 尽量严格按照推荐量配制反应体系 当扩增产物最适使用量计算值不足 25ng 或者超过 200ng 时, 反应时加入 25ng 或 200ng 即可 扩增产物不纯化直接用于重组反应时, 使用量不应超过反应总体积的 1/5, 即 2μl 体系配制完成后, 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分, 避免产生气泡 ( 请勿剧烈震荡或者涡旋混匀 ) 置于 37 反应 30 min 待反应完成后, 立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min 之后, 反应产物可直接进行转化 ; 也可储存于
-20, 待需要时解冻转化 若扩增产物浓度较低或拖尾 杂带严重, 请切胶纯化后再进行重组反应 4.4 反应产物转化 涂板 克隆鉴定取 5μl 冷却反应液, 加入到 100μl 感受态细胞中, 轻弹管壁数下混匀, 于冰浴放置 30 min 42 热激 30~90 秒, 冰水浴孵育 2min 加入 500 μ l SOC 或 LB 培养基, 37 缓慢摇菌 45min-1h 取 20~100μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上 将平板倒置,37 过夜培养 注意 : 推荐使用转化效率 >10 8 cfu/μg 的感受态细胞 如果感受态转化效率 <10 8 cfu/μg( 例如用 CaCl2 法新鲜制备的感受态转化效率通常在 10 6-10 7 cfu/μg 之间 ), 请将培养菌液在 5000rpm 离心 3min 收集菌体, 用 100μl LB 培养基重悬后全部涂板 五 距离较远不连续双碱基定点突变实验方案本试剂盒可以对距离较远的不连续两个碱基同时进行突变, 而所谓 距离较远 的标准是 : 两个碱基之间的最短距离大于质粒全长的 1/11 ( 见右图 ) 5.1 引物设计向质粒两个不连续位点引入定点突变, 只需设计两对引物将质粒分为两段进行扩增即可 引物设计基本原则为 : (1) 在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩引物对 每对正反向引物 5 端包含 15-21bp 反向互补区域,GC 含量 40% - 60% 为佳 (2) 各引物非互补区域长度至少为 15 bp (3) 待突变位点至引物 3 端区域 Tm 值图 3 双点突变实验流程概况高于 60 为佳 (4) 需要引入突变的点首选包含在互补区域内, 即两条引物均引入点突变 (5) 若待突变点附近序列很难满足 GC 含量 40%-60% 的要求, 则也可以将待突变点包含在任意一条引物的非互补区域, 即只在一条引物上引入点突变 (6) 请勿将突变位点置于引物 3 末端 以向 puc18 引入双碱基突变为例, 引物设计具体方案如图 4 所示 :
图 4 向质粒引入不连续双碱基定点突变引物设计示意图 注意 : 计算引物 Tm 值时, 应计算待突变位点至引物 3 端这一区域内的碱基, 调整引物 长度使这一段 Tm 值高于 60, 待突变位点至引物 5 端区域内的碱基不应参与计算 5.2 目标质粒分段扩增使用 2 Fasta-II Mix 对 AB 段和 BA 段分别进行扩增 AB 段扩增引物对为 : 待突变位点 A 正向扩增引物和待突变位点 B 反向扩增引物 ;BA 段扩增引物对为 : 待突变位点 B 正向扩增引物和待突变位点 A 反向扩增引物 反应各组分解冻后请充分摇匀, 使用完毕后及时放回 -20 推荐反应体系如下: 2 Fasta-II Mix:25ul Template plasmid DNA:1~5 ng Primer_1(10μM):2ul Primer_2(10μM):2ul ddh20:up to 50ul 请勿使用带有尿嘧啶的引物或模板 在质粒能正常扩增的前提下, 应尽量减少使用量, 推荐使用 1 ng 新鲜提取的质粒作模板 体系配制完成后进行扩增反应, 推荐 PCR 反应条件 : 温度 时间 循环数 95 30s 1 95 15s 60~72 15s 25 72 15s/kb 72 5min 1
