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迢采童
7 years ago
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1 仔猪精子体外发生 (in vitro spermatogenesis,ivs) 1 的初步研究孙燕 1.2, 高小燕 1, 王鲜忠 , 张家骅 1 西南大学牧草与草食家畜重点实验室, 重庆北碚 (400716) 2. 西南大学动物科技学院, 重庆北碚 (400716) 摘要 : 目的 : 建立仔猪睾丸组织生精细胞爬片体外培养 (in vitro spermatogenesis,ivs) 模型方法 : 以 30 日龄仔猪睾丸组织块培养为培养对象, 应用飞利普 TECAI10 电子显微镜对培养前后生精细胞类别进行观察, 对培养后的组织块进行生精细胞分化程度鉴定结果 : 培养前后电镜以及 HE 染色结果显示, 培养前细胞种类主要有两种 : 支持细胞和精原细胞, 少数几个初级精母细胞 ; 培养第 20 天的睾丸组织块 HE 照片中观察到 3 个精子细胞, 电镜图片中观察到 2 个精子细胞结论 : 在没有添加睾酮的情况下, 本培养体系能够提供睾丸组织块生精细胞分化所需要的条件, 使非精子细胞类生精细胞减数分裂为精子细胞关键词 : 仔猪 ; 精子体外发生 ; 电镜 ;HE 染色中图分类号 : ;Q ;Q952.4 随着 ICSI(intracytoplasmic sperm injection, 卵浆内单精子注射技术 ) OSI(round spermatid injection, 圆形精细胞卵浆内注射 ) ELSI(elongated spermatid injection, 长形精子细胞注射术 ) 等辅助生殖技术的出现并不断取得了成功, 使得精子体外发生成为男性不育研究领域的重点, 也给濒危动物保种带来了希望多数研究者以生精细胞混合培养进行生精细胞体外分化培养, 如 agueresse [1~2] 等通过生精细胞与 Vero 细胞或者支持细胞混合培养, 使得生精细胞发育成熟为精子细胞, 有的还通过 ICSI 得到了囊胚, 甚至正常妊娠产下健康婴儿 [3], 新生犊牛睾丸生精细胞经体外培养产生的精子细胞, 经 ICSI 后也获得了后代 [4] 然而单细胞培养的不足在于完全改变了体内条件下生精细胞分化应具有的立体结构以及各类细胞之间的相互关系, 通过细胞混合培养得到的精子细胞有可能发生基因突变或者染色体异常 [5~6] 研究奠定在前人对小型动物生精细胞体外培养基础上, 以仔猪睾丸组织块建立体外生精细胞培养体系, 试图最大程度上保持睾丸原有的正常腔室结构和生殖细胞与体细胞的相互联系, 希望能够使仔猪睾丸生精细胞在体外存活较长时间以实现生精细胞减数分裂和变态 1. 材料和方法 1.1 主要试剂仪器 DE/F12(Hyclone) 维生素 C(Sigma) 维生素 E(sigma) FSH(Sigma) 胰岛素- 转铁蛋白 (Isulin-Transferrin-sodium selenite media supplement,sigma) 优级胎牛血清( 杭州四季清 ) 一次性培养皿(Corning) illipore 超纯水制作系统倒置显微镜 (ikon) 二氧化碳培养箱 (Thermo Forma) 荷兰飞利普 TECAI10 电镜 1.2 仔猪睾丸组织块分离与培养采集 30 日龄仔猪双侧睾丸, 其中一侧睾丸用来准备培养前电镜用睾丸组织块, 按照制作电镜组织块要求取睾丸组织块, 浸入 2.5mL/L 戊二醛中, 置于 4 保温瓶中带回后放入冰箱 ; 另外一侧睾丸放入装有 PBS 的保温瓶中做睾丸组织块培养用及培养前睾丸组织块 HE 在无菌操作台内, 将睾丸转入装有 PBS( 含双抗 ) 的平皿中, 用 PBS 冲洗数遍, 撕去白膜脂肪 1 本课题得到教育部博士点专项基金 ( ); 国家自然科学基金资助课题 ( ) 的资助 -1-

2 垫等附属组织, 再用 PBS 冲洗数遍, 将睾丸剪碎至 2mm~4mm, 挑取 7-8 块周围平整的组织块接种于 Corning 培养皿中的 24mm 24mm 盖玻片上, 组织块之间间隔一定距离添加培养液, 基础培养基为 DE/ F12 用灭菌超纯水配制, 碳酸氢钠调整 PH 值 , 每毫升培养液中含有 100 单位青链霉素维生素 C(10-4 mol/l) 维生素 E(10µg/ml) 卵泡刺激素 (10-4 mg/ml) 胰岛素- 转铁蛋白 (10µg/ml), 置于 34, 水饱和,5mL/LCO 2 空气二氧化碳培养箱中静置培养在培养前 3 天, 为了促进组织块尽快贴壁, 培养液以刚好覆盖组织块为宜, 且在培养液中添加血清 (100µl/900µl 培养液 ), 尽量少晃动培养皿 1.3 细胞鉴定培养前后睾丸组织块透射电子显微镜标本的收集与制备 