中国农学通报 2012,28(24):213-217 Chinese Agricultural Science Bulletin 芽胞杆菌菌体浓度的快速检测方法研究 1,2 刘国红, 林营志 2, 刘波, 林乃铨 ( 1 福建农林大学植物保护学院, 福州 350002, 2 福建省农业科学院农业生物资源所, 福州 350003) 摘要 : 为了快速检测芽胞杆菌的菌液浓度, 采用分光光度法测定蜡状芽胞杆菌的菌液浓度, 代替传统常规费时费力的生物细胞测定法 本研究以不同 ph 下培养的模式菌株蜡状芽胞杆菌为例, 通过可见光分光光度法测定不同 ph 菌液的吸光度, 分别以水和培养基作为空白对照, 并与其对应的菌体浓度进行比较分析 利用生物统计软件 DPS 分析蜡状芽胞杆菌菌液浓度 (Y) 与其吸光度 (X)( 以水为空白对照 ) 之间有着极好的相关性, 其测定的吸光度可以作为快速地检测芽胞杆菌菌体浓度的指标 综上所述, 本研究结果证明吸光度法可以代替细胞计数法作为芽胞杆菌的菌体浓度生长变化的指标, 且此方法简便 快速 可靠 关键词 : 芽胞杆菌 ; 菌体浓度 ; 吸光度中图分类号 :Q9 文献标志码 :A 论文编号 :2011-3418 Study on Rapid Detection Method of Genus Bacillus Cell Concentration Liu Guohong 1,2, Lin Yingzhi 2, Liu Bo 2, Lin Naiquan 1 ( 1 Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002; 2 Biological Resources of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003) Abstract: For the rapid detection of Bacillus bacterial concentration, the spectrophotometric method was used to detect Bacillus cereus concentration, instead of the traditional time-consuming and laborious biological cell assay. In this study, Bacillus cereus cultured in different ph were used as an example, OD value of Bacillus cereus cultured in different ph was measured by visible spectrophotometry, water and culture medium as the blank control respectively, and its corresponding cell concentration of Bacillus cereus was compared. By bio-statistical software DPS, the correlation between concentration (Y) and its absorbance (X) (water control) of Bacillus cereus was very good. The absorbance method could be used as a rapid detection of Bacillus spp. cell concentration indicators. In summary, the experimental results demonstrated that spectrophotometer detection could replace the concentration of Bacillus cereus expressing the biological characteristics of Bacillus, and this method was simple, fast and reliable. Key words: