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使用针对临床研究的混合模式 SPE 和亲水作用色谱 (HILIC) 对尿液中的儿茶酚胺和变肾上腺素进行快速 同步分析 Jonathan P. Danaceau, Erin E. Chambers 和 Kenneth J. Fountain 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德 ) 应用优势 无需离子对试剂即可实现单胺神经递质与变肾上腺素的保留与基线分离 快速 同步定量尿液中的变肾上腺素和儿茶酚胺 可得到线性 准确 精密的结果, 线性范围为.5-5 ng/ml 沃特世解决方案 Oasis WCX 3 mg 96 孔板 ( 部件号 6253) 简介临床研究者通常都很关注高浓度尿液中的儿茶酚胺及其 O- 甲基化代谢产物 ( 变肾上腺素 ) 的测定 但是, 这些化合物 ( 尤其是去甲肾上腺素 肾上腺素和多巴胺 ) 由于极性较大, 利用反相 LC-MS/MS 对其进行分析是一项巨大挑战 因此, 许多研究实验室仍采用离子对试剂与电化学检测 (ECD) 分析这类物质 虽然反相 LC-MS/MS 已得到成功应用, 但由于尿液基质组分发生离子抑制 保留作用不足和异丙肾上腺素与肾上腺素未完全分离, 致使挑战仍然存在 1-6 亲水作用色谱 (HILIC) 已逐渐成为分析极性化合物的首选 通过对之前发表的方法进行扩展 6, 本应用纪要介绍了尿液中单胺神经递质与儿茶酚胺的提取与分析方法 采用沃特世 (Waters ) ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱可实现基于 HILIC 的色谱分离 Waters Oasis WCX 96 孔板可用来提取尿液中的这些化合物 将复合模式弱阳离子交换固相萃取 (SPE) 板, 与用于 HILIC 色谱和 Waters Xevo TQD 质谱的色谱柱结合使用, 可获得具有出色线性 准确度和精密度的快速 稳定方法, 并且能最大限度减少基质效应 96 孔样品收集板,8 µl 圆孔 ( 部件号 62481) ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱, 1.7 m, 2.1 x mm ( 部件号 6481) ACQUITY UPLC I-Class 系统 Xevo TQD MassLynx 软件 关键词儿茶酚胺, 变肾上腺素,HILIC, SPE,LC-MS/MS, 样品制备 1

实验 LC 条件 LC 系统 : 色谱柱 : 柱温 : 样品温度 : ACQUITY UPLC I-Class ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱,1.7 m, 2.1 x mm 3 C 1 C 流动相 A (MPA): 95:5 水 : 乙腈, 含有 5 mm NH 4 HCOO,pH 3. 流动相 B (MPB): 15:85 水 : 乙腈, 含有 3mM NH 4 HCOO,pH 3. 洗针液 +: 强洗针液和弱洗针液同流动相 B 梯度条件如表 1 所示, 包含初始平衡条件, 随后缓慢上升且流速增大, 以重新平衡色谱柱 MS 条件 MS 系统 : Xevo TQD 电离模式 : ESI+ 毛细管电压 :.5 kv 锥孔电压 : 视化合物而定 ( 见表 2) 去溶剂气流速 : 9 L/h 锥孔气流速 : L/h 去溶剂气温度 : 35 C 源温度 : 15 C 使用 Waters MassLynx 软件 (4.1 版 ;SCN 855) 对数据进行采集和分析, 并用 TargetLynx 进行定量 表 1. 流动相梯度 流动相 A 和流动相 B 的组成在方法部分列出 时间 (min) 流速 (ml/min) A B.6.. 1..6.. 2..6 1. 9. 2.1 1. 1. 9. 2.5 1. 3. 7. 2.6 1... 3.9 1... 4..6.. 用含有.1 抗坏血酸的甲醇配制多巴胺 (DA) 去甲肾上腺素 (NE) 肾上腺素(EP) 3- 甲氧酪胺 (3-MT) 变肾上腺素(MTN) 和异丙肾上腺素 (NMT) 的标准品混合储液 (1 µg/ml), 以防止氧化 混标储液由 1 µg/ml D3- 变肾上腺素 D3- 异丙肾上腺素 D4- 多巴胺 D6- 肾上腺素和 D6- 去甲肾上腺素组成, 也使用含有.1 抗坏血酸的甲醇配制 浓度为 8 ng/ml 的内标工作溶液应使用含有.1 甲酸的 5 甲醇当天配制 样品制备使用 1( 体积比 )1-N 盐酸对尿样进行预处理, 模拟此方法常用的酸化预处理过程 将 5 µl 内标工作溶液加入一份 4 µl 的酸化尿液中, 随后加入 1 ml.5 M 的 NH 4 CH 3 COO 将经过预处理的样品加载到经 1 ml MeOH 和 1 ml H2O 预处理的 Oasis WCX 板的各孔中 加载样品之后, 依次使用 1-mL NH 4 CH 3 COO(2 mm) 和 1 ml 甲醇对孔进行清洗 然后将 96 孔板在真空条件下干燥 3 s, 以尽可能多地除去柱床中的甲醇 使用 2 份 25 µl 含有 2 甲酸的 85:15 ACN:H 2 O, 将目标化合物由板洗脱到 8 µl 的 96 孔样品收集板 ( 部件号 62481) 中 仅依靠重力使每份溶剂渗透进入孔内, 以最大限度延长与吸附剂的接触时间 取 1 µl 洗脱液注入 LC-MS/MS 系统中 采用混合模式 SPE 和亲水作用色谱 (HILIC) 分析尿液中的儿茶酚胺和变肾上腺素 2