0.1mol/LPBS 冲洗培养皿中的睾丸组织块, 收集于干燥培养皿中, 用滤纸吸干, 置于 2.5mL/L 戊二醛中固定,4,2h 以上用 0.1PBS 漂洗两次,10 分钟 / 次,1mL/L 锇酸后固定 2 小时, 丙酮梯度脱水, 浸透, 环氧树脂包埋固化, 半薄切片定位, 超薄切片, 铀 - 铅双染,PHILIPS- TECAI10 透射电镜 80KV 观察并照相培养前睾丸组织块透射电子显微镜标本制备行相同步骤苏木素 - 伊红 (Hematoxylin-eosin staining,he) 按黄宇烽 [7] HE 染色改进, 对培养前睾丸组织块行组织切片 HE 染色 ; 培养第 20 天将培养皿中睾丸组织块取出之后, 对从组织块爬出的生精细胞行 HE 染色 2. 结果 2.1 培养前后电镜观察睾丸组织块中生精细胞类别变化培养前睾丸组织块细胞类别电镜结果发现,30 日龄仔猪睾丸曲精细管细胞类型以精原细胞 ( 如图 1-A) 和支持细胞为主 ( 如图 1-B), 精原细胞胞核卵圆形, 染色质电子密度低部分呈细粒状深染, 核仁明显, 胞质丰富, 线粒体和内质网丰富 ; 支持细胞, 胞核呈不规则长形, 电子密度低, 胞质丰富, 线粒体和内质网非常丰富未见初级精母细胞培养后电镜结果表明, 睾丸组织块中已经出现初级精母细胞 ( 如图 1-C), 细胞体积增大, 电子密度较大, 胞核呈圆形, 染色质部分呈颗粒状, 胞质丰富, 比较多线粒体和内质网, 线粒体重度肿胀, 线粒体基质内出现多个亮区, 基质颗粒消失, 线粒体嵴消失, 内质网以粗面内质网为主, 高尔基体发达, 细胞核核仁明显 ; 支持细胞胞核仍然呈不规则长形, 胞质不如培养前丰富, 线粒体明显减少轻度肿胀, 内质网没有明显变化观察到 2 个精子细胞, 胞核呈苹果状, 在细胞核顶端有半球状高电子密度顶体帽形成 ( 如图 1-D), 胞质丰富, 可以看到线粒体和内质网等细胞器, 线粒体重度肿胀 -2-

3 u A B AV u u C D 图 1 培养前后睾丸组织块生精细胞超微结构变化 : 细胞核 ;u: 核仁 ;: 线粒体 ;: 内质网 ;AV: 顶体囊泡 Fig. 1 Ultrastructure of germ cells before and after culture (A,B,C and D repersent ultrastructure of spermatogonia, Sertoli cell,spermatocyte and spermatid after culture.bar=1.1µm) :nuclear; u:nucleolus; :mitochondrion; :reticulum; AV: acrosomal vesicle 2.2 培养前后 HE 染色从培养前 HE 染色图片 ( 如图 2-A) 中可以看到仔猪睾丸曲精细管管腔还不十分明显, 生精细胞种类单一, 主要以精原细胞和支持细胞为主, 少数初级精母细胞, 排列有一定秩序, 但是支持细胞与精原细胞初级精母细胞的界线还不分明体外培养 15d, 可见通过间桥连接在一起的精原细胞生长于支持细胞上 ( 图 2-B), 支持细胞以 2 个核仁常见, 偶见正在分裂的次级精母细胞, 未见精子细胞 ; 体外培养第 20d 睾丸组织块爬片生精细胞 HE 染色可以看到多个正在分裂的次级精母细胞 ( 图 2-C), 可见精子细胞, 精子细胞胞体为圆形或椭圆形, 胞核为蓝紫色, 呈卵圆形, 偏向一极 ( 图 2-D) -3-

4 A B C D 图 2 培养前后 HE 染色 ( 1000) : 曲精细管 ; : 链状连接精原细胞 ; : 次级精母细胞 ; : 精子细胞 Fig. 2 Hematoxylin-eosin staing before and after culture (A:seminiferous tubules before culture; B:spermatogonium joint with intercellular bridges,15d; C: secondary spermatocytes differentiating after culture,20d ; D:spermatids after culture,20d.) 3. 结论与讨论精子发生是指精原细胞经过一系列分裂增殖分化变态, 最终形成完整的精子的过程, 这一过程受到旁分泌和内分泌因素复杂调控由于精子发生过程涉及的因素过多, 至今关于精子发生的基因调控减数分裂机制仍不完全明了, 体外培养还不能完全模拟体内精子生成, 目前还没有通过体外培养生精细胞成功分化变态成精子的报道以健康仔猪作为研究材料, 建立猪精子体外发生系统, 能够为男性不育提供更优的动物模型, 为拯救濒危动物提供新的思路 ; 对于研究生精过程的复杂机制更是意义重大精子变态过程, 形态变化主要包括顶体的发生, 细胞核的浓缩拉长, 精子尾部的形成和多余胞质的脱落等 4 个步骤顶体作为精子受精时雄体必备的结构, 在精子形成过程中起重要标志作用, 是精子细胞向精子转化的依据, -4-

