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带弘
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1 中国科学 B 辑 : 化学 2009 年第 39 卷第 8 期 : 774 ~ chem.scichina.com SCIENCE IN CHINA PRESS 高效液相色谱 - 线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留吴永宁 12*, 苗虹 1*, 范赛 12 12, 赵云峰 1 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所, 北京 ; 2 中国农业大学动物医学院, 北京 * 通讯作者, wuyncdc@yahoo.com.cn; miaohong0827@163.com 收稿日期 : ; 接受日期 : 摘要利用高效液相色谱 - 线性离子阱质谱 (HPLC-ITMS) 以同位素稀释技术测定了肌肉组织中 23 种 β 2 - 受体激动剂及 5 种 β- 阻断剂. 肌肉样品经 5% 的三氯乙酸溶液酸解提取, 以弱阳离子固相萃取柱进行净化. 以甲醇和含 0.1% 甲酸的水溶液为流动相在液相色谱柱上梯度洗脱分离, 采用 ESI 源正离子模式在选择离子监测 (SRM) 模式下进行扫描. 以 9 种经氘代同位素标记的 β 2 - 受体激动剂为内标进行定量. 猪肉中 23 种 β 2 - 受体激动剂及 5 种 β- 阻断剂的线性范围为 5~200 μg/l, 相关系数 (r) 大于 0.995, 各化合物在肌肉中的检出限均能达到 0.2 μg/kg. 以空白猪肉样品进行的加标水平为 μg/kg 的加标回收试验, 各化合物的回收率在 47.3%~123.7% 之间, 相对标准偏差在 3.2%~25.7% 之间. 对猪肉样品和鸡肉样品进行了测定, 得到了满意的结果. 该方法灵敏度高, 定性准确, 可以用于畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂和 β- 阻断剂类药物残留的确证检测. 关键词 β 2 - 受体激动剂 β- 阻断剂肌肉检测 HPLC-ITMS 1 引言 β 2 - 受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物 (phenthylamines, PEAs), 具有苯乙醇胺结构母核, 苯环上连接有碱性的 β- 羟胺侧链. 由侧链上取代基的差异, 划分为不同的药物. β 2 - 受体激动剂在临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量, 可用于治疗支气管哮喘阻塞性肺炎等症状. 20 世纪 80 年代初, 一系列的动物实验表明, 当用药剂量超过治疗剂量 5 倍时, 该类药物如克伦特罗沙丁胺醇等可以起到促进动物生长, 提高瘦肉率的作用 [1~3], 随之而来的被大量非法添加于饲料中, 以促进家畜生长及提高瘦肉率, 因而导致 β 2 - 受体激动剂在动物体内的蓄积, 进一步引起食物中毒的情况发生. 自 1983 年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件以来, 20 世纪 90 年代, 欧洲因克伦特罗污染引起食物中毒的时间超过 500 起 [4,5], 我国自 1998 年香港出现克伦特罗中毒事件后亦多次发生, 伴随着国内外对克伦特罗监管的加强, 利益的驱使促使不法分子, 将其他 β 2 - 受体激动剂 [6], 如沙丁胺醇马布特罗溴布特罗和莱克多巴胺等非法添加与动物饲料及饮水中. 因此, 建立 β 2 - 受体激动剂多组分残留的测定方法是非常重要的. β- 阻断剂类药物则被广泛用于动物运输过程中防治由于动物应激而造成的突然死亡, 由于该类化合物往往是在动物屠宰前的数小时注射使用的, 因此该类化合物 774

2 中国科学 B 辑 : 化学 2009 年第 39 卷第 8 期相对其他的兽医用药可能对消费者造成的健康风险更大. 长期食用高残留的动物组织除会造成消费者如焦虑头痛食欲减退等精神症状外, 还会造成消费者对药物的依赖性. 因此各国对 β- 阻断剂类药物在动物饲养中的使用也都有明确的规定 [7]. 欧盟的 [8] 96/23/EC 指令规定动物性食品中不得检出 β- 兴奋剂类药物残留 ; 我国农业部第 235 号公告动物性食品中兽药最高残留限量中将克伦特罗及其盐沙丁胺醇及其盐和酯西马特罗及其盐和酯列为禁止使用的兽药, 并规定在动物性食品中不得检出 [9]. 目前用于测定 β 2 - 受体激动剂的方法较多, 多采用包括免疫亲和层析固相萃取 (SPE) 以及固相基质萃取 (MSPD) 等方法进行净化, 通过色谱或色谱与质谱串联的手段进行检测 [10~19], 但净化之前多采用 β- 葡萄糖醛酸酶或其他方式进行酶解, 仅有少数报道采用酸解或碱性水解的方式使目标化合物解离 [18,19] ; 为了满足快速筛查的要求, 有关免疫分析法 (ELISA RIA) 也有报道, Elliott CT 等人采用酶联免疫法 (ELISA) 对莱克多巴胺进行了检测 [20], 沈建忠等人采用时间分辨荧光免疫分析法 (TR-FIA) 对猪组织中的莱克多巴胺进行检测, 检测限可以达到 0.1 μg/kg [21], 但免疫分析方法的单一性, 不适应多残留的检测. 