大同大學數位論文

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1 從日本市場之優酪乳篩選抗食品中毒致病菌之乳酸菌 Screening of the Lactobacillus species from the commercial yogurt in Japan that can inhibit growth of pathogenic bacteria in food. 研究生 : 陳文姈 (Wen-Lin Chen) 指導教授 : 段國仁 (Prof. Kow-Jen Duan) 大同大學 生物工程研究所 碩士論文 Thesis for Master of Science Department of Bioengineering Tatung University 中華民國九十八年七月 July 2009

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3 誌謝感謝恩師段國仁博士於研究所期間的悉心指導, 自論文架構之建立 研究方法之確認 實驗結果之探討與論文內容之批閱, 無不詳加校閱與指證, 使得本論文能順利完成, 在此僅以最誠摯的心表達由衷的感激 論文初稿提交之後, 承蒙顏聰榮教授及台大農化系蘇南維教授於百忙中撥冗校閱, 並於口試時悉心指正, 使論文更臻完善, 在此致上最深的謝意 研究期間, 感謝林佳俐同學 郭洲獎學長在實驗方面的大力協助 並感謝公司同事高珮琪小姐 吳美蘭小姐 鍾愛嵐小姐 許煒南先生在實驗 電腦及論文書寫上的幫助與建議, 令我受益良多, 感激不盡 最後, 僅將此論文獻給我親愛的父母與家人, 感謝他們在生活上及精神上的包容 支持與鼓勵, 使我能無後顧之憂的追求知識並完成學業, 再次感謝曾經幫助過我的所有人 陳文姈謹誌 大同大學生物工程研究所 中華民國九十八年七月 i

4 中文摘要本研究從日本市售五種品牌優格 (Yogurt) 中分離出六株乳酸菌, 並利用 API 50 CHL 鑑定出菌種,A 品牌為 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei,b 品牌為 Lactobacillus acidophilus,c 品牌為 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,d 品牌為 Lactobacillus pentosus,e 品牌有兩株, 分別標示為 E-1 E-2;E-1 鑑定為 Lactobacillus plantarum,e-2 鑑定為 Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii 六株乳酸菌在 MRS 培養基中, 進行培養, 其細胞濃度以 OD 600nm 表示,Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 之 OD 600nm 值為 8.5±0.9,Lactobacillus acidophilus 之 OD 600nm 值為 6.2±0.4, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 之 OD 600nm 值為 7.4±0.8,Lactobacillus pentosus 之 OD 600nm 值為 9.7±0.9,Lactobacillus plantarum 之 OD 600nm 值為 9.6±0.7, Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii 之 OD 600nm 值為 6.6±1.4 這些利用 MRS 培養出來的乳酸菌對大腸桿菌 沙門氏桿菌之抑制能力最佳, 對金黃色葡萄球菌 仙人掌桿菌 志賀氏菌之抑制能力次之, 對腸炎弧菌則沒有顯著的抑制能力 將本研究之乳酸菌發酵液的 ph 值調整到 ph 5.0 以上, 結果發現對於測試的 E. coli 並無任何抑菌效果, 此結果證明本研究之乳酸菌發酵液之抑菌效果來自於發酵所產生的乳酸與醋酸等代謝產物 ii

5 Abstract We isolated 6 Lactobacillus species from five commercial yogurts (A, B, C, D, E) of Japanese market. The strains were identified to be Lactobacillus paracasei ssp. paracasei (A), Lactobacillus acidophilus (B), Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (C), Lactobacillus pentosus (D), and Lactobacillus plantarum (E-1), Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii (E-2) by API 50. The strains were cultured in MRS medium, and the cell concentrations by OD 600nm were 8.5±0.9, 6.2±0.4, 7.4±0.8, 9.7±0.9, 9.6±0.7, 6.6±1.4, respectively, for Lactobacillus paracasei ssp. paracasei (A), Lactobacillus acidophilus (B), Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (C), Lactobacillus pentosus (D), Lactobacillus plantarum (E-1), Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii (E-2). Lactobacillus species performed the most inhibition activity to E. coli, Salmonella, followed by Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, and Shigella. There was no significant inhibition activity to Vibrio parahaemolyticus. The ph of the fermentation broth was adjusted to above 5.0, and inhibition activity for the broth to E. coli was no longer existed. We concluded that the inhibition activity was from the metabolites such as lactate and acetate in the broth. iii

6 目錄 誌謝...i 中文摘要...ii 英文摘要... iii 目錄...iv 圖目錄...vi 表目錄...vii 第一章前言 緒論 研究動機與目的 文獻探討 乳酸菌之特性 分類及應用 特性 分類 應用 乳酸菌之抗菌作用 食品中毒致病菌之介紹...10 第二章材料與方法 材料 五種優酪乳商品 試驗之食品致病菌菌株 菌株培養基 實驗材料 儀器 方法 乳酸菌菌株 乳酸菌菌株之培養及鑑定 API 50 CHL 操作步驟 乳酸菌 OD 值之測試 食品致病菌菌株之培養 抗菌實驗...26 第三章結果與討論 篩選之日本市售乳酸菌之鑑定 篩選之日本市售乳酸菌對於抑制食品致病菌之效果 篩選之日本市售乳酸菌對 Escherichia coli 之抑菌效果 篩選之日本市售乳酸菌對 Staphylococcus aureus 之抑菌效果...33 iv

7 3.2.3 篩選之日本市售乳酸菌對 Bacillus cereus 之抑菌效果 篩選之日本市售乳酸菌對 Shigella 之抑菌效果 篩選之日本市售乳酸菌對 Salmonella 之抑菌效果 篩選之日本市售乳酸菌對 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 調整 ph 值後之發酵液對於 E. coli 之抑菌效果 討論...44 第四章結論...47 參考文獻...48 附錄...51 v

8 圖目錄 圖一 抗菌實驗步驟...27 圖二 五種日本市售優酪乳產品及篩選之乳酸菌 圖三 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果...51 圖四 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果 ( 重複圖三之實驗 )..52 圖五 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 圖六 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 ( 重複圖五之實驗 )..54 圖七 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果...55 圖八 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 ( 重複圖七之實驗 )...56 圖九 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果...57 圖十 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果 ( 重複圖九之實驗 )...58 圖十一 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果...59 圖十二 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果 ( 重複圖十一之實驗 ) 圖十三 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果...61 圖十四 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 ( 重複圖十三之實驗 )...62 圖十五 調整 ph 值後之發酵液對於 E. coli 之抑菌效果...63 圖十六 調整 ph 值後之發酵液對於 E. coli 之抑菌效果 ( 重複圖十五之實驗 ) 圖十七 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度平均值...46 vi