5 分为 : 原顶体颗粒形成期顶体泡形成期顶体帽区和顶体中央管形成期本研究发现培养至第 20 天的睾丸组织块中存在发育至顶体泡期的精子细胞, 呈现顶体泡典型形态学特征, 精子细胞细胞核边出现一个很小的电子密度强的囊泡, 形状呈扁平倒 V 字形, 整个细胞核呈苹果状, 紧挨着细胞膜本研究发现, 在生精细胞细胞器中, 培养前后线粒体变化比较明显线粒体是细胞内生成 ATP 的主要场所, 是机体能量代谢中心, 同时还参与多种重要细胞的病理过程, 判断指标包括主要体现在数量大小和形态结构三个方面本研究中, 培养前电镜图显示支持细胞各类生精细胞细胞内线粒体丰富, 有粒状棒状及杠铃状, 线粒体脊明显 ; 培养后支持细胞各类生精细胞线粒体数量减少, 且发现支持细胞线粒体轻度肿胀, 嵴不明显方向不规则, 有少数亮区空泡, 基质电子密度高 ; 精子细胞线粒体稀少, 重度肿胀通常线粒体肿胀出现多发生在缺血缺氧以及中毒的组织中, 如果电镜材料固定不及时可能会引起肿胀, 此外线粒体肿胀也是细胞坏死的标志之一, 是细胞凋亡的执行者排除人为因素, 作者认为在本研究中线粒体肿胀可能是细胞凋亡的先兆, 因为从培养第 3 天开始游出睾丸组织块的生精细胞, 在体外存活时间超过了 17 天, 这段时间内, 各类生精细胞之间的联系生精细胞与支持细胞之间的联系与体内完全不同, 虽然培养液能够提供一定营养物质, 但时间是有限的同样, 线粒体数量变化与线粒体功能有关, 线粒体功能下降与衰老关系密切 [8] 支持细胞作为各类生精细胞的保姆细胞, 是生精细胞营养物质的主要来源, 而本研究中培养后的支持细胞线粒体数量比培养前少, 一个方面可能与衰老有关, 另一个方面可能是由于体外培养中培养液的营养作用使得支持细胞的这种作用弱化, 导致支持细胞内线粒体数量因优胜劣汰而减少? 具体原因还有待进一步研究值得一提的是, 本研究建立的仔猪生精细胞培养体系没有添加睾酮, 与 Ghatnekar [9~10] 等认为的睾酮在生精细胞体外分化中作用相异, 他们认为睾酮是生精细胞增殖分化不可或缺的激素, 对睾丸生精细胞的数量和质量都有影响 ; 与 Toebosch [11~12] 等的观点相同, 他们认为生精细胞体外分化与睾酮添加无关, 睾酮的存在可能只是延长了生精细胞的存活时间本培养体系下生精细胞之所以能够在体外分化, 可能是由于组织块中的间质细胞能够分泌提供部分睾酮保证了生精细胞存活时间 ; 除此之外,FSH 在生精细胞的作用不容忽视,FSH( 卵泡刺激素 ) 作为保证雄性生育能力的重要激素之一, 能够与支持细胞上的 FSH( 卵泡刺激素受体 ) 结合, 通过诱导 5 种信号途径, 导致支持细胞中各类转录因子被激活, 引起基因表达发生变化, 从而保证了生精细胞的体外分化 [13~14] 尽管生精细胞在本培养体系中完成了减数分裂, 但得到精子细胞的数量很少, 精子细胞也还不能够在体外完全整个生精过程, 说明本培养体系尚不能完全提供生精细胞在体外完成整个减数分裂的条件, 还有待改进将采用 Percoll 流式细胞仪等细胞分离手段将每个阶段生精细胞分离, 然后以 Vero 细胞或支持细胞为饲养层进行生精细胞体外培养, 进一步完善培养体系 ; 研究睾酮等激素在生精细胞分化过程的作用, 从生精细胞基因表达单精子注射生产胚胎等鉴定角度对生精细胞体外分化做系统深入研究 -5-

6 参考文献 [1] agueresse-battistoni BL, Gerard, Jegou B,et al.pachytene spermatocytes achieve meiotic process in vitro[j].biochem Biophys es Comm,1991,179: [2] Tres LL,Cahn F,Kierszenbaum.Permeable collagen-glycosaminoglycan cross-linked copolymers for the study of biological responses of cocultured Sertoli and spermatogenic cells[j].cell Biol Toxicol,1992,8(3): [3] Tesarik J, Bahceci, Ozcan C, et al.estoration of fertility by in-vitro s p e rm a t o g e n e s i s[j]. Lancet, Feb 1999,353(9152): [4] Lee D, Kaproth T, Parks HE.In vitro production of haploid germ cells from fresh or frozen