对 β- 阻断剂的检测方法的报道较少, 主要对环境中的 β- 阻断剂进行检测, M. Dolores Hernando [22] 以 LC-MS 测定了污水及地表水中的 11 个 β- 阻断剂 ; Hing-Biu Lee [23] 采用基质固相萃取技术测定了废水中的 12 个 β- 阻断剂和 β 2 - 受体激动剂. 有关动物性食品中的 β- 阻断剂的测定还未见报道. 本文的目的是建立一种高灵敏快速的对多种 β 2 - 受体激动剂和 β- 阻断剂类药物进行同时测定的分析方法, 以满足对市场动物性食品中 β- 兴奋剂类药物监管的要求. 2 实验部分 2.1 试剂及标准溶液甲醇乙酸乙酯 ( 色谱纯, J.T.Baker 公司 ), 甲酸 ( 纯度为 99%, Ameisensaeure 公司 ), 高氯酸 ( 优级纯, 北京化工厂 ) 三氯乙酸( 优级纯, 北京化学试剂公司 ) 氢氧化钠( 优级纯, 北京化学试剂公司 ) 浓氨水 ( 优级纯, 天津市东方化工厂 ); 实验用水均为超纯水, 电阻率为 18.2 MQ cm (Millipore 公司超纯水器制备 ). β 2 - 受体激动剂标准品 : 溴布特罗 (brombuterol- HCl, 纯度 >99%), 克伦异磅特罗 (clenisopenterol- HCl, 纯度 >99%) 克伦赛罗(clencyclohexerol hydrochloride, 纯度 >99.5%) (clenhexerol, 纯度 >99%) 塞布特罗 (cimbuterol, 纯度 >99%) 马贲特罗 (mapenterol hydrochloride, 纯度 >99%) 购自 WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH, 德国 ; 马布特罗 (mabuterol, 纯度 >99.1%) 塞曼特罗(cimaterol,, 纯度 >99.5%) 购自 Boehringer Ingekheim. 沙美特罗 (salmeterol, 纯度 >98%) 购自 Toronto Research Chemical Inc., 美国 ; 克伦普罗 (clenproperol, 纯度 >99%) 克伦磅特罗(clenpenterol, 纯度 >99%) 购自 EU Reference Laboratory, 德国 ; 异丙喘宁 (metaproterenol, 纯度 >99.9%) 特布他林(terbutaline, 纯度 >98%) 沙丁胺醇 (salbutamol, 纯度 >98%) 丙卡特罗(procaterol, 纯度 >99%) 非诺特罗(fenoterol, 纯度 >98%) 克仑特罗 (clenbuterol, 纯度 >95%) 莱克多巴胺 (ractopamine, 纯度 >95.6%) 妥布特罗(tulobuterol, 纯度 >98%) 福莫特罗(formoterol fumarate, 纯度 >98%) 班布特罗 (bambuterol hydrochloride, 纯度 >98%) 利托君 (ritodrine hydrochloride, 纯度 >99%) 购自 Sigma 公司. β- 阻断剂标准品 : 美托洛尔 (metoprolol, 纯度 >98%) 拉贝洛尔(labetalol hydrochloride, 纯度 >98%) 普萘洛尔(propranolol hydrochloride, 纯度 >98%) 倍他洛尔(betaxolol, 纯度 >98%) 喷布洛尔 (penbutolol sulfate, 纯度 >98%) 购自 Sigma 公司, 美国. 氘代同位素标准品 :D 7 -Cimaterol D 6 -Salbutamol D 9 -Cimbuterol D 7 -Clenproperol D 5- Ractopamine D 9 -Mabuterol D 11 -Mapenterol D 6 -Clenbuterol 购自 EU Reference Laboratory, 德国 ; D 3 -Salmeterol 购自 Cambridge Isotope Laboratories Inc, 美国. β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂标准溶液储备液的配制 : 精确称取标准品各约 g, 分别用甲醇溶解并定容至 10 ml, 浓度为 1000 mg/l, 于 18 冰箱中保存. 需要时将各标准储备液制成浓度为 10 mg/l 的混合标准工作液, 使用时用甲醇稀释成 1 mg/l 的混合标准使用液, 使用后置于 18 冰箱中保存. 氘代同位素标准品, 直接用 1 ml 甲醇溶解, 除 D 3-775