4 hold 1 对于大多数质粒, 变性温度使用 95 即可 2 Fasta-II Mix 能够促进模板和引物高效退火 一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值即可 如果需要, 可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度 退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 强烈建议扩增循环数 30 如果扩增效率良好的话, 推荐 25 个循环 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测 如目标质粒片段正确扩增, 产物条带单一, 则可进行下步实验 若扩增产物非特异, 则应切胶回收纯化后再进行下一步实验 5.3 重组反应 AB 段和 BA 段扩增产物末端分别包含完全一致的一段序列, 因此在 Fasta-II Recombination Enzyme 催化下两扩增产物末端可以分别发生同源重组, 完成环化过程 于冰水浴中, 将下列组分依次加到无菌的 PCR 管的管底 如果不慎将液体粘在管壁, 请务必通过短暂离心使其沉入管底 5 Fasta-II Recombination Buffer: 2ul Fasta-II Recombination Enzyme: 1ul AB 段扩增产物 : 10~100ng BA 段扩增产物 : 10~100ng ddh2o: up to 10ul Fasta-II Recombination Enzyme 双点突变重组反应体系最适 DNA 使用量为 : 较长片段 0.015 pmol, 较短片段 0.03 pmol 这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : 较长片段扩增产物使用量 = [0.01 片段碱基对数 ] ng (0.015 pmol) 较短片段扩增产物使用量 = [0.02 片段碱基对数 ] ng (0.03 pmol) 例如,AB 段长度为 1 kb,ba 段长度为 5 kb 则扩增产物最适使用量为 :AB 段 0.02 1000 =20 ng;ba 段 0.01 5000 = 50 ng 注意 :DNA 量太多或者太少都将降低环化效率 因此请务必通过琼脂糖电泳预先确认 DNA 浓度, 尽量严格按照推荐量配制反应体系 当扩增产物最适使用量计算值不足 10ng 或者超过 100ng 时, 加入 10ng 或 100ng 即可 扩增产物不纯化直接用于重组反应时, 总使用量不应超过反应体积的 1/5, 即 2 μl 体系配制完成后, 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分, 避免产生气泡 ( 请勿剧烈震荡或者涡旋混匀 ) 置于 37 反应 30 min 待反应完成后, 立即将反应管置于冰水浴中冷却 5min 之后, 反应产物可直接进行转化 ; 也可储存于 -20, 待需要时解冻转化 5.4 反应产物转化 涂板 克隆鉴定取 5μl 冷却反应液, 加入到 100μl 感受态细胞中, 轻弹管壁数下混匀, 于冰浴放置 30 min 42 热激 30~90 秒, 冰水浴孵育 2min 加入 500μl SOC 或 LB 培养基,37 缓慢摇菌 45min-1h 取 20~100μl 菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上 将平板倒置,37 过
夜培养 注意 : 推荐使用转化效率 >10 8 cfu/μg 的感受态细胞 如果感受态转化效率 <10 8 cfu/μ g( 例如用 CaCl2 法新鲜制备的感受态转化效率通常在 10 6-10 7 cfu/μg 之间 ), 请将培养菌液在 5000rpm 离心 3min 收集菌体, 用 100μl LB 培养基重悬后全部涂板 六 注意事项 下表列出了使用 Fasta-II 快速定点突变试剂盒进行 DNA 定点突变时主要注意事项 实验步骤 推荐做法 避免做法 引物反向互补区选择 尽量选择无重复序列且 GC 含量比较均匀的区域 当这一 选择带有重复序列, 或高 GC, 高 AT 区域 区域内的 GC 含量在 40%~60% 范围之内时, 重组环化效率达到最大 引物设计 按照图 2/4 所示设计引物 引物反向互补区域少于推荐长度或添加错误 质粒 PCR 扩增 进行高特异性扩增反应 扩增不特异, 杂带较多 