9 表目錄 表一 五種日本市售優酪乳商品...14 表二 食品致病菌菌株之培養條件...25 表三 日本市售乳酸菌之菌種鑑定結果 表四 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度...31 表五 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果...32 表六 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果 ( 重複表五之實驗 )..32 表七 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度...33 表八 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果.. 34 表九 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 ( 重複表八之實驗 )..34 表十 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度...35 表十一 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果...36 表十二 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 ( 重複表十一之實驗 )..36 表十三 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度...37 表十四 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果...38 表十五 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果 ( 重複表十四之實驗 )...38 表十六 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度...39 表十七 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果...40 表十八 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果 ( 重複表十七之實驗 )...40 表十九 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度...41 表二十 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 vii

10 表二十一 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 ( 重複表二十 之實驗 ) 表二十二 乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 ph 值及調整後之 ph 值...43 viii

11 第一章前言 1.1 緒論自古以來, 乳酸菌就與人類生活息息相關, 在食品工業 醫藥 環保上, 乳酸菌是被廣泛利用的微生物之一, 如各種乳酸菌飲料 乾酪 醃漬物 整腸藥 產生香味 去除異味及生物轉換等都會利用乳酸菌 ( 李,2000; 廖,1998) 人類在數千年以前就已經知道乳酸發酵食品具有保存性及健康方面的好處, 但是乳酸發酵所產生的變化, 直到西元 1857 年, 法國微生物學家巴斯德 (Louis Pasteur) 發現酸奶中有微小生物體存在, 將其定名為 levue lactique" 西元 1873 年, 李斯特 (Joseph Lister) 利用稀釋法, 由酸乳中純化分離出 Bacterium lactis, 此乃目前之 Streptococcus lactis, 為最早被分離出來的乳酸菌 ( 廖等,2000) 西元 1901 年, 貝杰林克 (Beijernick) 首先提出乳酸菌在分類學上之地位, 並定名為 Lactobacillus"( 陳,2003) 乳酸菌 (LAB,Lactic acid bacteria) 即是一種益生菌 (Probiotic), 益生菌係指活的微生物, 能對宿主 ( 如人類 ) 調節黏膜和免疫系統, 同時亦可增進宿主腸道中營養素和微生物相的平衡, 有益於改善宿主的生理功能 目前最常做為益生性微生物之乳酸菌為 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Lactobacillus fermentum Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis 1

12 Lactobacillus lactis 及 Lactobacillus reuteri 等 ( 陳,2003) 乳酸菌為優質的益生菌, 有助人體健康, 其功效有改善乳糖不耐症 下痢 降低膽固醇 預防癌症 抗潰瘍 增強免疫及促進營養等效果 ( 林,2008) 乳酸菌是不耐熱的菌種, 在攝氏 60 度加熱三十分鐘, 乳酸菌就會死滅, 若為攝氏一百度以上, 則僅僅數秒就會死滅 因此為確保乳酸菌之活性, 必須注意保存在低溫環境下 另外, 乳酸菌經由口腔進入胃中, 其中絕大多數的乳酸菌會被胃酸所破壞, 接著進入腸道 腸胃道是一個菌相複雜的開放系統, 存在有 19 屬 300~400 種以上的微生物, 其數目高達 ~10 14 CFU/ml 腸道菌群會因為環境 生理 膳食等因子影響而有所差異, 可將其歸類為四大類, 包括 :(1) 受宿主本身特性所影響的因素, 如宿主的生理狀況, 諸如老化 壓力 健康情形以及人種族群間的差異等, 或是腸道內環境與消化狀態, 例如腸道內的酸鹼值 營養基質的利用性 氧化還原電位 食物通過腸胃道的時間等 (2) 與腸道微生物本身特性有關的因素, 如吸附性 運動性或世代時間等 (3) 受到微生物間交互作用影響的因素, 包括微生物間的協同作用 (synergy), 以及拮抗 刺激作用 (antagonism / stimulation) (4) 膳食因素, 諸如飲食習慣 藥物的服用等 定殖於人體腸胃道內的微生物, 對於健康具有決定性的影響, 在代謝 營養物質吸收及疾病預防上都扮演重要角色 ( 黃,2004) 2

13 由於乳酸菌屬於 一般公認安全 (GRAS,generally recognized as safe) 之菌株, 除了在發酵食品中是廣為利用的一群細菌之外, 最被人們研究討論者就是其在食品工業上的抑菌作用, 乳酸菌所產生的代謝物, 包括乳酸 醋酸等有機酸 (organic acid), 另外還有二氧化碳 (carbon dioxide, CO 2 ) 過氧化氫(hydrogen peroxide, H 2 O 2 ) 雙乙醯(diacetyl) 洛德因系統 (reuterin system) 及細菌素 (Bacteriocin) 等均可產生抑菌的效果, 在食品上應用最廣的天然細菌素就是乳酸鏈球菌素 (nisin)( 呂和龍,2003; 廖等,2000) 許多乳酸菌細菌素是由食品中分離的乳酸菌產生, 但這些細菌素並非在所有的食品系統中均有抗菌的效用 因為食品的理 化特性 環境條件 細菌素使用的濃度及作用時間等因素均會影響細菌素的抗菌活性 ( 龍,2004) 3

14 1.2 研究動機與目的本論文之實驗目標為探討從日本市場購買之優酪乳篩選抗食品中毒致病菌之乳酸菌, 了解其實際之表現及效果, 研究成果希望可有效的抑制腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus ) 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 仙人掌桿菌(Bacillus cereus) 沙門氏桿菌 (Salmonella) 大腸桿菌(Escherichia coli) 及志賀氏菌 (Shigella) 等食品致病菌對人體之危害, 降低食品中毒的機率, 對於食品保鮮 食品儲存及食品衛生安全有所助益 4