3 吴永宁等 : 高效液相色谱 - 线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留 Salmeterol(1000 mg/l) 外制成 10 mg/l 的标准溶液, 使用时用甲醇制成 1 mg/l 的内标混合使用液, 使用后置于 18 冰箱中保存. 2.2 仪器与设备高效液相色谱 - 线性离子阱质谱仪 (LTQ, Thermofisher 公司, 美国 ), 离心机 (Sigma3K-15 型, Sigma 公司, 美国 ), Oasis MCX 固相萃取柱 (6 ml, 150 mg, waters 公司, 美国 ), N2- 浓缩仪 (N-EVAP, analytical evaporator Associates INC., 美国 ). 2.3 提取精确称取匀浆后的肌肉样品约 5.0 g, 加入 5% 的三氯乙酸溶液 10 ml, 涡旋混匀, 置于 80 水浴中加热超声提取 30 min, 以 r/min 0 离心 10 min, 吸取上清液于 25 ml 试管中. 沉淀用 5% 的三氯乙酸溶液 5 ml 再提取一次, 再以 r/min 0 离心 10 min. 合并提取液, 待进行净化处理. 2.4 净化 Waters Oasis MCX 柱 (6 ml,150 mg) 依次用 6 ml 甲醇 6 ml 水活化后, 将提取液上 MCX 柱, 弃去流出液, 依次用 2 ml 0.1 mol/l 的高氯酸溶液 1 ml 甲醇淋洗, 用 6 ml 含 5% 浓氨水的甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 将洗脱液置于 N2- 浓缩仪上浓缩至近干, 用 1 ml 甲醇 -0.1% 甲酸水溶液 ( , V.. V ) 充分溶解残渣, 将此溶液过 0.22 μm 的有机滤膜待进行 LC-MS 测定. 2.5 基质匹配的标准工作曲线的制备准确吸取 1 mg/l 的混合标准使用液, 用初始流动相配比复溶的空白基质溶液制成和 200 μg/l 的标准系列溶液. 空白基质溶液的制备 : 称取与试样基质相应的阴性样品 5.0 g, 与试样同时进行提取净化和复溶得到. 2.6 仪器条件液相色谱条件色谱柱 :Waters Atlantis T3 柱, 150 mm 2.1 mm, 3 μm; 流动相 : 甲醇 -0.1% 甲酸水溶液梯度洗脱, 参考梯度洗脱条件见表 1, 流速 :250 μl/min, 柱温 :30, 表 1 液相色谱参考梯度条件时间 (min) 0.1% 甲酸水溶液 (%) 甲醇 (%) 进样量 :10 μl 质谱参考条件离子化模式 : 电喷雾电离正离子模式 (ESI+); 质谱扫描方式 : 选择离子监测 (SRM), 喷雾电压 :4 kv; 鞘气流速 :35 arb, 辅助气流速 :15 arb, 毛细管温度 : 325, 毛细管电压 :50 V. 线性离子阱参数 : 全扫描目标离子数 ; 选择离子监测目标离子数 ; 多级质谱目标离子数 (MSn) ; 精确扫描目标离子数其余质谱参数见表 2. 3 结果与讨论 3.1 样品提取有些 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物在动物组织中会以硫酸轭合物或葡萄糖醛酸轭合物等形式存在, 因此样品要先进行水解, 使待测物游离或从组织中释放已进行后续的提取. 尤其是沙丁胺醇异丙喘宁等苯酚型药物的轭合物比例较高, 必须经水解后进行提取和净化. 常用的水解方法主要有酶水解 [15] [18] 酸水解和碱水解 [19]. 本研究采用酸解方式, 一方面三氯乙酸可以起到水解轭合物的作用, 另一方面三氯乙酸具有较强的蛋白沉淀能力, 减少了酶水解中酶制剂本身及其水解后的样品中产生的蛋白类物质对目标化合物的干扰. 样品提取液的 ph 值在 3.6~ 4.0 之间, 可以直接上经活化后的 Waters Oasis MCX 固相萃取柱进行净化. 3.2 净化动物源性样品基质较为复杂, 存在着对目标化合物的严重干扰, 本方法采用三氯乙酸提取, 并结合低温高速离心的方式对蛋白物质进行沉淀, 应用固相萃取的方式进行净化. β 2 - 受体激动剂是含氮激素 776

4 中国科学 B 辑 : 化学 2009 年第 39 卷第 8 期 a) 表 2 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂质谱采集参数化合物保留时间 (min) 母离子 (m/z) 对应内标 Segment 定量离子 (m/z) 定性离子 (m/z) 碰撞能量 (%) 扫描范围 (m/z) Metaproterenol D7-Cimaterol ~215 D7-Cimaterol ~230 Cimaterol D7-Cimaterol 2, ~223 Terbutaline D6-Salbutamol , ~230 D6-Salbutamol , ~250 Salbutamol D6-Salbutamol ~243 D9-Cimbuterol ~250 Cimbuterol D9-Cimbuterol ~240 Procaterol D9-Cimbuterol , ~295 Fenoterol D9-Cimbuterol , ~308 Ritodrine D7-Clenproperol ~292 Clencyclohexerol D7-Clenproperol ~323 D7-Clenproperol ~273 Clenproperol D7-Clenproperol ~266 D6-Clenbuterol ~286 Clenbuterol D6-Clenbuterol ~280 D5-Ractopamine ~310 Ractopamine D5-Ractopamine ~305 Bromchlorbuterol D5-Ractopamine ~326 Metoprolol D5-Ractopamine ~271 Tulobuterol D9-Mabuterol ~231 Formoterol D9-Mabuterol ~350 Brombuterol D9-Mabuterol ~370 D9-Mabuterol , ~325 Clenpenterol D9-Mabuterol 8, ~295 Mabuterol D9-Mabuterol ~315 Bambuterol D11-Mapenterol ~371 Clenisopenterol D11-Mapenterol ~295 D11-Mapenterol ~340 Mapenterol D11-Mapenterol 10, ~330 Labetalol D11-Mapenterol ~333 Propranolol D11-Mapenterol , ~265 Betaxolol D11-Mapenterol 11, , ~311 Clenhexerol D11-Mapenterol ~310 Penbutolol D3-Salmeterol ~295 D3-Salmeterol ~422 Salmeterol D3-Salmeterol ~420 a) 碰撞能量 (%) 为归一化能量 ; 表示母离子被施予能量打碎后只有一个碎片离子. 分离窗口宽度为 2(m/z), Q 值为

5 吴永宁等 : 高效液相色谱 - 线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留中的苯乙胺类药物, 均具有苯乙醇胺结构的母核, 按照苯环上取代基不同, 常将其分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基, 故通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大, 如结构中具有芳伯氨基, 则多表现为中等极性. 而 Waters Oasis MCX 固相萃取柱是具有混合型阳离子交换反相吸附剂的固相萃取柱, 考虑到 β 2 - 受体激动剂具有的苯乙醇胺母核及取代基, 在偏酸性情况下对 β 2 - 受体激动剂以及 β- 阻断剂类化合物多能与 H + 结合形成阳离子, 被 MCX 柱的填料吸附, 从而具有高的选择性和灵敏度 [14], 起到较好的净化效果. 3.3 质谱参数的优化通过流动注射 200 μg/l 的以甲醇 0.1% 甲酸水溶液 ( , V/V) 为溶剂的单标标准, 并同时开启液相色谱流动相为甲醇 -0.1% 甲酸水溶液 ( , V/V ), 流速为 250 μl/min, 对碰撞能量及质谱参数如喷雾电压, 毛细管电压毛细管温度鞘气及辅助气流速等参数进行了优化, 具体优化结果见节的质谱参参数. 经过优化后, 选择离子监测 (SRM) 模式下, 23 种 β 2 - 受体激动剂及 5 种 β- 阻断剂均得到了较高的响应值. 表 2 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂质谱采集参数表中 Cimaterol Clencyclohexerol Clenproperol Clenisopenterol Clenhexerol 的二级质谱碎片均只有 [15] 一个, 分别为和 287. Shao 等采用 waters 公司的三重四极杆质谱测定了猪肝猪肾及猪肉中的 16 种 β 2 - 受体激动剂, 其中 Cimaterol 的质谱碎片离子为和 Clencyclohexerol 的质谱碎片离子为和 Clenproperol 的质谱碎片离子为 245 和 203 Clenisopenterol 的质谱碎片离子为和由于离子阱质谱与四级杆质谱的工作原理不同, 对液质联用方法来说常会发生裂解碎片不同的情况, 但本实验中只有一个二级碎片离子不能满足质谱确证的要求. 在今后的实验工作中可以增加二级质谱的碰撞能量或发挥离子阱质谱的优势做三级质谱扫描来解决此问题. 3.4 线性方程检出限及定量限为了更好的降低基质效应的干扰, 本研究采用了基质匹配的标准溶液进行线性实验. 按照 2.5 配制基质匹配的系列标准系列溶液并注入液质联用仪进行分析, 记录各化合物的色谱峰面积 (A) 和内标的色谱峰面积 (A i ), 以 A 和 A i 的比值 ( 氘代同位素内标除对应各自的化合物外, 其他化合物按色谱保留时间顺序以相近的氘代同位素化合物为内标 ) 对相应的标准溶液中化合物的浓度进行线性回归计算, 得出线性方程线性范围和相关系数 (r), 结果见表 3. 由结果可见, 在 5~200 μg/l 范围内, 各物质均取得良好线性相关, 相关系数 (r) 大于浓度为 80 μg/l 的基质匹配标准溶液的选择离子监测 (SRM) 的总离子流图见图 1, 各化合物的定量离子提取色谱图见图 2. 采用空白基质加标的方式, 以信噪比 (S/N) 为 3 的含量定为方法的检出限 (LOD), 以信噪比 (S/N) 为 10 的含量定为方法的定量限 (LOQ), 23 种 β 2 - 受体激动剂及 5 种 β- 阻断剂的检出限及定量限结果列于表 3 中. 3.5 加标回收实验结果加标回收试验采用空白猪肉样品进行试验, 加标水平分别为 5 10 和 20 μg/kg. 测定结果列于表 4 中, 加标水平为 5 μg/kg 时, 各化合物的回收率在 47.3%~111.5% 之间, RSD 在 7.2%~23.5% 之间 ; 加标水平为 10 μ g/kg 时, 各化合物的回收率在 47.3%~123.7% 之间, RSD 在 4.8%~25.7% 之间 ; 加标水平为 20 μ g/kg 时, 各化合物的回收率在 52.2%~117.7% 之间, RSD 在 3.2%~23.0% 之间. β 2 - 受体激动剂分为苯胺型和苯酚型, 由于含有氨基或酚羟基通常具有极性, 但由于取代基的不同, 极性差异较大. 且本方法同时检测 28 种化合物, 加上 9 个氘代同位素内标, 共有 37 个化合物, 从梯度洗脱的液相色谱的保留时间上从 3 min 开始出峰到 42 min 第 37 个化合物沙美特罗出峰, 也可以看出各化合物的极性差异, 因此可能在 MCX 柱上的保留量和洗脱量会因极性差异而有所不同. 多次试验我们都发现在色谱上最后一个出峰的沙美特罗回收率均较低, 由于沙美特罗取代基类型为水杨醇型, 极性较弱不易与 H + 结合形成阳离子, 故在 MCX 柱上保留较差. 另外加标水平较低为 5 μg/kg 时, 受基质效应的影响有些化合物的回收率也较低, 但平行测定结果之间的精 778

