AxyPrep 基因组 DNA 小量试剂盒 本试剂盒采用独特的裂解和蛋白酶 K 消化技术, 结合 DNA 制备膜选择性地吸附 DNA 的方法达到纯化基因组 DNA 的目的 每次制备可获得多至 20 µg 的基因组 DNA 用于 PCR Southern 印迹分析 RAPD RFLD 等分子生物学实验 一 试剂盒组成 贮存 稳定性 Cat. No. AP-MN-MS-GDNA-4 AP-MN- MS-GDNA-50 制备次数 4 preps 50 preps Miniprep column 4 50 2 ml 离心管 8 100 1.5 ml 离心管 4 50 RNase A 10 µl 60 µl Buffer C L 1 ml 9 ml Proteinase K 1.2 mg 18 mg PK Buffer 90 µl 1.2 ml Buffer P D 2 ml 25 ml Buffer W1 3 ml 30 ml Buffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml Eluent 1 ml 12 ml 说明书 1 1 Miniprep column: 小量制备管 室温密闭贮存 RNase A: 50 mg/ml, 室温保存 Buffer C-L: 裂解液, 室温密闭贮存 Proteinase K: 冻干的蛋白酶 K 可室温贮存 6 个月, 长时间保存请置于 4 ; 溶解后, 在 2-8 可贮存 2 个月, 长时间保存请勿置于室温中 Buffer PK: 蛋白酶 K 溶解液, 室温密闭贮存 Buffer P-D: 蛋白去除液, 室温密闭贮存 Buffer W1: 洗涤液, 室温密闭贮存 Buffer W2 concentrate: 去盐液 使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇, 混合均匀, 室温密闭贮存 可用 100% 乙醇或 95% 乙醇 Eluent:2.5 mm Tris-HCl,pH 8.5, 室温密闭贮存 二 注意事项 Buffer C-L Buffer P-D 和 Buffer W1 含刺激性化合物, 操作时要戴乳胶手套和眼镜, 避免沾染皮肤 眼睛和衣服, 谨防吸入口鼻 若沾染皮肤 眼睛时, 要立即用大量水冲洗, 必要时寻求医疗咨询 Page 1
三 实验准备 1. 第一次使用时, 在 Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀 2. 根据瓶上标签将蛋白酶 K 溶解于 Buffer PK 中, 请勿旋涡振荡 3. 准备 56 水浴 4. 使用前检查 Buffer C-L 是否有沉淀析出, 若出现沉淀, 请于 37 水浴加热至沉淀完全溶解后再使用 5. 将 Eluent 或去离子水加热至 65 有利于基因组 DNA 的充分洗脱 四 操作步骤 步骤 1-5 请根据不同的样品选择相应的操作, 匀浆 裂解和除蛋白质及其它杂质 从动物组织中提取基因组 DNA 1. 取 1-20 mg 动物或人组织, 移入冰水浴预冷的研钵中, 快速 用力研磨成匀浆 * 下列组织请加液氮研磨至粉末状后, 将研钵置于 56 水浴, 当粉末开始融化时继续研磨 1 min, 匀浆后加入 350μl PBS 和 0.9 µl RNase A, 再进入步骤 3 的操作下 A. 富含 DNA 酶的胰脏, 脾脏, 胸腺, 淋巴等组织 B. 富含胶原蛋白的皮肤 肌健等组织 C. 富含角质蛋白的组织或坚硬的组织如骨骼等 2. 加入 350 µl Buffer PBS 和 0.9 µl RNase A 后温和地研磨 30 s 3. 收集 350 µl 研磨好的组织匀浆并转入 2 ml 离心管 如匀浆体积不足 350 µl, 补充 PBS 至 350 µl 4. 加入 150 µl Buffer C-L 和 20 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀 短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min 从植物组织中提取基因组 DNA 1. 按下表称取适量的新鲜植物组织 ( 如选用的是冷冻干燥的组织, 则组织用量减半 ) 剪成小块放入研钵中 ; 加入液氮, 使组织冷冻完全后, 快速 用力研磨至粉末状 研磨时应间断加入液氮以防止组织融化, 研磨充分后将研钵放入 56 水浴至样品粉末刚开始融化 * 表 1 新鲜植物样品使用量按下表收集 植物花或叶片植物茎植物根植物种子 10-100 mg * 样品研磨应充分, 否则严重影响基因组 DNA 的得率 * 如从培养的植物细胞中提取基因组 DNA, 收集 2 10 3-1 10 7 培养的植物细胞,10,000 g 离心 1 min, 加入 Page 2
150 µl PBS 充分悬浮细胞并转入研钵中, 加入液氮, 使组织冷冻完全后, 快速 用力研磨至粉末状 研磨时应间断加入液氮以防止组织融化, 研磨充分后将研钵放入 56 水浴至样品粉末刚开始融化 2. 加入 350 µl PBS 和 0.9 µl RNase A 贮存液, 用力碾磨 30 s * 如新鲜植物叶超过 120 mg 或干植物叶超过 60 mg, 加入 700 µl PBS 按照步骤 2 完全操作后, 将匀浆样品分到两个 2 ml 离心管中, 然后按照步骤 4-5 平行操作两管, 第 6 步和接下来的步骤合并到一管操作, 以提高洗脱的 DNA 的浓度 3. 转移 350 µl 研磨好的匀浆至 2 ml 离心管中, 如匀浆体积不足 350 µl, 补充 PBS 至 350 µl 4. 加入 150µl Buffer C-L 和 20 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀 短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min * 富含纤维的根 / 茎等组织或富含淀粉 蛋白质的种子等样品, 可延长水浴时间至 30 min 从培养细胞 淋巴细胞 骨髓 干血和骨头中提取基因组 DNA 根据培养细胞的类型来操作, 若从植物细胞中提取基因组 DNA, 请按步骤 ( 从植物组织中提取基因组 DNA) 来匀浆 A. 