15 1.3 文獻探討 乳酸菌之特性 分類及應用 特性乳酸菌 (LAB,Lactic acid bacteria) 是相當龐大的菌群, 在定義上較為廣泛 共同特性是指可發酵六碳糖產生乳酸的菌株, 且因缺乏電子傳遞系統 (electron transport system) 或細胞色素 (cytochrome), 而無法進行檸檬酸循環 (citric acid cycle) 來取得細胞所需要的能量, 因此, 乳酸菌的能量需藉由基質磷酸化 (substrate-level phosphorylation) 而獲得能量 ( 龍,2004;Daeschel, 1989;Jay, 2000;Hammes and Tichaczek, 1994;Kim et al., 2003;Klaenhammer et al., 2002) 乳酸菌通常具下述共同特性 : (1) 革蘭氏陽性菌 ( 無運動性 不產孢 ) 營養需求複雜 (2) 依外觀形態分為球菌和桿菌 (3) 需有碳水化合物 胺基酸 核酸衍生物 維生素及多種生長素等養分才可生長 (4) 通常缺乏過氧化氫酶 ( 觸酶 ) 活性及細胞色素, 為厭氧 微好氧 耐氧厭氧性或兼性厭氧菌, 一般可於有氧環境生長, 但以無氧狀態生長較佳, 也有絕對厭氧者 5

16 乳酸菌依代謝途徑及最終產物之不同, 可分為同型發酵 (homofermentation) 乳酸菌及異型發酵 (heterofermentation) 乳酸菌 同型發酵乳酸菌為將碳水化合物經由醣解作用 (glycolysis) 分解成丙酮酸 (pyruvate) 後, 直接還原成約 90~100% 之乳酸, 例如大部分的 Lactobacillus Lactococcus Pediococcus Streptococcus 及 Vagococcus 等 異型發酵乳酸菌除了經醣解作用產生約 45~50% 理論值之乳酸外, 也可經由 phosphoketolase 作用, 產生酒精及二氧化碳等其他產物, 例如部分的 Lactobacillus Bifidobacterium Carnobacterium Leuconostoc Oenococcus 及 Weissella 等 ( 黃,2005; 方等,2003; 廖,1998;Klein et al., 1998;Magnusson et al., 2002) 分類隨著分子分類科學的進步, 乳酸菌之分類更為清晰自然, 使得廣義之乳酸菌至 1999 年底為止擴增至 16 個菌屬, 分別為肉品桿菌屬 (Carnobacterium) 酒球菌屬(Oenococcus) 腸球菌屬(Enterococcus) 小球菌屬 (Pediococcus ) 乳酸球菌屬(Lactococcus ) 鏈球菌屬 ( Streptococcus ) 乳酸桿菌屬(Lactobacillus ) 徘徊球菌屬 ( Vagococcus ) 四體球菌屬(Tetragenococcus ) 雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) 有孢子乳桿菌屬(Sporolactobacillus) 明串球菌屬 (Leuconostoc) 乳球形菌屬(Lactosphaera) 魏斯氏菌屬(Weissella) 6

17 奇異菌屬 (Atopobium) 營養缺陷菌屬(Abiotrophia) ( 李,2000;Wood, 1992;Axelsson, 1998) 此種分類之主要依據為 DNA 相似性和 RNA 序列相似性, 使傳統上形質特性無法判斷之菌屬, 都可較為明確獨立成一群, 並賦予分類上之位置 ( 黃,2004; 李,2000;Jay, 2000) 應用乳酸菌長久以來即廣泛應用於發酵食品製造, 例如運用乳酸菌做為穀類 牛奶 肉類 黃豆 蔬菜和橄欖等食品原料之發酵菌酛, 進而開發生產各式發酵製品, 包括麵包 酒 可可 香腸 肉製品 味噌 泡菜以及發酵乳等 ( 黃,2004; 陳,2003;Hansen, 2002) 發酵乳是目前乳酸菌的主流產品, 產品的功能訴求大多集中在活菌本身 及以乳品作為原料所提供的營養素為主 但近年來, 乳酸菌的應用已朝向更多元化的發展 由於生物技術的快速發展, 對乳酸菌的研究已擴展到活菌體以外的領域, 包括乳酸菌的生物轉化能力, 例如把碳源或脂肪類化合物轉化為保健功效成份, 或農產品等原料經乳酸菌發酵後強化產品的特性 又如 Lactobacillus 菌種可作用甘油變成丙烯醛 ; 木糖變成異木糖, 藉此生產高附加價值產物, 其發展極有前途 ( 廖,1998) 再者, 可利用乳酸菌作為綠色環保微生物製劑 由此可知, 乳酸菌不只研究領域多元化, 在功能訴求 使用方式及產品種類也多元化 7

18 乳酸菌在發酵過程中所產生的代謝物質, 除了會影響食品的質地 風味與保存性之外, 有些代謝產物還具有機能性 這些物質包括完整的死菌體 細胞組成份以及經由發酵過程產出的胜肽 胞外多醣 脂肪類物質等 ( 陳,2008) 由於乳酸菌屬於 一般公認安全 (GRAS,generally recognized as safe) 之菌株, 使得乳酸菌可廣泛應用在食品工業 ; 再者, 有些乳酸菌具有降低膽固醇 抗癌 抗潰瘍及調節免疫等功效 ( 林,2008) 8

19 1.3.2 乳酸菌之抗菌作用乳酸菌對碳水化合物發酵的結果, 會產生乳酸 醋酸等有機酸, 主要為乳酸, 而這些酸類的蓄積, 可降低環境 ph, 對革蘭氏陽性菌及陰性菌產生廣效性的抑制活性 ( 陳,2006) 乳酸菌本身缺乏過氧化氫酵素, 故食品中如有乳酸菌存在時, 過氧化氫會蓄積於食品中, 過氧化氫的蓄積量視菌種及氧的含量而定, 過氧化氫的強烈氧化作用會破壞細胞蛋白質的基本結構, 或與他種細胞物質及環境中的其他成分反應, 產生額外的抑制性物質, 而產生殺菌效應 ( 呂和龍,2003) 乳酸菌具有產生多種細菌素 (Bacteriocin) 的能力, 這些細菌素包括代謝產物 類似抗生素物質及滅菌蛋白質 細菌素具有不同作用特性, 它可自然產生或可經誘導後產生, 而主要的決定因子在於基因 ( 陳, 2003) 在乳酸菌所產生的細菌素有些為多胜肽分子, 有些則為小分子之蛋白質, 目前所知, 均可被人類消化管中之消化蛋白酶分解, 且分解物對人體不具毒性, 因此可應用在食品中做為天然防腐劑, 而目前在食品加工上應用最廣者即為 nisin( 呂和龍,2003; 廖等,2000) 9