6 中国科学 B 辑 : 化学 2009 年第 39 卷第 8 期表 3 线性方程相关系数及检出限和定量限化合物线性方程相关系数 (r) 检出限 (LOD, μg/kg) 定量限 (LOQ, μg/kg) Metaproterenol Y = x Cimaterol Y = x Terbutaline Y = x Salbutamol Y = x Cimbuterol Y = x Procaterol Y = x Fenoterol Y = x Ritodrine Y = x Clencyclohexerol Y = x Clenproperol Y = x Ractopamine Y = x Clenbuterol Y = x Bromchlorbuterol Y = x Metoprolol Y = x Formoterol Y = x Tulobuterol Y = x Brombuterol Y = x Mabuterol Y = x Clenpenterol Y = x Bambuterol Y = x Clenisopenterol Y = x Mapenterol Y = x Labetalol Y = x Propranolol Y = x Betaxolol Y = x Clenhexerol Y = x Penbutolol Y = x Salmeterol Y = x 图 1 基质匹配的混合标准溶液 (80 μg/l) 的 SRM 总离子流图 1. Metaproterenol; 2. Cimaterol; 3. D 7 -Cimaterol; 4. Terbutaline; 5. Salbutamol; 6. D 6 -Salbutamol; 7. Cimbuterol; 8. D 9 -Cimbuterol; 9. Procaterol; 10. Fenoterol; 11. Ritodrine; 12. Clencyclohexerol; 13. Clenproperol; 14. D 7 -Clenproperol; 15. Ractopamine; 16. D 5 -Ractopamine; 17. Clenbuterol; 18. D 6 -Clenbuterol; 19. Bromchlorbuterol; 20. Metoprolol; 21. Tulobuterol; 22. Formoterol; 23. Brombuterol; 24. Mabuterol; 25. D 9 -Mabuterol; 26. Clenpenterol; 27. Bambuterol; 28. Clenisopenterol; 29. Mapenterol; 30. D 11 -Mapenterol; 31. Labetalol; 32. Propranolol; 33. Betaxolol; 34. Clenhexerol; 35. Penbutolol; 36. Salmeterol; 37. D 3 -Salmeterol. 779

7 吴永宁等 : 高效液相色谱 - 线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留图 2 基质匹配的混合标准溶液 (80 μg/l) 的 SRM 定量离子提取色谱图 780

8 中国科学 B 辑 : 化学 2009 年第 39 卷第 8 期表 4 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂在猪肉样品中的加标回收实验结果化合物加标水平 (5 μg/kg) 加标水平 (10 μg/kg) 加标水平 (20 μg/kg) 平均回收率 (%, n=6) RSD(%) 平均回收率 (%, n=6) RSD(%) 平均回收率 (%, n=6) RSD(%) Metaproterenol Cimaterol Terbutaline Salbutamol Cimbuterol Procaterol Fenoterol Ritodrine Clencyclohexerol Clenproperol Ractopamine Clenbuterol Bromchlorbuterol Metoprolol Tulobuterol Formoterol Brombuterol Mabuterol Clenpenterol Bambuterol Clenisopenterol Mapenterol Labetalol Propranolol Betaxolol Clenhexerol Penbutolol Salmeterol 密度良好. 加标回收实验结果表明本方法的精密度和准确度基本良好, 除个别物质外, 基本符合欧盟 2002/657/EC [24] 对残留检测方法的规定. 