thawed testicular cells of neonatal bulls[j].biol eprod,2001,65: [5] Sousa, Cremades, Alves C,et al. Developmental potential of Human spermatogenic cells cocultured with Sertoli cells[j]. Hum eprod,2002,17(l): [6] Cremades, Bernabeu, Barros A,et al.in vitro maturation of round spermatids using coculture on Vero cells[j].hum eprod,1999,14: [7] 黄宇烽, 印洪林主编, 精液细胞学与超微结构图谱. 上海 : 第二军医大学出版社,2002:15-16 Hung Yu-feng and Yin Hong-fin,Seminal cytology and ultrastrcural atlas[].shanghai: the Secondary ilitary edical University Press,2002:15-16.(in Chinese) [8] Diauro S, Tanji K, Bonilla E,et a1. itochondrial abnormalities in muscle and other aging cells:classification,causes,and effects[j].uscle erve,2002,26(5): [9] Ghatnekar, Lima-de-Faria A, ubin S, enander K. Development of human male meiosis in vitro. Hereditas,1974,78: [10] Zirkin B, Santulli, Awoniyi CA, Ewing LL. aintenance of advanced spermatogenic cells in the adult rat testis: quantitative relationship to testosterone concentration within the testis[j]. Endocrinology, 1989,124: [11] agueresse-battistoni B Le, Ge rard, Je gou B. Pachytene spermatocytes can achieve meiotic process in vitro[j]. Biochem Biophys es Commun. 1991,179: [12] Toebosch AW, Brusse e, Verkerk A,et al. Quantitative evaluation of the maintenance and development of spermatocytes and round spermatids in cultured tubule fragments from immature rat testis[j]. Int J Androl,1989,12: [13] Sadate-gatchou, PI Pouchnik DJ, Griswold D. Follicle stimulating hormone induced changes in gene Expression of murine testis. olecular Endocrinology[J], 2004,18: [14] Boitani C, Politi G, enna T. Spermatogonial cell proliferation in organ culture of immature rat testis[j]. Biol eprod,1993,48: esearch of in vitro spermatogenesis(ivs) piglet testis Sun Yan 1.2, Gao Xiaoyan 1, Wang Xianzhong 1.2, Zhang Jiahua Chongqing Key Laboratory of Forage & Herbivore, Southwest University, Chongqing, China (400716) 2.College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing, China (400716) Abstract OBJECTIVE Establishing model of piglet testis tissue in vitro. ETHOD The