结果与讨论 所有化合物的结构及其 logp 值如图 1 所示, 可以看出, 这些化合物多数具有较高极性 表 2 给出了每个化合物的保留时间和各自的 MS 参数, 包括 MRM 跃迁 锥孔电压和碰撞能量 去甲肾上腺素 logp =-.68 肾上腺素 logp =-.43 多巴胺 logp =-.3 异丙肾上腺素 logp =-.39 变肾上腺素 logp =. 3- 甲氧酪胺 logp =.68 图 1. 儿茶酚胺和变肾上腺素的名称 分子结构和 logp 值 表 2. 分析儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱参数 分析物 RT (min) MRM 跃迁 3- 甲氧酪胺.83 168.1>91 168.1>119 变肾上腺素.89 198.1> 198.1>165.1 异丙肾上腺素 1.16 4.1>166 4.1>134.1 多巴胺 1.24 154.>91 154.>119 肾上腺素 1.38 4.1>166 4.1>17 去甲肾上腺素 1.93 17>152 17>17 锥孔电压 (V) 2 12 2 2 14 14 碰撞能量 (ev) 24 8 8 2 8 2 6 2 采用混合模式 SPE 和亲水作用色谱 (HILIC) 分析尿液中的儿茶酚胺和变肾上腺素 3

图 2A 显示了采用 ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱, 从 5 ng/ml 校准标准品中得到的所有化合 6 物的色谱图 之前的研究结果已经表明,MPB 中 3 mm NH 4 HCOO 和 15 的水实现了离子强度和溶解度的完美平衡, 得到的分离度和峰形如图 2A 所示 该分离作用的一个重要特点体现在 NMT 和 EP 之间的分离度中 这两种化合物具有相同的分子量, 如果未充分分离可能会彼此干扰 在反相色谱条件下,HILIC 模式中, 这两种化合物之间可达到的最佳分离度为.5 min(3 s) 和. min(13.2 s) 的分离 HILIC 模式可实现更稳定的分离, 确保以上两种化合物可进行明确的定性与定量 图 2B 显示出未加标尿样的 HILIC 色谱图, 表明 HILIC 具备校正内源性 3-MT MTN NMT DA EP 和 NE( 分别为 21.6 1.6 17.8 6.. 和 4.1 ng/ml) 的能力 未能检出 EP 的最大可能因素是此尿样在未进行酸化保护的情况下储存过长时间 A.83 3-MT B.83 3-MT.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4.89 MTN.89 MTN.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 1. DA.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 1.24 1.13 DA.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 NMT 1.16 1.38 EP NMT 1.16 EP.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 NE 1.92 NE 1.94.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 Time 1.8 2.7 2.29.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 Time 图 2. 儿茶酚胺和变肾上腺素在 ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱 (1.7 m,2.1 x mm) 上得到的色谱图 A. 5 ng/ml 的代表性校准标准品 B. 显示内源性儿茶酚胺和变肾上腺素色谱图的未加标的尿样 在方法部分详细介绍了色谱条件 采用混合模式 SPE 和亲水作用色谱 (HILIC) 分析尿液中的儿茶酚胺和变肾上腺素 4

回收率和基质效应提取回收率和基质效应如图 3 所示 回收率范围介于 36 (NE) 到 98.5 (3-MT) 之间 重现性良好, 所有化合物的变异系数均在 5 以下 基质效应范围为 (NE) 到 -35 的最大值 ( 多巴胺 ) 然而多数基质效应 -1, 揭示出 HILIC 方法的另一个优势 采用相同的提取方法, 在反相色谱条件下 NE 和 EP 的基质效应明显更大 ( 约为 -6) 由于以上两种化合物的内源性浓度较低, 因而这是一项重要的改进 8 6 4 2-2 -4-6 -8 Matrix Effects (HILIC) (RP) 图 3. 采用 Oasis WCX 3 mg 96 孔板 (N=4) 从尿液中提取儿茶酚胺和变肾上腺素的回收率和基质效应 绿色条柱代表反相色谱分析的基质效应 定量结果通过将已知浓度分析物加标至真实尿样中制备校准曲线和质量控制样品 进行数据处理之后, 可由得出的校准曲线外推出内源性浓度 将这些数据用于校正实际浓度 例如, 确定用于校准的尿样含有 6. ng/ml DA, 因此将校准浓度由.5 5. 改为 6.5 56. ng/ml 得出的校准曲线显示出良好线性, 所有化合物的 R 2 值均达到.992 或更高 图 4 显示出 NMT 和 EP 的代表性校准曲线, 两者的 R 2 值均为.999 内源性的浓度已经包含在实验浓度数据中 3-MT MTN 和 DA 的 R 2 值分别为.998.999 和.992 以 1.6 8. 8 和 4 ng/ml 加标的质量控制样品 (N=4) 准确精密 ( 见表 3) 所有 QC 值均在其各自目标值 1 的范围以内, 绝大部分在 5 以内 此外, 仅有三个变异系数大于 1, 其余所有变异系数均小于 1 这证明了该方法在包含正常样品与病理升高样品的整个预期值范围的校准范围中, 可得到线性 准确 精密的结果 采用混合模式 SPE 和亲水作用色谱 (HILIC) 分析尿液中的儿茶酚胺和变肾上腺素 5