3.6 实际样品分析利用建立的检测方法, 采集北京地区不同区域不同市场的猪肉及鸡肉样品进行检测, 只有一例鸡肉样品同时检出克伦特罗 (clenbuterol) 与莱克多巴胺 (ractopamine), 含量分别为 2.31 和 2.17 μg/kg, 未检出其他 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂. 其 SRM 定量离子提取的色谱图见图 3. 检出率虽然较低, 但暴露出新的问题, 饲料中添加的 β 2 - 受体激动剂类药物已由单一添加改为多种药物同时添加, 饲料中单一药物剂量减少, 导致畜禽体内单一药物的蓄积量减少, 而蓄积动物体内的 β- 兴奋剂类药物种类增多, 造成引起食物中毒的情况并未得到有效缓解, 不同药物的协同毒性可能更甚于单一药物. 因此, 本文建立的灵敏度高, 多组分同时检测的方法, 能够更好的应用于市场动物性食品中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留的监管. 781

9 吴永宁等 : 高效液相色谱 - 线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留图 3 鸡肉样品的 SRM 定量离子提取色谱图 4 结论随着克伦特罗与莱克多巴胺在国内外的禁用和监控的加强, 利益的驱使将促进不法分子将其他 β 2 - 受体激动剂, 如沙丁胺醇西玛特洛溴布特罗等非法添加与动物饲养和饮水中. 除单组分残留测定外, 多组分残留测定方法的建立是 β 2 - 受体激动剂残留分析的重要发展方向. 本文建立了 HPLC-MS 同时检测肌肉中 23 种 β 2 - 受体激动剂及 5 种 β- 阻断剂的分析方法. 该方法简便快速, 可以同时检测 23 种 β 2 - 受体激动剂和 5 种 β- 阻断剂药物残留, 具有较高的灵敏度高, 最低检出限均可以达到 0.2 μg/kg, 实际样品在 5 μg/kg 的加标水平下基本能达到较好的回收率, 更适用于动物性食品中 β- 兴奋剂的多残留分析检测, 能够更好的应用于市场动物性食品中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留的监管. 致谢本工作得到国家自然科学重点基金 ( 批准号 : ) 和十一五国家科技支撑计划 ( 编号 : 2006BAK02A27, 2006BAK01A02-5) 项目资助, 特此一并致谢. 参考文献 1 Wellenreiter R H, Tonkinson L V. Effect of ractopamine hydrochloride on growth performance of turkeys. Poul Sci, 1990, 69: Andersom D B, Veenhuizen E L, Wagner J F, Wray M I, Mowrey D H. The effect of ractopamine hydrochloride on nitrogen retention, growth performance and carcass composition of beef cattle. J Anim Sci, 1989, 67: Watkins L E, Jones D J, Mowrey D H, Andersom D B, Veenhuizen E L. The effect of various levels of ractopamine hydrochloride on the performance and carcass characteristics of finishing swine. J Anim Sci, 1990, 68: Martinez-Navarro J F. Food poisoning related to consumption of illicit β-agonist in liver. Lancet, 1990, 336: 1311[DOI] 782

10 中国科学 B 辑 : 化学 2009 年第 39 卷第 8 期 5 Maistro S, Chiesa E, Angeletti R. Beta blockers to prevent clenbuterol poisoning. Lancet, 1995, 346: 180[DOI] 6 Leyssens V, van der Greef J, Penxten H, Czech J, Noben J P, Adriaensens P, Gelan J, Raus J. In: Proceedings of the Euroresidue II Conference, Veldhoven, The Netherlands, 3~5 May 1993, 吴永宁, 邵兵, 沈建忠. 兽药残留检测与监控技术 - 食品安全关键技术系列图书. 