Bacillus cereus; cell concentration; absorbance 0 引言 芽胞杆菌是一大类表型特征不同的细菌群, 如营 养需求多样性, 生理与代谢多样性,DNA 碱基范围 广 芽胞杆菌种类繁多, 功能多样, 在工业 农业 医学 等各个领域都具有重要的作用 蜡样芽孢杆菌是常见 食品污染菌之一, 可引起人的食物中毒, 一般在食品中 基金项目 : 国家 948 项目子专题 高效新型微生物资源引进与创新 (2011-G25); 福建省科技项目公益专项 生物农药行业特色芽孢杆菌资源库的建立及生防菌株的筛选应用 (2009R10037-1) 第一作者简介 : 刘国红, 女,1983 年出生, 山东聊城人, 博士生, 主要从事微生物分类研究 通信地址 :350003 福建省福州市五四路 247 号省农科院高新大楼 1309,E-mail:liuguohong624@sina.com 通讯作者 : 刘波, 男,1957 年出生, 福建惠安人, 研究员, 博士, 主要从事生物技术与生物农药研究 通信地址 :350003 福建省福州市五四路 247 号省农科院高新大楼 1309,Tel:0591-87864601,E-mail:liubofaas@163.com 林乃铨, 男,1944 年出生, 福建人, 教授, 博士, 主要从事昆虫分类研究 通信地址 :350002 福建省福州市福建农林大学生防所 收稿日期 :2011-11-18, 修回日期 :2012-03-14
214 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 含有 10 5 ~10 8 个 /g 活菌时就可能引起食物中毒 [1] 解决 由细菌性中毒引发的食品安全问题尤为紧迫 然而, 由于目前检测手段普遍存在耗时长 操作复杂和成本 高等问题, 严重制约了食品安全监控技术和管理体系 的完善及实际运行 因此, 建立和推广准确 快速和低 成本的细菌检测技术很有必要 在细胞培养过程中, 细胞生长和产物合成的关系无论是相关型 非相关型 还是部分相关型, 细胞生长的控制都是重要的环 节 [2] 因此选择和研究培养液中生物量 ( 或细胞浓度 ) 的测定方法是及时确定细胞培养过程中细胞生长变化 规律和深人研究细胞代谢调控的基础 准确迅速地测量培养过程中芽胞杆菌培养液的细 胞量是深入研究芽胞杆菌代谢控制的基础, 无论是对 科学研究, 还是对其在实践中的应用都有着极其重要 的意义 常规的计数方法通常采用细胞计数法测定菌 液浓度, 该方法费时费力, 且主观性误差大, 使实验结 [3] 果受到很大的影响 郝冬霞等为了促进细胞生长测 定方法的研究, 介绍了细胞生长测定方法研究进展, 如 直接法 ( 用离心法或过滤法直接测定细胞重量 ) 电导 率法 粘度法 血球计数法 平板菌落计数法 生物电 极 荧光法 分光光度法 分光光度法是常用的一种测 定方法 [4-5], 在各个研究领域皆被广泛应用, 如医学上, [6] 李伟等利用血液吸光度判断大鼠的死亡时间 朱艳 [7] 静等为了研究纤维制品的抗菌性, 以单位体积菌落 数与吸光度 (ABS 值 ) 的相关性, 制成标准曲线, 利用 标准曲线快速准确地判断菌液浓度, 具有较强的实用 价值 目前关于分光光度法测定蜡状芽胞杆菌菌液浓度 的文献还未见报道, 本研究针对培养过程中菌液浓度 的传统方法进行改进, 对培养过程中的芽胞杆菌进行 了菌液浓度与其培养液吸光度的相关性分析 研究菌 液浓度与吸光度的关系, 以便利用该相关性对菌的生 长情况进行简便 快速的测定 1 材料与方法 1.1 材料 菌株 : 蜡状芽胞杆菌 (Bacillus cereus) 模式菌株, 购 买于瑞典微生物保藏中心 试验用水为超纯水, 紫外 可见分光光度计 (UV-2550,220 V), 恒温培养振荡器 (ZHWY-2102C,220 V), 显微镜, 高速离心机 1.2 试验方法 菌液的制备 : 以不同 ph NA 液体培养基培养 24 h 的蜡状芽胞杆菌菌液为测试样, 然后将菌液稀释为一 系列不同浓度的菌液,3 个平行样品, 即 3 个重复 菌 液浓度测定方法 : 采用血球计数板法 (25 16), 在光学 显微镜下计数,3 次计数, 取均值 菌液吸光度的测定 : 