液相条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC 系统 色谱柱 : ACQUITY UPLC HSS T3, 2.1 x 50 mm,1.8 μm 色谱柱温度 : 40 C 样品温度 : 4 C 流速 : 0.6 ml/min 流动相 A: 10 mm 甲酸铵 + 0.1% 甲酸水溶液 流动相 B

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1 Evelyn Goh Waters Pacific, Singapore 应用优势此方法可同时分析 12 种水溶性维生素 : n 替代耗时的单一化合物微生物测定法 n 在复杂基质中如婴幼儿配方奶粉里检测低浓度目标物 ( 尤其是维生素 B 12 ) 简介维生素是一种微量元素, 由于人体内无法对其进行合成, 只能通过食物摄取 婴幼儿配方奶粉中的维他命元素对婴幼儿的健康成长尤为重要, 尤其对无法进行母乳喂养 将配方奶粉作为主要营养来源的婴儿而言 官方的水溶性维生素检测方法以程序化为基础, 主要是微生物鉴定法, 此方法已使用了近十年 为达到提取目的, 需对每种维生素都进行单独分析, 进而测定其在食物里的总含量 这通常需耗费大量时间 n 一次分析便可同时获得 MRM 和全扫描 数据 使用一种检测方式同时分析添加营养元素的婴幼儿配方奶粉中的维生素十分困难, 原因在于 : n 维生素结构多样, 化学成分复杂 n 维生素含量低 n 基质复杂 n 光和热下不稳定 n 溶解性问题 n 配方奶粉中浓度范围广 在此应用文献中, 我们将介绍一种只需五分钟的快速 UPLC /MS/MS 质谱检测法, 利用 ESI 正模式同时检测婴幼儿配方奶粉中的 12 种水溶性维生素 实验在样品准备和分析阶段, 所有溶剂均储存在低于 5 C 的避光处 维生素标准溶液每日制备 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC 系统 Xevo TQ MS MassLynx TM 软件 TargetLynx TM 应用软件 IntelliStart 技术 RADAR 关键词水溶性维生素, 维生素 C B3 B6 B12 B1 B9 B2 B7 1

2 液相条件 LC 系统 : ACQUITY UPLC 系统 色谱柱 : ACQUITY UPLC HSS T3, 2.1 x 50 mm,1.8 μm 色谱柱温度 : 40 C 样品温度 : 4 C 流速 : 0.6 ml/min 流动相 A: 10 mm 甲酸铵 + 0.1% 甲酸水溶液 流动相 B: 10 mm 甲酸铵 + 0.1% 甲酸甲醇溶液 标准添加法当无法获得空白试样时, 婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的定量分析将通过标准添加法进行,( 烟酰胺除外 )* 在试样中添加已知浓度( 标准溶液 ) 的分析溶液, 使任何基质效应都可在校准时消除 分析员最初并未知道试样中分析物的含量, 但可对加入的标准溶液的含量以及加入标准溶液后仪器响应的变化进行追踪 因此, 通过校准曲线外推法可测定试样中分析物的浓度 实践中, 标准溶液的添加体积需保持在少量水平, 以避免样品基质的稀释 * 试样基质使用现有稀释系数 ( 见实验步骤 ), 无标准品添加, 仪器对婴幼儿配方奶粉中烟酰胺 (B3) 的响应接近检测器饱和值 如果标准添加法用于烟酰胺, 将使检测器达到饱和 梯度 : 时间 ( 分钟 ) %A %B 总运行时间 : 5.0 分钟 注入量 : 10 μl, 全充满定量环 质谱条件 MS 系统 : Xevo TQ MS 离子化 : ESI+ 毛细管电压 : 1.0 kv 源温度 : 150 C 脱溶剂温度 : 600 C 脱溶剂气 : 1200 L/hr 采集 : 多反应监测 (MRM) 及 RADAR 全扫描 碰撞气 : 氩气 3.5 x 10-3 mbar 试样准备 萃取和标准添加按婴幼儿配方奶粉包装说明上的三倍浓度进行制备 将 10 毫升婴幼儿配方奶粉溶液放入用箔覆盖的聚丙烯 (PP) 管中 ; 加入 20 毫升 100% 浓度的乙醇 摇晃混匀 2 分钟, 以 3500 RPM 的速率离心 15 分钟 上清液用 0.45μmPVDF 滤膜过滤 将 20μL 上清液转移至样品瓶, 加入 10μL 含 11 种分析物的已知标准浓度溶液, 样品瓶加水至 1 毫升 ( 将试样基体中的分析物稀释 50 倍 ; 标准溶液中的分析物最终稀释 100 倍 ) 溶液中烟酰胺标准曲线单独制备 通过 LC/MS/MS 进行分析 采集和数据处理方法通过 MassLynx 软件 v.4.1 版本获取数据, 使用 TargetLynx 应用管理软件进行数据处理 使用 IntelliStart 技术对 12 种目标维生素进行自动 MRM 采集方法优化 IntelliStart 只需输入复合物的基本信息, 即可自动找到母离子, 优化锥孔电压, 找到子离子并优化碰撞能量 2