北京 : 化学工业出版社, Commission of the European Communities, Council Directive 96/23/EC (1996). Official Journal of the European Communities No. L125, 10 9 中华人民共和国农业部第 235 号公告动物性食品中兽药最高残留限量 Lawrence J F, Menard C. Determination of clenbuterol in beef liver and muscle tissue using immunoaffinity chromatographic cleanup and liquid chromatography with ultraviolet absorbrance detection. J Chromatogr B, 1997, 1999, 728: 67 73[DOI] 11 Lamparczyk H, Zarzycki P K, Nowakowska J. App lication of beta-cyclodextrin for the analysis of estrogenic steroids in human urine by high-performance liquid chromatography. Chromatographia, 1994, 38: [DOI] 12 van Vyncht G, Preece S, Gaspar P. Gas and Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spect rometry for Multiresidue Analysis of β2-agonist s in Biological Mat rices. J Chromatogr A, 1996, 750(122): 43 49[DOI] 13 Sangiogi E, Curatolo M. Application of a sequential analytical procedure for the detection of β 2 agonist brombuterol in bovine urine samples. J Chromatogr B Biomed Appl, 1997, 693(2): [DOI] 14 Femando R, Assuncao C, Paulo C, Tânia E, Manuel S J, da Conceiçao C M, da Silveira N, Irene M. Clenbuterol food poisoning diagnosis by gas chromatography-mass scpectrometric serum analysis. Anal Chim Acta, 2003, 483(1-2): [DOI] 15 Shao B, Jia X F, Zhang J. Multi-residual analysis of 16 b-agonists in pig liver, kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Food Chemistry, 2009, 114: [DOI] 16 Moragues F, Igualada C. How to decrease ion suppression in a multiresidue determination of β2-agonists in animal liver and urine by liquid chromatography-mass spectrometry with ion-trap detector. Anal Chim Acta, 2009, 637: [DOI] 17 Boyd D, O Keeffe M, Smyth M R. Matrix solid-phase dispersion as a multiresidue extraction technique for β2-agonists in bovine liver tissue. Analyst, 1994, 119: [DOI] 18 Bocca B, Fiori M, Cartoni C, Brambilla G. Simultaneous determination of Zilpaterol and other beta agonists in calf eye by gas chromatography/tandem mass spectrometry. J AOAC Int, 2003, 86(1): Lau J H, Khoo C S, Murby J E. Determination of clenbuterol, salbutamol, and cimaterol in bovine retina by electrospray ionization-liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J AOAC Inter, 2004, 87(1): Elliott C T, Thompson C S, Arts C J, Crooks S R, van Baak M J, Verheij E R, Baxter G A. Screening and confirmatory determination of ractopamine residue in calves treated with growth promoting doses of the beta-agonist. Analyst, 1998, 123: [DOI] 21 Shen J Z, Zhang Z, Yao Y, Shi W M, Liu Y B, Zhang S X. Time-resolved fluoroimmunoassay for ractopamine in swine tissue. Anal Bioanal Chem, 2007, 387(4): [DOI] 22 Dolores M, Hernando M, Gómez