分别以水和培养基作为空白对照, 测定菌液的吸光度 (OD 值 ) 上清液的处理 : 培养 24 h 的蜡状芽胞杆菌菌液离心 3000 r/min 20 min 后, 取上清液 1.3 菌体浓度与吸光度的相关性分析分别测定菌液和对应上清液在各波长下的吸光度值, 利用 DPS 软件进行数据处理, 拟合菌液浓度 - 吸光度线性关系 2 结果与分析 2.1 藻培养液的吸光特性分别对芽胞杆菌菌液和上清液进行光谱扫描, 如图 1 和图 2 所示 由图 1 可以看出, 菌液可见光波长范围内没有很明显的吸收峰, 在可见波长发范围内随波长减小吸光度呈上升趋势 而 OD 600 是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法 故选取在波长 600 nm 测定芽胞杆菌菌液的吸光度 图 2 为菌液上清液的光谱扫描图, 很明显地发现在整个可见波长范围内没有吸收峰, 且吸光度值几乎接近 0 点, 由此说明上清液对菌液的吸光度值几乎没有影响, 可忽略不计 2.2 不同 ph 的芽胞杆菌菌液浓度测定采用血球计数板法在显微镜下对细胞计数, 不同 ph 下芽胞杆菌菌体浓度变化即生长趋势如图 3 随着 ph 增大, 菌体浓度先增大后减少, 在 ph 8 时达到最大值, 为 3.05 10 8 个 2.3 ph 对菌液吸光度的影响 2.3.1 以水为空白对照的测定以水为空白对照, 测得芽胞杆菌不同 ph 培养基中的吸光度, 随着 ph 的增大吸光度先增大后减小, 在 ph 8 时达到最大值, 为 2.448 ( 图 4) 2.3.2 以培养基作为空白对照的测定以培养基为空白对照, 测得芽胞杆菌不同 ph 值培养基中的吸光度, 随着 ph 的增大吸光度先增大后减小, 在 ph 8 时达到最大值, 为 2.482( 图 5) 2.4 菌体浓度与吸光度的相关性分析以水和以培养基为空白对照测得的菌液吸光度和菌体浓度呈一致性 ( 图 6 和图 7) 蜡状芽胞杆菌菌液浓度 (Y) 与其吸光度 (X)( 以水为空白对照 ) 之间的相关性 :Y=1.745+0.243X,r(Y,X)=0.9333, 蜡状芽胞杆菌菌液浓度 (Y) 与其吸光度 (X)( 以培养基为空白对照 ) 之间的相关性 :Y=1.817+0.211X,r(Y,X)=0.957 由以上可以看出, 线性回归分析的相关系数均大于 r 0.01= 0.917, 说明 2 种方法的测定结果相关性极显著 2.5 可见分光光度法与基本测定方法的比较由图 6 和图 7 可知细胞计数法和吸光度法测得的
刘国红等 : 芽胞杆菌菌体浓度的快速检测方法研究 215 5.900 6 5 4 3 5.000 0.000-4.900 190.00 400.00 600.00 800.00 900.00 波长 /nm 图 1 芽胞杆菌菌液的光谱扫描图 5.900 4 3 5.000 0.000-4.900 220.00 400.00 600.00 800.00 900.00 波长 /nm 图 2 芽胞杆菌菌液的上清液的光谱扫描图
216 中国农学通报 http://www.casb.org.cn 菌液浓度菌液浓度 / 10 8 个 个 吸光度 图 3 芽胞杆菌的菌液浓度图 4 芽胞杆菌菌液的吸光度 ( 以水为对照 ) 吸光度 图 5 芽胞杆菌菌液吸光度 ( 以培养基为对照 ) H 2O 为空白对照 菌液浓度 图 6 菌体浓度与其吸光度 ( 以水为对照 ) 的相关性 菌液浓度 / 10 8 个 培养基为对照 菌液浓度 菌液浓度 / 10 8 个 图 7 菌体浓度与其吸光度 ( 以培养基为对照 ) 的相关性 菌体浓度变化基本一致 很显然,OD 值可以代表细胞计数法作为菌体生长变化的指标 显微镜血球计数板法是芽胞杆菌的菌体浓度的本测定方法, 是确定菌体浓度的有效依据 但此种方法费时费力, 且人为误差较大 通过几种测定方法的比较分析, 很明显地得出分光光度法测定结果与细胞计 数法具有很强的相关性, 而且本研究同时分别以水和培养基作为空白对照得出菌液 OD 结果基本一致 采用分光光度法测定菌液 OD 值作为芽胞杆菌菌体浓度指标, 在实际应用中具有重要的作用和意义 3 结论与讨论本实验以水为空白对照, 采用分光光度法选取波