PCR 模板质粒使用量 在不影响扩增产量的情况下 质粒模板使用过量 尽可能少的使用模板 PCR 模板质粒质量 长期放置 反复冻融会导致模板质粒断裂 开环或降解 因 使用长期放置 反复冻融过的质粒作为模板 此应使用新鲜制备的质粒作为模板 扩增产物是否纯化 扩增产物不特异时, 应进行胶回收纯化 扩增常务不特异, 未进行胶回收纯化 扩增产物定量 琼脂糖电泳检测 吸光度法检测 重组反应体系配制 在冰水浴中配制, 根据实际浓度, 按照重组反应最适 DNA 量及比例配制 扩增产物不纯化直接用于重组反应时, 使用 在室温下配制, 不考虑 DNA 浓度随意配制, 扩增产物直接用于重组时, 使用体积超过 2ul 总体积不超过反应体系总体积的 1/5(2ul) 进行重组反应 在温控比较精确的仪器内 (PCR 仪或水浴锅 ),37 反 反应温度偏离 37 太多, 反应时间不足或超过 30min 应 30min 终止重组反应 反应完毕后立即将反应管置 反应完毕后室温放置 于冰水浴中冷却 5min 转化 冷却后的反应产物在 1h 内进行转化, 转化之前应一直保持冰水浴低温 如需储存, 置于 -20 进行 冷却后的反应产物置于室温长时间放置后进行转化 ;4 长时间储存后进行转化
七 常见问题和解决方案 1. 质粒模板无法正常扩增 (1) 引物设计有误 : 核对引物设计方案 (2) 扩增体系配制错误 : 重复实验 (3) 扩增反应条件不优化 : 调整 Mg 2+ 浓度 酶量 扩增程序 (4) 模板质粒质量偏差 : 长期放置 反复冻融会导致模板质粒断裂 开环或降解, 应使用新鲜制备的质粒作为模板 2. 平板上长不出克隆或克隆数目很少 (1) 感受态效率低 : 使用新制备或妥善冻存的感受态细胞, 确保转化效率 >10 7 cfu/μg 每次可设置一组转化质粒的对照实验, 以检测感受态细胞的转化效率 (2) 重组反应体系中 DNA 量不足, 或者比例不佳 ( 双碱基突变 ): 尽量按照推荐 DNA 的量配制反应体系 请务必预先检测扩增产物的浓度 常用的吸光度测量法极易受 DNA 纯度 DNA 稀释液 ph 等因素影响, 测定值和 DNA 实际浓度往往偏差非常大 因此, 我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的 DNA 浓度 (3) 重组环化反应体系中 DNA 不纯, 抑制反应 : 未纯化的扩增产物加入重组反应体系内的总体积不应超过 2μl ( 反应体系体积 1/5) 尝试对扩增产物进行胶回收纯化 重组反应体系中应尽量避免金属络合剂 ( 如 EDTA) 的带入 因此, 我们推荐您将 DNA 纯化产物溶解在 ph8.0 的 ddh2o 中保存 ( 常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用 ph8.0 的 ddh2o 替代 ), 请勿使用 TE 进行 DNA 保存 (4) 感受态细胞中加入了过多的反应产物 : 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的 1/10, 否则会降低转化效率 (5) 出现转化抑制效应 : 当转化的 DNA 浓度太高时, 会抑制转化反应 将重组反应产物稀释 5 倍后取 1/5 进行转化 3. 定点突变未正确完成 (1) 引物设计错误 : 核对引物设计方案 (2) 扩增反应使用过多的模板质粒 : 对于大多数质粒,1ng 模板量已足以使扩增反应正常进行, 过多的质粒模板将会降低突变成功率 4. 非目标位点突变 (1) 模板质粒携带未知位点突变 : 测序确认模板质粒序列正确性 (2) 扩增循环数过多 : 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 扩增循环数不宜超 35 如果扩增效率良好的话, 推荐扩增循环数应不超过 30 5. 特别提醒! (1) 在选择引物反向互补区时, 应避免选择有重复序列的区域 当这一区域内 GC 含量在 40%~60% 范围之内时, 重组环化效率将达到最大 如这部分区域 GC 含量高于 70% 或者低于 30%, 重组环化效率会受到较大影响
(2) 双碱基定点突变方案同样可用于进行单碱基突变 ( 其中一个位点不进行碱基修改即 可 ) 因此, 在进行单碱基突变时如扩增无法进行, 可尝试使用双碱基突变方案