20 1.3.3 食品中毒致病菌之介紹台灣地處於亞熱帶, 一年四季從早到晚的溫度均適合細菌繁殖, 尤其以春夏季發生食品中毒率較高, 因此若食用放在 4~65 之間, 超過 4 小時以上的食物, 只要食物曾經細菌污染, 均可能引發食品中毒事件 探究食品中毒的病因物質, 以細菌性中毒為主, 依據衛生署統計資料民國九十七年台灣地區食品中毒發生狀況為例, 腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 居第一位, 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 居第二位, 仙人掌桿菌 (Bacillus cereus) 居第三位 ( 行政院衛生署食品資訊網,2009) (1) 腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus): 目前此菌所引發的食品中毒, 在台灣地區的發生率排名第一 腸炎弧菌為革蘭氏陰性菌, 短桿狀, 呈輕微彎曲, 菌體一端具鞭毛, 活動性強, 兼性厭氧菌, 屬好鹽性於 2~5% NaCl 溶液中生長情形良好 在環境適宜的食品中, 每 10~12 分鐘即可增殖一倍 主要分佈於近海河口及海底泥沙中, 因此生鮮魚貝類常帶有這種細菌 可引起下痢 激烈腹痛 嘔吐 發燒等症狀 預防方法為利用此菌為嗜鹽性無法於淡水中存活的特性 ( 在淡水中 1~4 分鐘便有 90% 死亡 ), 可用自來水充分清洗以除去該菌 ; 對低溫極敏感, 可於低溫冷藏防止細菌繁殖 ; 食用前應充分加熱煮 10

21 熟, 絕對避免生食 ; 避免二次污染, 砧板 刀具及容器應標示區別生 熟食用 腸炎弧菌食品中毒只要遵守清潔 加熱 冷藏三大原則, 幾乎可完全防止 (2) 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus): 葡萄球菌 (Staphylococcus) 是細菌性食品中毒中極為重要的細菌之一, 是典型的毒素型食品中毒 此菌為革蘭氏陽性, 呈球形 串狀型態, 兼性厭氧菌, 最適生長溫度為 37, 但於 15~40 亦能繁殖 金黃色葡萄球菌常存於人體皮膚 口腔 鼻黏膜 糞便 化膿的傷口都會附著, 尤其是化膿的傷口更是主要污染源, 因此極易經由人體而污染食品 主要症狀為嘔吐 腹瀉 下痢 虛脫 預防方法為身體有化膿 傷口 咽喉炎 溼疹者, 一定不可直接或間接從事接觸食品的工作 ; 調理時應戴帽子及口罩, 注意手部的清潔及消毒 ; 食品如不立即供食時, 應保存於 5 以下 (3) 仙人掌桿菌 (Bacillus cereus): 又名蠟狀芽胞桿菌, 為革蘭氏陽性桿菌, 形成卵圓形芽胞, 具耐熱性, 兼性厭氧菌, 最適生長溫度為 30, 但於 10~45 亦可繁殖 本菌廣泛分佈於自然界, 大量煮熟米飯置於室溫貯放 ( 保溫之溫度未達 60 以上 ) 為最常見之傳染途徑, 可由細菌本身或其產生之毒素致病 可引起噁心 嘔吐 腹痛及腹瀉等症狀 預防方法為避免食品遭受污染 ; 食物烹調後儘速食用, 避免 11

22 於室溫儲存過久, 且食品如不立即食用, 應放入冰箱中冷藏保存, 食用前應加熱到 60 以上, 以確保安全 (4) 沙門氏桿菌 (Salmonella): 本菌為革蘭氏陰性桿菌, 無芽胞, 具有鞭毛善於運動, 好氣性或兼性厭氧菌, 在酸性環境下 (ph<4.5), 生長會被抑制 此菌廣泛分佈於自然界中, 可經由被感染動物的糞便直接污染食品 沙門氏桿菌的食物中毒通常是食入含有高菌量之食物所引起, 常引起感染性腸胃炎, 其產生的症狀包括噁心 嘔吐 腹痛 腹瀉及發燒 預防方法為食物必須充分加熱, 避免肉類生食 ; 注意手部衛生, 烹調食品前應先清潔手部 ; 撲滅或防止鼠 蠅 蟑螂等病媒侵入調理場所, 且不可於調理場所飼養動物 (5) 大腸桿菌 (Escherichia coli): 大腸桿菌在衛生學上, 常被用做飲水 食品的衛生檢驗指標 此菌為革蘭氏陰性菌桿菌, 具鞭毛, 可運動, 於有氧或無氧狀態下皆可生長, 適合生長的溫度為 37, 耐熱性差, 一般烹調溫度即可殺死 大腸桿菌分佈於人體或動物體腸管內, 藉由已受感染人員或動物糞便而污染食品或水源 主要症狀為下痢 腹痛 嘔吐及發燒 引起食物中毒的病原性大腸桿菌 (Enteropathogenic E.coli), 大部分會分泌腸毒素 (enterotoxins), 常會造成旅遊者腹瀉 (traveler s diarrhea)( 鍾等,2002) 預防方法為徹底處理食物中毒者的糞便, 避免由人經由感染者的糞便再污染食 12

23 品, 所以已被感染的人員不要接觸食品的調理工作 飲用水及食品應加熱處理, 定期實施水質檢查 ; 食品器具及容器必須徹底消毒及清洗 (6) 志賀氏菌 (Shigella): 又稱為桿菌性痢疾 (bacillary dysentery), 為革蘭氏陰性桿菌, 無芽胞及鞭毛, 不具運動性, 菌落圓形, 兼性厭氧菌, 最適生長溫度為 37, 但於 15~40 亦可繁殖 此菌只存在體內, 主要棲息在被糞便污染的水中, 並藉由人與人的接觸傳染疾病 不良的個人衛生是導致食物引起的志賀氏桿菌病的共同原因, 主要的媒介食物有海鮮 水果 蔬菜 雞肉及沙拉等, 這些食物是以糞便 口腔連徑而受到感染的 由於感染菌量只要低至 10 cfu 就會在敏感性個體上引起感染 ( 方等,2003), 因此在環境衛生條件較差或者不注重個人衛生的社區團體裡, 很容易造成群突發傳染 臨床特徵為腹絞痛 水樣的腹瀉 發燒和血便 為了防止志賀氏菌食物中毒, 必須養成良好的衛生習慣, 飯前便後必須徹底用肥皂洗手 ; 污水處理確實管控 ; 隔離病患及排泄物消毒 ; 檢查症狀不明之病例, 尤其是食物處理者, 均要做好預防及管制工作 ( 鍾等,2002; 方等,2003; 行政院衛生署食品資訊網,2009) 13