testis s tissues of 30d piglets were used to do IVS,transmission electron microscopy and HE(Hematoxylin-eosin staining) were used to identifiy the differentiation of germ cells before and after culture. ESULTS Two spermatids were observed by transmission electron microscopy,and three spermatids were observed by HE staining,which were not present before culture. COCLUSIO This system could help those germ cells go through meiosis in vitro without addition of testosterone. Keywords:piglet;in vitro spermatogenesis;transmission electron microscopy;he 作者简介 : 孙燕 (1976-), 女, 重庆万州人, 博士, 主要从事动物生殖生理与生殖调控研究, yans76@sina.com.cn; 张家骅, 教授, 博导, 通讯作者, jh.zhang007@yahoo.com.cn -6-

7 附图 : u u A B C AV u D E F G 培养前后生精细胞分化程度鉴定图 A 培养前精原细胞, 核卵圆形, 染色质电子密度低部分呈细粒状深染, 核仁明显, 线粒体和内质网丰富, 1000; Fig.A Spermatogonia before culture with round nucleus showing low electron density, clear nucleolus, rich mitochondria and reticulum; 图 B 支持细胞, 胞核呈不规则长形, 电子密度低, 线粒体非常丰富, 1000; Fig.B Sertoli cell before culture with long and irregular nucleus,low electron density,rich mitochondria; 图 C 初级精母细胞, 胞核呈圆形, 电子密度较大, 线粒体重度肿胀, 粗面内质网丰富, 1000; Fig.C spermatocyte after culture with round nucleus showing higher electron density,engorged mitochondria and rich reticulum could be observed, 1000; 图 D 精子细胞, 在细胞核顶端有半球状高电子密度顶体帽形成, 线粒体重度肿胀, 1000; Fig.D Spermatids after culture with acrosomal vesicles on one side of nucleus showing high electron density,engorged mitochondria could also be observed; 图 E 培养前睾丸曲精细管 HE 图, 1000; Fig.E: seminiferous tubules before culture, 1000; 图 F 次级精母细胞分裂为精子细胞 ( 箭头所示 ), 1000; Fig.F Secondary spermatocytes differentiating after culture, 1000; 图 G 精子细胞 (( 箭头所示 ), 1000 Fig.G: Sc type spermatid (arrowhead),

图1 Fi g. 1 黑鲷精子发生过程中的超微结构Ⅰ The u lt ras t ruct ure of S p aru s macr oc ep halu s during spermat on genesis plat e Ⅰ 1-1 精原细胞, 示核仁明显, 胞质中粗面内质网 7

图1 Fi g. 1 黑鲷精子发生过程中的超微结构Ⅰ The u lt ras t ruct ure of S p aru s macr oc ep halu s during spermat on genesis plat e Ⅰ 1-1 精原细胞, 示核仁明显, 胞质中粗面内质网 7 刘雪珠石戈王日昕在超微结构上研究了黑鲷精子发生过程中细胞形态结构的变化和细胞器的变化规律观察到在精子发生的不同时期细胞核形态变化染色质浓缩且由分散向集中分布线粒体的数目分布位置及超微结构发生的演变规律及