J, Agüera A, Fernández-Alba A R. LC-MS analysis of basic pharmaceuticals (beta-blockers and anti-ulcer agents) in wastewater and surface water. Trends in Anal Chem, 2007, 26: [DOI] 23 Lee H B, Sarafin K, Thomas E P. Determination of β-blockers and β2-agonists in sewage by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 2007, 1148: [DOI] 24 Commission of the European Communities, Council Directive 2002/657/EC Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results (2002). Official Journal of the European Communities No. L

11 吴永宁等 : 高效液相色谱 - 线性离子阱质谱法测定畜禽肌肉中 β 2 - 受体激动剂及 β- 阻断剂类药物残留 Determination of 23 β 2 -agonists and 5 β-blockers in animal muscle by High Performance Liquid Chromatography-linear ion trap mass spectrometry WU YongNing 1,2, MIAO Hong 1, FAN Sai 1,2 & ZHAO YunFeng 1,2 1. Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese Centre for Disease Control and Prevention, Beijing , China; 2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing , China Abstract: A delicate method has been developed for the simultaneous determination of 23 β 2 -agonists and 5 β-blockers illegal drugs in muscle tissues by high performance liquid chromatography-linear ion trap mass spectrometry using isotope dilution technique. The muscle samples are acid hydrolyzed and extracted with 5% trichloracetic acid in water, and then cleaned up using MCX solid phase extraction (SPE) cartridge. Methanol and 0.1% formic acid are used as mobile phases for gradient elution, a Waters Atlantis T3 column is used for separation, and ESI positive ion scan mode is used with selective reaction monitor(srm). 9 β 2 -agonists labeled by the deuterium isotope were used as internal standards for quantification. The linear ranges of 23 β 2 -agonists and 5 β-blockers are 5~200 μg/l, the coefficient of correlation is not less than 0.995, and the limit of detection for each compound in the muscle tissue is below 0.2 μg/kg. The recoveries of each compound in the spiked samples at three levels 5, 10, 20 μg/kg are in the range of 47.3%~123.7%, and the relative standard deviations are in the range of 3.2%~25.7%. The developed method is sensitive and specific for the determination of β 2 -agonists and β-blockers in pork and chicken muscle samples. Keywords: β 2 -agonists, β-blockers, muscle, determination, HPLC-ITMS 784

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.