24 第二章材料與方法 2.1 材料 五種優酪乳商品 本實驗所選用的乳酸菌菌株是由本校 段國仁教授從日本市場購 買五種優酪乳商品, 商品名稱如下, 分別以 A~E 為代碼來表示 : 表一 五種日本市售優酪乳商品 代碼 A B C D E 優酪乳商品名稱 Yakult ソフールプレーン MEIJI 明治プロビオヨーグルト LG21 北海道クリームチーズヨーグルト KAGOME 植物性乳酸菌ラブレ小岩井まきばヨーグルトこだわりクリーミー 14

25 2.1.2 試驗之食品致病菌菌株仙人掌桿菌 (Bacillus cereus BCRC10603) 購買自新竹食品工業發展研究所 (FIRDI,Food Industry Research and Development Institute) 生物資源保存及研究中心 (BCRC,Bioresource Collection and Research Center) 另外, 以下五種食品致病菌菌株由本實驗室先前的實驗所留下來的菌種, 分別為 : 大腸桿菌 (Escherichia coli) 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 志賀氏桿菌 (Shigella) 沙門氏桿菌(Salmonella) 腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 15

26 2.1.3 菌株培養基 (1) LB broth(luria-bertani broth): 購自 Difco,USA Ingredient Yeast extract Peptone from casein Sodium chloride Final ph:7.0±0.2 at 25 Per liter 5.0 g 10.0 g 10.0 g (2) LB agar(luria-bertani agar): 購自 Difco,USA Ingredient Yeast extract Peptone from casein Sodium chloride Agar Final ph:7.0±0.2 at 25 Per liter 5.0 g 10.0 g 10.0 g 12.0 g 16

27 (3) NB(Nutrient broth): 購自 Difco,USA Ingredient Peptone from meat Meat extract Final ph:7.0±0.2 at 25 Per liter 5.0 g 3.0 g (4) NA(Nutrient agar): 購自 Difco,USA Ingredient Peptone from meat Meat extract Agar-agar Final ph:7.0±0.2 at 25 Per liter 5.0 g 3.0 g 12.0 g 17

28 (5) TSB(Tryptic soy broth): 購自 Merck,Germany Ingredient Peptone from casein Peptone from soymeal D(+)glucose Sodium chloride Per liter 17.0 g 3.0 g 2.5 g 5.0 g di-potassium hydrogen phosphate 2.5g Final ph:7.3±0.2 at 25 (6) TSA(Tryptic soy agar): 購自 Merck,Germany Ingredient Peptone from casein Peptone from soymeal Sodium chloride Agar-agar Final ph:7.3±0.2 at 25 Per liter 15.0 g 5.0 g 5.0 g 15.0 g 18

29 (7) MRS broth(lactobacilli MRS broth): 購自 Difco,USA Ingredient Proteose peptone No.3 Per liter 10.0 g Beef extract 10.0g Yeast extract 5.0g Dextrose 20.0g Polysorbate g Ammonium citrate 2.0g Sodium acetate 5.0g Magnesium sulfate 0.1g Manganese sulfate 0.05 g Dipotassium phosphate 2.0g Final ph:6.5±0.2 at 25 19

30 (8) MRS agar(lactobacilli MRS agar): 購自 Difco,USA Ingredient Proteose peptone No.3 Per liter 10.0 g Beef extract 10.0g Yeast extract 5.0g Dextrose 20.0g Polysorbate g Ammonium citrate 2.0g Sodium acetate 5.0g Magnesium sulfate 0.1g Manganese sulfate 0.05 g Dipotassium phosphate 2.0g Agar Final ph:6.5±0.2 at g (9) Agar, Granulated( 購自 Difco,USA) 20

31 2.1.4 實驗材料 0.22μm filter 5.0ml 無菌塑膠注射筒 90 15mm Petri dish 50ml 離心管 2.0ml Microtube 2.2 儀器 品名 廠牌 型號 高速離心機 SORVALL RC-5C 分光光度計 JASCO UV/VIS V-530 滅菌釜 HIRAYAMA HA-300MII 無菌操作台 炬安儀器有限公司 TBH-420 培養箱 SHEL LAB 1545 電子天平 AND FX-3000 試管振盪器 THERMOLYNE BT-M

32 2.3 方法 乳酸菌菌株選用段國仁教授從日本購買的五種市售優酪乳商品, 經過培養篩選出六種乳酸菌菌株進行研究 乳酸菌菌株之培養及鑑定取優酪乳商品 1g 培養在 30ml MRS broth 中, 於有氧環境下 37 培養 48 小時, 再取菌液三區劃線於 MRS agar 上, 於 37 經過 48 小時培養出單一菌落 挑取 MRS agar 上之單純菌落接種至 MRS broth 中, 於 37 培養 18~24 小時將菌活化之後, 取新鮮菌液依照 API 50 CHL 操作步驟鑑定出六種乳酸菌菌株進行研究 API 50 CHL 操作步驟 API 50 CHL 之原理 : 在 API 50 CH strip 的各個試驗孔中, 含有 49 種不同的碳水化合物, 可測知細菌對碳源的利用情形 ; 在接種細菌之後, 細菌在其中生長會造成培養基的 ph 值之變化, 由培養基的顏色變化來判定細菌的種類 乳酸菌菌種鑑定之操作步驟敘述如下 : (1) 將培養盒中加入約 10ml 的無菌水, 使盒中保持濕度, 將 API 50 CH strip 放入盒中 (2) 操作之前必須先將菌種活化, 最好為培養 18~24 小時之新鮮純菌落 22