3 每种维生素的 2 个 MRM 通道均已得到优化 ; 第一个通道为定量离子通道, 第二个通道 为定性离子通道 通道的驻留时间自动得到优化, 每个色谱峰最少有 12 点以保证定量重现性 分析物的 MRM 通道 锥孔电压 碰撞能量 以及保留时间详见下表 1 分析物 母离子 (m/z) 子离子 1/ 子离子 2(m/z) 锥孔电压 (V) 碰撞能量 1/ 碰撞能量 2(eV) 保留时间 ( 分钟 ) 抗坏血酸 C 硫胺素 B 烟酸 B 吡哆醛 B 吡哆醇 B 烟酰胺 B 泛酸 B 氰钴胺 B 叶酸 B 核黄素 -5'- 磷酸 B 生物素 B 核黄素 B 表 1. 检测水溶性维生素的 LC/MS/MS 参数 除 MRM 数据外, 使用 Xevo TQ MS 的 RADAR 模式可获得全扫描数据 RADAR 是一种可获得丰富信息的采集方法, 获取 MRM 数据的同时可实时获取试样基质的背景质谱信息 使用 RADAR 不会影响 MRM 数据的质量 3

4 结果与讨论 ACQUITY UPLC 系统结合 Xevo TQ MS 的 ESI 正离子模式成功分析了 12 种水溶性维生素 使用 ACQUITY UPLC 可在 5 分钟内快速分离所有分析物, 包括 1 分钟平衡时间, 详见图 1 在同一分析检测中, 使用 Xevo TQ MS 的 RADAR 模式监测婴幼儿配方奶粉基质中化合物的全扫描质谱信 息 RADAR 利用 Xevo TQ MS 的快速采集速率获取全扫描 MS 数据, 且同时在 MRM 模式下得到足够的分析 物峰点数, 以准确定量和定性 通过 RADAR 可观察试样基质中的杂质, 并了解可能造成基质效应的化合物含量和类别 这对 LC-MS/ MS 方法开发过程中优化方法以降低基质影响带来帮助 例如, 可通过调整分离方法使得目标峰与可能引起基质影响或离子抑制的区域分离 图 1 中插入部分为从婴幼儿配方奶粉试样基质全扫描数据中提取的质谱图 Pyridoxine Biotin Thiamine Pyridoxal B3- C acid B3-amide Pantothentic acid B2-5P B12, B9 Riboflavin Infant Formula Matrix 图 1. RADAR 技术可通过一次分析同时获取 MRM 和全扫描数据 样品基质中非目标物质谱图如嵌入的全扫描数据所示 4

5 此方法检测了两种不同大众品牌的婴幼儿配方奶粉 图 2 显示的是从其中一种品牌里提取的水溶性 维生素定量离子色谱图 Ascorbic 抗坏血酸 C acid (C) Pantothenic 泛酸 (B5) acid (B5) Thiamine 硫胺素 (B1) (B1) Cyanocobalamin 氰钴胺 (B12) Pyridoxal 吡哆醛 (B6) (B6) Folic 叶酸 (B9) acid (B9) Pyridoxine 吡哆醇 (B6) (B6) Biotin 生物素 (B7) Nicotinamide 烟酰胺 (B3) (B3) Riboflavin 核黄素 (B2) (B2) 图 2. 婴幼儿配方奶粉里提取的水溶性维生素定量离子色谱图 回收率与重现性通过比较提取前加标样品和提取后加标样品得到回收率 实验分两天检测两种不同品牌的婴幼儿配方奶粉, 每日重复进行 6 次 每种婴幼儿配方奶粉的大部分化合物都达到了 90% 的提取回收率, 吡哆醛 叶酸和核黄素 -5 - 磷酸除外, 回收率相对较低的主要原因是上述物质的水溶性较差 尽管婴幼儿配方奶粉是一种非常复杂的基质,6 个重复样的相对标准偏差 (RSDs) 仍然都低于 5% 这 显示了该方法的高重现率以及稳定性 5