2 异丙肾上腺素 R 2 =.999 响应 - - 5 15 2 25 3 35 4 45 5 ng/ml 4 3 肾上腺素 R 2 =.999 响应 2 - ng/ml - 5 15 2 25 3 35 4 45 5 图 4. 由加标尿样中提取的异丙肾上腺素 (NMT) 和肾上腺素 (EP) 的校准曲线 采用 1/x 加权线性拟合对数据进行拟合 NMT 和 EP 的基底浓度分别为 17.8 和 ng/ml 表 3. 尿液中儿茶酚胺和变肾上腺素的质量控制结果 浓度参考加标浓度 通过对比尿样中加标浓度与内源性计算值的加和结果, 计算出准确度 QC 加标浓度 3-MT 变肾上腺异丙肾上腺素 准确度偏差 CV 准确度偏差 CV 准确度偏差 CV 1.6 94.4-5.6-2.6 98.9-1.1-2.9 98.8-1.2-3.9 8 95.9-4.1-3..5.5-1.7 11. 1. -4.2 8 11.8 1.8-4.3 14. 4. -.9 13.4 3.4-1.6 4 19.8 9.8-5. 11.9 1.9-2.1.8.8 -.5 Mean.5 11.3 11. QC 加标浓度 准确度 多巴胺肾上腺素去甲肾上腺素 偏差 CV 准确度偏差 CV 准确度偏差 CV 1.6 92.1-7.9-9.5 95.6-4.4-6.2 94. -6. -7.2 8 96.5-3.5-11. 95.4-4.6-3.2 98.7-1.3-3.3 8 12.8 2.8-2. 13.4 3.4-1.5 99.2 -.8-14.8 4 13.4 3.4-2.4 13. 3. -1.9 98.3-1.7-12.9 Mean 98.7 99.4 97.5 采用混合模式 SPE 和亲水作用色谱 (HILIC) 分析尿液中的儿茶酚胺和变肾上腺素 6

结论本文详细描述了采用 Oasis 复合模式弱阳离子交换 (WCX) 板和 ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱在 HILIC 模式下对尿液中儿茶酚胺和变肾上腺素的提取和分析过程 采用 Oasis WCX 板进行提取, 可实现所有化合物较低的基质效应和一致的回收率, 并能够得到较好的精密度 与经过优化的反相分离相比,HILIC 分离降低了 NE 和 EP 的基质效应, 并改善了 EP 和 NMT 之间的分离度 定量结果十分出色, 在.5-5. ng/ml 的范围内具有线性响应, 并表现出出色的准确度和分析精度 参考文献 1. Cubbon S 1, Antonio C, Wilson J, Thomas-Oates J. Metabolomic applications of HILIC-LC-MS. Mass Spectrom Rev. 21 Sep-Oct;29(5):671 84. 2. Jian W 1, Edom RW, Xu Y, Weng N. Recent advances in application of hydrophilic interaction chromatography for quantitative bioanalysis. J Sep Sci. 21 Mar;33(6 7):681 97. 3. Xu RN 1, Rieser MJ, El-Shourbagy TA. Bioanalytical hydrophilic interaction chromatography: recent challenges, solutions and applications. Bioanalysis. 29 Apr;1(1):239 53. 4. Jian W 1, Xu Y, Edom RW, Weng N. Analysis of polar metabolites by hydrophilic interaction chromatography MS/MS. Bioanalysis. 211 Apr;3(8):899 912. 5. Hemström P 1,, Irgum K. Hydrophilic interaction chromatography. J Sep Sci. 26 Aug;29(12):1784 821. 6. Danaceau JP 1, Chambers EE, Fountain KJ. Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) for LC-MS/MS analysis of monoamine neurotransmitters. Bioanalysis. 212 Apr;4(7):783 94. 仅供研究使用 不适用于诊断 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters, Oasis, ACQUITY UPLC, Xevo, MassLynx, The Science of What s Possible 是沃特世公司的注册商标 其它所有商标均归各自的拥有者所有 214 沃特世公司印制于中国 214 年 7 月 72593ZH AG-PDF 北京 :1-529 3866 上海 21-6156 2666 广州 2-2829 5999 成都 28-6578 499 香港 852-2964 免费售后服务热线 8 (4) 82 2676 www.waters.com