33 (3) 從培養基上挑取數個菌落加入 API 50 CHL Medium 中均勻混合, 菌液濃度調配為 2McFarland, 將此菌液加滿 API 50 CH strip 各個試驗孔的 tube 部分 各個試驗孔的 cupule 部分要覆蓋無菌礦物油 (4) 在有氧環境下 37 培養 24~48 小時 (5) 為防止培養時所產生的氣泡干擾, 可將 strip 的一端稍為墊高, 使氣泡集中在 tube 上半部或下半部 ( 註 : Strip 凹槽分為兩部份 tube 及 cupule) (6) 在 24 小時及 48 小時各作一次判讀 (7) 當培養基中所含的 bromocresol purple 因為 ph 值的轉變而由紅色轉成黃色時, 即為正反應 第 25 號管的 Esculin 試驗, 由紫色轉成黑色亦為正反應 (8) 將結果記錄在 result sheet 上, 再以電腦 API 鑑定網站查詢結果 (API 鑑定網站,2009) 乳酸菌 OD 值之測試挑取 MRS agar 上之單一菌落接種至 25ml MRS broth 中, 於 37 培養 48 小時, 取菌液依比例稀釋, 將分光光度計 OD 值設於 600nm, 使測得數值達 0.1~1.0 之間 23

34 2.3.2 食品致病菌菌株之培養各種食品致病菌菌株分別培養於適當之培養基及溫度, 以便進行後續實驗 詳述如下 : (1) 大腸桿菌 (Escherichia coli): 勾取 LB agar 上之 Escherichia coli 單一菌落接種至 20ml LB broth 中, 於 37 培養 24~48 小時將菌體活化, 備用 (2) 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus): 勾取 LB agar 上之 Staphylococcus aureus 單一菌落接種至 20ml LB broth 中, 於 37 培養 24~48 小時將菌體活化, 備用 (3) 仙人掌桿菌 (Bacillus cereus): 勾取 NA 上之 Bacillus cereus 單一菌落接種至 20ml NB 中, 於 30 培養 24~48 小時將菌體活化, 備用 (4) 志賀氏菌 (Shigella): 勾取 LB agar 上之 Shigella 單一菌落接種至 20ml LB broth 中, 於 37 培養 24~48 小時將菌體活化, 備用 (5) 沙門氏桿菌 (Salmonella): 勾取 LB agar 上之 Salmonella 單一菌落接種至 20ml LB broth 中, 於 37 培養 24~48 小時將菌體活化, 備用 (6) 腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus): 勾取 TSA+2.5%NaCl 上之 Vibrio parahaemolyticus 單一菌落接種至 20ml TSB+2.5%NaCl 中, 於 37 培養 24~48 小時將菌體活化, 備用 24

35 表二 食品致病菌菌株之培養條件 食品致病菌菌株 培養基 培養溫度 大腸桿菌 (Escherichia coli) LB agar LB broth 37 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) LB agar LB broth 37 仙人掌桿菌 (Bacillus cereus) NA NB 30 志賀氏桿菌 (Shigella) LB agar LB broth 37 沙門氏桿菌 (Salmonella) LB agar LB broth 37 腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) TSA(TSB)+2.5%NaCl 37 25

36 2.3.3 抗菌實驗抗菌實驗依照以下之實驗步驟進行 : (1) 先將培養好之乳酸菌菌株離心 (10000 rpm,10min), 取上清液 5ml 用 0.22μm filter 無菌過濾, 備用 (2) 取食品致病菌菌株 1ml 置於 2.0 ml microtube 中, 離心 (10000 rpm,10min) 倒掉上清液 再將已過濾之乳酸菌上清液取 1ml, 加入此含菌體沈澱物之 2.0ml microtube 中, 混合均勻 (3) 取事先已製備好之培養基三區劃線 ( 選用之培養基, 以各個食品致病菌適合生長之培養基為主 ), 每隔 30 分鐘取樣一次作三區劃線培養, 時間點分別為 分鐘 (4) 培養皿倒置於培養箱內, 於適合之培養溫度下, 培養 48 小時, 觀察食品致病菌菌種生長情形 (5) 另外取相同試管之食品致病菌種作三區劃線, 當作對照組 26

37 實驗組對照組 乳酸菌菌株離心 (10000rpm,10min) 取食品致病菌菌株 1ml 取食品致病菌菌株 1ml 取上清液 5ml 0.22µm filter 過濾 置於 2.0ml microtube 離心 (10000rpm,10min) 置於 2.0ml microtube 離心 (10000rpm,10min) 取 1ml 過濾液 倒掉上清液 於 2.0ml microtube 中 混合均勻 混合均勻 培養基三區劃線 每隔 30min 取樣一次, 分別為 0,30,60,90,120min 培養基三區劃線 培養皿倒置 於適合之培養溫度 培養 48 小時 培養皿倒置 於適合之培養溫度 培養 48 小時 圖一 抗菌實驗步驟 27

38 第三章結果與討論 3.1 篩選之日本市售乳酸菌之鑑定從日本市售的五種優酪乳商品, 經過培養 篩選出六種乳酸菌菌株如圖二所示, 再由 API 50 CHL 鑑定得知菌種種名 A 種優酪乳商品鑑定出 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 菌種,B 種優酪乳商品鑑定出 Lactobacillus acidophilus 菌種,C 種優酪乳商品鑑定出 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 菌種,D 種優酪乳商品鑑定出 Lactobacillus pentosus 菌種, 其中 小岩井 這個優酪乳商品鑑定出二種菌種 Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, 分別以 E-1 E-2 表示 ( 參見表三 ) 28

39 五種品牌日本市售優酪乳產品 A 品牌產品及乳酸菌 B 品牌產品及乳酸菌 C 品牌產品及乳酸菌 D 品牌產品及乳酸菌 E 品牌產品及乳酸菌 圖二 五種日本市售優酪乳產品及篩選之乳酸菌 29

40 表三 日本市售乳酸菌之菌種鑑定結果 代碼優酪乳商品名稱乳酸菌菌種 A B C D E-1 E-2 Yakult ソフールプレーン MEIJI 明治プロビオヨーグルト LG21 北海道クリームチーズヨーグルト KAGOME 植物性乳酸菌ラブレ小岩井まきばヨーグルトこだわりクリーミー小岩井まきばヨーグルトこだわりクリーミー Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lactobacillus pentosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii 30