6 分析物 加标水平 (ng/g) 平均回收率 (%) 配方奶粉 A %RSD (n=6) 平均回收率 (%) 配方奶粉 B %RSD (n=6) 抗坏血酸 C 硫胺素 B 烟酸 B 吡哆醛 B 吡哆醇 B 烟酰胺 B 泛酸 B 氰钴胺 B 叶酸 B 核黄素 -5'- 磷酸 B 生物素 B 核黄素 B 表 2. 两种婴幼儿配方奶粉产品提取前加标样本的回收率和水溶性维生素 RSDs 百分比 线性和定量 线性动态范围 灵敏度和适合性可通过标准添加法进行评测 标准添加法的一大优势是可避免测定基质效应, 消除离子抑制的影响 得到相关系数 0.99 的较好线性关系, 如表 3 所示, 所有进行分析的婴幼儿配方奶粉浓度范围不同 : 抗坏血酸 (C) 为 ng/ml; 氰钴胺 (B12) 为 ng/ml; 其余分析物为 1 到 100 ng/ml 数据 3 显示的是以标准添加法为基准的一种婴儿配方奶粉抗坏血酸 (C) 和氰钴胺 (B12) 的校正曲线 y = x R 2 = 图 3. 使用标准添加法的 A 配方奶粉的抗坏血酸和维生素 B12 校正曲线 6

7 校正曲线为外推法, 由于考虑到稀释因素 (50 x),x 轴截距绝对值显示婴幼儿配方奶粉中分析物的浓度 Xevo TQ MS 的灵敏度让我们可稀释样本以降低基质效应, 同时仍可检测到目标化合物 分析物 R 2 浓度计算 (ng/g) 抗坏血酸 C 硫胺素 B 烟酸 B 无 吡哆醛 B 吡哆醇 B 烟酰胺 B 泛酸 B 氰钴胺 B 叶酸 B 核黄素 -5'- 磷酸 B 无 生物素 B 核黄素 B 表 3. 校正曲线相关系数 (R2), 以定量为基础,A 配方奶粉中水溶性维生素的浓度计算 7

8 结论一个使用 ACQUITY UPLC 与 Xevo TQ MS ESI 正模式 5 分钟快速测定法, 用于同时分析 12 种水溶性复合维生素 此法替代了耗时的维生素单独分析法 通过将不同维生素分析法融为一体, 实验室可提高试样分析量 减少容积消耗 降低运作成本 Xevo TQ MS 的高灵敏度可实现在非常复杂的基质中检测低浓度目标分析物 ( 尤其是氰钴胺 ), 如婴幼儿配方奶粉 Xevo TQ MS 可达到低定量限, 稀释试样来降低基质效应 参考文献 1. AOAC Official Method , Microbiological Method for Analysis of Vitamin B6 (Pyridoxine, Pyridoxal, Pyridoxamine) in Ready-to-feed Milk-based Infant Formula. 2. AOAC Official Method , Microbiological Turbidimetric Method of Pantothenic Acid in Milk-based Infant Formula. RADAR 技术可监测基质干扰, 杂质和样品中的降解物, 同时准确定量目标 分析物 分析员在检测基质效应时便可做出准确决策, 并可准确评价基质效应是否有存在 IntelliStart 技术简化系统准备和 MRM 方法开发, 确保所有层次的科学家均可快速准确地操作仪器, 生成最高质量的可重现的 UPLC/MS/MS 数据 Waters,ACQUITY UPLC 和 Xevo 是沃特世公司的注册标 MassLynx TargetLynx RADAR IntelliStart 和 The Science of What s Possible 是沃特世公司商标 所有其他商标属于各自的所有者 2010 沃特世公司中国印刷 2010 年 11 月 ZH 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司沃特斯中国有限公司 北京 : 上海 : 广州 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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