悬浮培养的动物细胞或新鲜分离的动物组织单细胞悬液 1A. 用 2 ml 离心管收集 1 10 3-2 10 6 细胞悬浮液,2,000 g 离心 5 min, 弃尽上清 2A. 加入 350 µl 去离子水或 PBS 悬浮细胞 B. 单个细胞培养或 96 孔板 24 孔板 12 孔板和 6 孔板细胞培养 1B. 尽可能的丢掉上清液, 加 350µl PBS 到每孔中, 室温静置 1 min 2B. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 C. 淋巴细胞 1C. 加 350µl PBS 到每孔中, 室温静置 1 min 2C. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 D. 骨髓 1D. 切除骨头的两端, 用针头吸 350µl PBS 从骨头一端冲出骨髓 2D. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 E. 干血 1E. 加 350µl PBS 到每孔中, 室温静置 1 min 2E. 用吸头来回吸注几次, 至干血完全溶解, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 Page 3
F. 骨头 1F. 取 10-50 mg 骨头, 移入冰水浴预冷的研钵中, 快速 用力研磨成匀浆 ; 加入 350 µl PBS, 用力碾磨 30 s 2F. 用吸头来回吸注几次, 转移 350µl 匀浆至 2 ml 离心管, 如匀浆体积不足 350µl, 补足 PBS 至 3. 加入 0.8 µl RNase A, 漩涡振荡 15s, 室温静置 1min 4. 加入 150µl Buffer C-L 和 8 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀 短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min 从酵母中提取基因组 DNA 1. 收集 2 10 6-5 10 7 酵母细胞,10,000 g 离心 1min 用 350 µl PBS 悬浮酵母细胞并转移至研钵中, 加入液氮, 待样品被完全冷冻后, 快速 用力研磨至粉末状 将研钵放入 56 水浴至样品粉末刚开始融化时进入下一步操作 * 当 OD600 为 1 时, 酵母浓度为 3 107 细胞 /ml * 酵母细胞壁较为坚韧, 应适当延长研磨时间和研磨次数以确保充分破碎酵母细胞壁 * 研磨时应及时加入液氮, 防止样品在研磨时融化 2. 加入 1.2 µl RNase A 贮存液, 快速用力碾磨 30 s 3. 转移 350µl 研磨好的匀浆至 2 ml 离心管中, 如匀浆体积不足 350µl, 补充 PBS 至 4. 加入 150µl Buffer C-L 和 20 µl Proteinase K 立即漩涡振荡 1min 混合均匀 短暂离心后, 将离心管置 56 水浴 10 min 步骤 6-10, 可选择负压法或离心法 A. 负压法 6A. 将 DNA 制备管插到负压装置的插口上, 将步骤 5 的离心后的上清液移到制备管中, 开启并调节负压装置至 -20-30 英寸汞柱 7A. 保持负压, 加入 500µl Buffer W1, 吸尽管中液体 8A. 保持负压, 加入 700µl 已加入乙醇的 Buffer W2, 吸尽管中液体 ; 以同样的方法再用 700µl Buffer W2 洗涤一次 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇 * 沿管壁加入 Buffer W2 有助于彻底冲洗附在管壁上的盐分 * 两次用 Buffer W2 冲洗能确保盐分被完全消除, 消除对酶切反应的影响 9A. 将 DNA 制备管放回 2 ml 离心管中,12,000 g 离心 1 min Page 4
B. 离心法 6B. 将 DNA 制备管置于 2 ml 离心管中, 将步骤 5 中的混合液移至制备管中,12,000 g 离心 1 min 7B. 弃滤液, 将制备管置回到原来的 2 ml 离心管中, 加入 500µl Buffer W1,12,000 g 离心 1 min 8B. 弃滤液, 将制备管置回到原来的 2 ml 离心管中, 加入 700µl Buffer W2,12,000 g 离心 1 min, 以同样的方法, 用 700µl Buffer W2 再洗涤一次 * 确认 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 * 再次用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除, 消除对酶切反应的影响 9B. 弃滤液, 将制备管置回原来的 2 ml 离心管中,12,000 g 离心 1 min 10. 将 DNA 制备管置于另一洁净的 1.5 ml 离心管中, 在制备管膜中央加 100-200µl Eluent 或去离子水, 室温静置 1 min,12,000 g 离心 1min 洗脱 DNA * 将去离子水或 Eluent 加热至 65 将提高洗脱效率 五 流程图 加入 350 μl PBS 按说明书要求加入 RNase A 加入 150 μl Buffer C-L 按说明书要求加入 Proteinase K 56 C 水浴 10 min 裂解 加入 350 μl Buffer P-D 中和 加入 500 μl Buffer W1 加入 700 μl Buffer W2 加入 700 μl Buffer W2 结合 洗涤 加入 100-200 μl Eluent 或去离子水 洗脱 Page 5