41 3.2 篩選之日本市售乳酸菌對於抑制食品致病菌之效果日本市售優酪乳經培養 篩選後, 鑑定出六株乳酸菌菌種, 以此六株菌分別針對食品致病菌進行抑菌實驗 每次測定不同的食品致病菌之前, 必須先用 MRS 培養一批新鮮的乳酸菌菌株, 再測得 OD 值之後, 然後才與食品致病菌菌株混合, 進行抑菌實驗 篩選之日本市售乳酸菌對 Escherichia coli 之抑菌效果 表四 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 將篩選出之六株市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌實驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 E. coli 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖三 圖四所示 : 乳酸菌 A 分別於 30 及 60 分鐘即對於 E. coli 有抑菌效果 乳酸菌 B 於 60 分鐘即對於 E. coli 有抑菌效果 乳酸菌 C 分別於 90 及 120 分鐘才對於 E. coli 有抑菌效果 乳酸菌 D 於 60 分鐘即對於 E. coli 有抑菌效果 乳酸菌 E-1 分別於 60 及 90 分鐘即對於 E. coli 有抑菌效果 乳酸菌 E-2 分別於 30 及 90 分鐘即對於 E. coli 有抑菌效果 由此顯示, 乳酸菌 C 的菌株對於 E. coli 之抑菌效果較差 ( 參見表五 表六 ) 31

42 表五 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min 表示三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 ++ 表示三區劃菌之培養皿二區有長出菌 + 表示三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌 表六 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果 ( 重複表五之實驗 ) 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min

43 3.2.2 篩選之日本市售乳酸菌對 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 表七 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 將篩選出之六株市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌實驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 Staphylococcus aureus 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖五 圖六所示 : 乳酸菌 A B E-1 E-2 皆於 120 分鐘時, 在三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌, 另一個三區劃菌之培養皿二區有長出菌 乳酸菌 C 於 120 分鐘時, 兩次實驗均為三區劃菌之培養皿二區有長出菌 乳酸菌 D 於 120 分鐘時, 兩次實驗均為三區劃菌之培養皿一區有長出菌 由此顯示, 這六株乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 只有些微的抑菌效果 ( 參見表八 表九 ) 33

44 表八 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min 表示三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 ++ 表示三區劃菌之培養皿二區有長出菌 + 表示三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌 表九 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 ( 重複表 八之實驗 ) 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min

45 3.2.3 篩選之日本市售乳酸菌對 Bacillus cereus 之抑菌效果 表十 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 將篩選出之六株市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌實驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 Bacillus cereus 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖七 圖八所示 : 乳酸菌 A C 皆於 120 分鐘時, 在三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌, 另一個三區劃菌之培養皿二區有長出菌 乳酸菌 B 於 120 分鐘時, 在三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌, 另一個三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 乳酸菌 D E-2 皆於 120 分鐘時, 兩次實驗均為三區劃菌之培養皿二區有長出菌 乳酸菌 E-1 於 120 分鐘時, 在三區劃菌之培養皿二區有長出菌, 另一個三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 由此顯示, 這六株乳酸菌對於 Bacillus cereus 的抑菌效果不甚理想 ( 參見表十一 表十二 ) 35

46 表十一 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min 表示三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 ++ 表示三區劃菌之培養皿二區有長出菌 + 表示三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌 表十二 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 ( 重複表十一 之實驗 ) 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min

47 3.2.4 篩選之日本市售乳酸菌對 Shigella 之抑菌效果 表十三 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 將篩選出之六株市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌實驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 Shigella 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖九 圖十所示 : 乳酸菌 A B E-2 皆於 120 分鐘時, 兩次實驗均為三區劃菌之培養皿一區有長出菌 乳酸菌 C 於 120 分鐘時, 在三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌, 另一個三區劃菌之培養皿二區都有長出菌 乳酸菌 D E-1 皆於 90 分鐘時, 兩次實驗均為三區劃菌之培養皿一區有長出菌 由此顯示, 這六株乳酸菌對於 Shigella 的抑菌效果尚可, 其中以 D,E-1 效果較佳 ( 參見表十四 表十五 ) 37

48 表十四 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min 表示三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 ++ 表示三區劃菌之培養皿二區有長出菌 + 表示三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌 表十五 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果 ( 重複表十四之實驗 ) 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min

49 3.2.5 篩選之日本市售乳酸菌對 Salmonella 之抑菌效果 表十六 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 將篩選出之六株市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌實驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 Salmonella 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖十一 圖十二所示 : 乳酸菌 A 於 30 分鐘即對於 Salmonella 有抑菌效果 乳酸菌 B 於 60 分鐘即對於 Salmonella 有抑菌效果 乳酸菌 C 於 90 分鐘對於 Salmonella 有抑菌效果 乳酸菌 D 分別於 30 及 60 分鐘即對於 Salmonella 有抑菌效果 乳酸菌 E-1 於 60 分鐘即對於 Salmonella 有抑菌效果 乳酸菌 E-2 分別於 30 及 60 分鐘即對於 Salmonella 有抑菌效果 由此顯示, 乳酸菌 C 的菌株對於 Salmonella 之抑菌效果較差 ( 參見表十七 表十八 ) 39

50 表十七 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min 表示三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 ++ 表示三區劃菌之培養皿二區有長出菌 + 表示三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌 表十八 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果 ( 重複表十七之 實驗 ) 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min

51 3.2.6 篩選之日本市售乳酸菌對 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 表十九 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 將篩選出之六株市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌實驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 Vibrio parahaemolyticus 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖十三 圖十四所示 : 乳酸菌 A C E-1 皆於 120 分鐘時, 兩次實驗均為三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 乳酸菌 B D E-2 皆於 120 分鐘時, 在三區劃菌之培養皿二區有長出菌, 另一個三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 由此顯示, 這六株乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 的抑菌效果不佳 ( 參見表二十及表二十一 ) 41

52 表二十 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min 表示三區劃菌之培養皿三區都有長出菌 ++ 表示三區劃菌之培養皿二區有長出菌 + 表示三區劃菌之培養皿ㄧ區有長出菌 表二十一 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 ( 重複表二十之實驗 ) 乳酸菌時間 A B C D E-1 E-2 Control 0 min min min min min

53 3.2.7 調整 ph 值後之發酵液對於 E. coli 之抑菌效果將篩選出之六株市售乳酸菌, 在 MRS 培養基培養後測定細胞濃度 ph 值, 並用 1N NaOH 將乳酸菌發酵液的 ph 值調整到 5.0 以上, 再針對 E. coli 進行抑菌試驗, 分別在不同的時間點 分鐘, 取乳酸菌與 E. coli 之混和菌液做三區劃線培養, 結果如圖十五 圖十六所示 實驗結果發現對於測試的 E. coli 並無任何抑菌效果 表二十二 乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度 ph 值及調整後之 ph 值 乳酸菌 A B C D E-1 E-2 OD 600nm 培養後 ph 值 調整後 ph 值