刘国红等 : 芽胞杆菌菌体浓度的快速检测方法研究 217 长 600 nm 时测定 170 r/min 振荡培养 24 h 的芽胞杆菌 菌液, 得出菌液 OD 值, 利用 DPS 软件分析试验结果发 现, 分光度法测定的菌液 OD 值可以作为芽胞杆菌菌 体浓度检测的指标 采用分光光度计法测定生物量, 方法简便 快速, 且结果也可靠, 而且分光光度法是一种很成熟的一种 方法 已有不少关于利用紫外分光光度法测定生物量 [8] 的报道 阎博等介绍了一种应用浊度法测定反硝化 细菌培养液中细胞的生物量的方法, 该方法采用分光 光度计测定培养液在某个波长下的吸光度, 根据标准 [9] 曲线可快速得知培养液中的生物量 谢涛等在研究 微生物转化制备甘露醇中, 应用浊度法测定发酵液中 乳酸杆菌的浓度和生长曲线 本研究分别以水和培养基作为空白对照测定芽胞 杆菌的吸光度,DPS 软件分析得出两者的测定结果与 [10] 菌体浓度皆有极显著的相关性 孔军德等通过测定 光合细菌菌液浓度和其吸光度, 确定了菌液浓度和吸 光度 (OD 值 ) 之间的相关性, 建立了数据模型 董正 [11] 臻等通过分光光度法确定了藻类生物量的快速测定 [12] 方法 陈晨等研究发现培养液中藻浓度与吸光度均 成正比, 研究结果表明吸光度可准确反映培养过程中 的藻浓度 说明采用分光光度法测定芽胞杆菌菌液 OD 值时可以以水作为空白对照, 这样就避免了每次 因为培养基造成的实验误差, 既方便又节省了药品 以往实验用去离子水做参比溶液时, 有时会出现 [13] 负值吸光度, 魏正妍等对出现负值的原因作出了分 析, 并提出了解决办法 参照前人的研究 [14-16], 本实验 测定菌液吸光度时, 在以水做参比液时避免了吸光度 负值的出现, 使得结果更具有参考价值 本研究结果证明采用分光光度法测定芽胞杆菌生 物量, 方法简便 结果可靠, 可以替代传统的基本测定 方法, 在科学研究中具有很大的实际应用价值 参考文献 [1] 周帼萍, 袁志明. 蜡状芽孢杆菌污染及其对食品安全的影响 [J]. 食品科学,2007(3):357-361. [2] 周德庆. 微生物学教程 [M]. 北京 : 高等教育出版社,1993. [3] 郝冬霞, 刘本发, 吴兆亮. 细胞生长测定方法与研究进展 [J]. 微生物学通报,2001,28(6):82-85. [4] 李冬阳, 茹柿平, 吴坚, 等. 分光光度法快速检测细菌 [J]. 分析化学, 2010,38(4):573-576. [5] 赵佼, 戴琥, 谭文松. 转瓶内部结构对无血清悬浮培养昆虫细胞的影响 [J]. 生物工程学报,2000,16(6):786-788. [6] 李伟, 柯咏, 贺光社, 等. 大鼠死后血浆吸光度变化与死亡时间关系的研究 [J]. 光谱学与光谱分析,2008,28(12):2944-2946. [7] 朱艳静, 李宇. 测定菌体浓度的简便方法 [J]. 工业微生物,2006,36 (4):47-49. [8] 阎博, 赵林, 谭欣, 等. 浊度法快速测定培养液中的生物量 [J]. 天津化工,2003,17(1):45-47. [9] 谢涛, 廖安平, 黄春妤, 等. 浊度法快速测定甘露醇发酵液中的生物量 [J]. 广西民族大学学报 : 自然科学版,2008,14(3):75-77. [10] 孔军德, 赵春燕, 黄晓星, 等. 光合细菌菌数测定数学模型的构建 [J]. 沈阳农业大学学报,2001,32(5):358-359. [11] 董正臻, 董振芳, 丁德文. 快速测定藻类生物量的方法探讨 [J]. 实验与技术,2004,28(11):1-2,5. [12] 陈晨, 马晓雁, 李军, 等. 水中典型致臭藻类培养浓度与吸光度 浊度关系探讨 [J]. 四川环境,2010,29(4):31-34. [13] 魏正妍, 尚雪岭. 吸光度出现负值的原因分析 [J]. 新乡学院学报 : 自然科学版,2009,26(4):31. [14] 王冬梅. 浅谈比色皿的正确使用与保养 [J]. 啤酒科技,2003(8): 56-56. [15] 俞慧玲, 李相彪. 工业分析中分光光度计的应用技巧 [J]. 氯碱工业, 2007(8):35-36. [16] 刘新, 汪玉琼, 宋庆雄. 浅谈使用分光光度计易出现的几个问题 [J]. 福建分析测试,2007,16(4):50-52.