54 3.3 討論本研究從日本市售五種品牌優格 (Yogurt) 中分離出六株乳酸菌, 並利用 API 50 CHL 鑑定出菌種,A 品牌為 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei,b 品牌為 Lactobacillus acidophilus,c 品牌為 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,d 品牌為 Lactobacillus pentosus,e 品牌有兩株, 分別標示為 E-1 E-2;E-1 鑑定為 Lactobacillus plantarum,e-2 鑑定為 Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii 六株乳酸菌在 MRS 培養基中, 進行培養, 從培養後的細胞濃度依序為 D,E-1,A,C,E-2,B ( 如圖十七 ) 爲釐清本研究的乳酸菌發酵液之抑菌能力是由於乳酸菌代謝所產生的乳酸與醋酸, 亦或是由於抑菌性多胜肽 (peptide) 如 nisin, 本研究將發酵液的 ph 值調回 5.0 以上, 再針對 E. coli 進行抑菌試驗, 結果如圖十五 圖十六所示, 完全沒有抑菌的效果 文獻報導 nisin 的生產菌為 Lactococcus lactis, 並非為本研究所用乳酸菌種 因此本研究之乳酸菌發酵液之抑菌效果是由乳酸菌發酵所產生的乳酸與醋酸之代謝產物所引起 由此可見, 抑菌能力與 ph 值較有關係 本實驗過程中使用三區劃線的方法, 是因為醫院中針對病原菌的檢驗, 只能判定 positive negative 兩種結果, 亦即完全未長出菌, 才表示 44

55 有抑菌能力 所以本研究在 positive negative 中間嘗試以三區劃線方法再做不同程度的比較, 區別食品致病菌在不同濃度的生長情形, 結果雖可呈現三個區域的不同生長狀況, 但在量化上並不是很科學的方式 未來可考慮改用菌液塗抹的方法將其量化成百分比, 以使實驗更具說服力 本研究之乳酸菌中以 B C E-2 為常見之優格乳酸菌種 這些利用 MRS 培養出來的乳酸菌對大腸桿菌 沙門氏桿菌之抑制能力最佳, 對金黃色葡萄球菌 仙人掌桿菌 志賀氏菌之抑制能力次之, 對腸炎弧菌則沒有顯著的抑制能力 大腸桿菌 沙門氏桿菌 金黃色葡萄球菌 志賀氏菌皆可從被感染之動物糞便中污染, 不良的衛生習慣容易造成這幾種菌的感染 仙人掌桿菌則從儲存過久的食物中發現, 腸炎弧菌常見於海產食品中 本研究所篩選的乳酸菌在用途上除了發酵酸奶之外, 還能用來作為發酵食品如泡菜 酸菜之種菌 ; 一些肉乾在風乾的過程, 可以塗抹這些乳酸菌的培養液以避免一些食品病原菌的汙染 45

56 OD 值平均 A B C D E-1 E-2 乳酸菌種類 圖十七 市售乳酸菌在 MRS 培養基培養後之細胞濃度平均值 46

57 第四章結論 1. 本研究從日本市售五種品牌優格 (Yogurt) 中分離出六株乳酸菌, 並利用 API 50 CHL 鑑定出菌種,A 品牌為 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei,b 品牌為 Lactobacillus acidophilus,c 品牌為 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,d 品牌為 Lactobacillus pentosus,e 品牌有兩株, 分別標示為 E-1 E-2;E-1 鑑定為 Lactobacillus plantarum, E-2 鑑定為 Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii 2. 由實驗得知, 這些利用 MRS 培養出來的乳酸菌對大腸桿菌 沙門氏桿菌之抑制能力最佳, 對金黃色葡萄球菌 仙人掌桿菌 志賀氏菌之抑制能力次之, 對腸炎弧菌則沒有顯著的抑制能力 3. 將本研究之乳酸菌發酵液的 ph 值調整到 ph 5.0 以上, 結果發現對於測試的 E. coli 並無任何抑菌效果, 此結果證明本研究之乳酸菌發酵液之抑菌效果來自於發酵所產生的乳酸與醋酸等代謝產物 4. 本研究以三區劃線方法做不同程度的比較, 區別食品致病菌在不同濃度的生長情形, 結果雖可呈現三個區域的不同生長狀況, 但在量化上並不是很科學的方式 未來可考慮改用菌液塗抹的方法將其量化成百分比, 以使實驗更具說服力 47

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61 附錄 乳酸菌 A 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 E. coli 之抑菌效果 圖三 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果 51

62 乳酸菌 A 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 E. coli 之抑菌效果 圖四 篩選之市售乳酸菌對於 E. coli 之抑菌效果 ( 重複圖三之實驗 ) 52

63 乳酸菌 A 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 圖五 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 53

64 乳酸菌 A 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 圖六 篩選之市售乳酸菌對於 Staphylococcus aureus 之抑菌效果 ( 重複圖 五之實驗 ) 54

65 乳酸菌 A 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 圖七 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 55

66 乳酸菌 A 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 圖八 篩選之市售乳酸菌對於 Bacillus cereus 之抑菌效果 ( 重複圖七之實 驗 ) 56

67 乳酸菌 A 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Shigella 之抑菌效果 圖九 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果 57

68 乳酸菌 A 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Shigella 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Shigella 之抑菌效果 圖十 篩選之市售乳酸菌對於 Shigella 之抑菌效果 ( 重複圖九之實驗 ) 58

69 乳酸菌 A 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Salmonella 之抑菌效果 圖十一 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果 59

70 乳酸菌 A 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Salmonella 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Salmonella 之抑菌效果 圖十二 篩選之市售乳酸菌對於 Salmonella 之抑菌效果 ( 重複圖十一之 實驗 ) 60

71 乳酸菌 A 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 圖十三 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 61

72 乳酸菌 A 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 圖十四 篩選之市售乳酸菌對於 Vibrio parahaemolyticus 之抑菌效果 ( 重 複圖十三之實驗 ) 62

73 乳酸菌 A 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 E. coli 之抑菌效果 圖十五 調整 ph 值後之發酵液對於 E. coli 之抑菌效果 63

74 乳酸菌 A 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 B 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 C 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 D 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-1 對於 E. coli 之抑菌效果 乳酸菌 E-2 對於 E. coli 之抑菌效果 圖十六 調整 ph 值後之發酵液對於 E. coli 之抑菌效果 ( 重複圖十五之實 驗 ) 64