一摘要 Malassezia 為一種親脂性酵母菌, 在人或犬貓的皮膚角質層或毛囊為正常菌株, 通常分布於油脂分泌旺盛的部位 Malassezia 常被視為一些皮膚病的條件致病性真菌, 例如頭皮屑汗斑脂漏性皮膚炎與某些異位性皮膚炎等由於 Malassezia 為親脂性酵母菌, 因此 lipas

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清李
9 years ago
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2 一摘要 Malassezia 為一種親脂性酵母菌, 在人或犬貓的皮膚角質層或毛囊為正常菌株, 通常分布於油脂分泌旺盛的部位 Malassezia 常被視為一些皮膚病的條件致病性真菌, 例如頭皮屑汗斑脂漏性皮膚炎與某些異位性皮膚炎等由於 Malassezia 為親脂性酵母菌, 因此 lipase 是此菌種賴以維生的重要外泌型酵素, 且 lipase 作用之後的產物被認為是一種過敏原, 此種過敏原可能是引起宿主皮膚產生病變的原因之一, 因此認為抑制此菌種的 lipase 將有助於改善相關疾病症狀本研究目的即在於測試中草藥對病原菌 Malassezia 的抑菌作用與對 lipase 之抑制效果本實驗利用敏感性試驗, 篩選中草藥的精油對 Malassezia 的抑菌效果, 分析效果最顯著的精油的組成成分, 並確認其主成分 -citral, 在 250 mg/ml 的確有明顯的抑菌作用另一方面建立 lipase 抑制物活性篩選帄台, 利用 M. globosa 的菌體 lipase 粗萃取液, 在 1 mm pnpp 受質下的微量分析方法, 有最佳判讀依據, 同時分析 citral 對 lipase 活性之影響, 發現對 lipase 活性的抑制效果遠不及抑菌作用, 顯示 citral 有其他的抑制機制, 有待進一步釐清二背景介紹中草藥富含許多活性成分, 近年來應用於天然保養品中佔有廣大的消費市場, 在本草綱目記載中也不乏許多天然植物可作為治療皮膚病, 防止皮膚龜裂紫外線傷害增強皮膚健康預防色素沈澱皺紋產生以及美白的效果等 Malassezia 菌屬是唯一在正常人體表皮共生的親脂性酵母

3 菌 (2), 其 lipase 之作用產物被認為可引起多種的皮膚病變, 如汗斑 (pityriasis versicolor) 毛囊炎(folliculitis) 異位性皮膚炎 (atopic dermatitis) 脂漏性皮膚炎(seborrhoeic dermatitis) 頭皮屑 (dandruff) 乾癬(psoriasis) 等若污染人工導管, 亦會導致系統性的疾病, 產生腹膜炎或菌血症 ; 同時也會造成許多寵物的皮膚炎 (1,3) 在 Malassezia 菌屬中, 只有 M. pachydermatis 不需外來油脂才能生長 (4), 這種油脂依賴性乃是菌體無法合成 myristic acid, 而導致無法和成長鏈脂肪酸因此參與油脂代謝的酵素對於 Malassezia 菌之生長與致病力是必須的, 所以此類酵素可視為是 Malassezia 菌重要致病因子 (virulence factors)(5) Lipases (EC ) 可水解三酸甘油酯的酯鍵, 而釋出游離的脂肪酸, 而 Malassezia 菌屬需要外來的油脂才能存活, 所以 lipase 的活性是這類微生物存活的關鍵, 目前有 M. furfur (6) 以及 M. pachydermatis (7) 的 lipase 基因被選殖出來為了利用外來的油脂, Malassezia 菌屬的基因組中含有高量的分泌型的 lipases ( 有 13 種 ) 與 phospholipases ( 有 9 種 ) 基因存在 ; 從 RT-PCR 與 proteomics 的實驗結果發現, 在頭皮上有數種 lipase 與 phospholipase 基因之表現 (8) 因此我們針對 Malassezia 菌種賴以維生的重要酵素作抑制測試, 從中草藥精油中篩選可能抑制 lipase 的活性物質, 了解其對病原菌 Malassezia 的抑菌作用與對 lipase 之抑制效果三實驗方法 1. 敏感性試驗 (Susceptibility testing)

4 Malassezia 菌種於 30 C,modified Dixon agar ( 含 1.0% Tween 40, 0.2% glycerol, 2.0 % desiccated oxbile 0.6% peptone,0.2% oleic acid,3.6 % malt extract broth and 1.2% bacto agar) 上培養取單一菌落培養於 30,modified Dixon broth 中 48hr, 以 DMSO 稀釋各種中草藥精油, 將菌液 1/100 稀釋後, 再加入 1/100 反應體積的各種中草藥精油, 使精油最終稀釋 1000 倍,DMSO 最終稀釋 100 倍, 並培養於 96 well 盤中 48hr 後, 取 50μl 培養於 modified Dixon agar 上,30 培養 48hr 2. Lipase 酵素活性測定法以 p-nitrophenyl palmitate (pnpp) 法測定 lipase 酵素之活性, 於 37 進行反應, 並以分光光度計監測 405 nm 波長之吸光變化將菌種於 modified Dixon broth 培養, 離心分別收集菌體與上清液取菌體與 3 ml 緩衝液 (MES 10mM,1% Triton X-100; ph 5.5) 使之破菌, 取上清液即為酵素粗萃取液取適當濃度之酵素粗萃取液, 加入不同濃度的篩選物後, 與 100 μl 反應緩衝液 (MES 10mM, 1% Triton X-100, 2 mm pnpp; ph 5.5) 混合, 於 37 反應 1 小時, 測量 405 nm 波長之吸光變化四實驗結果 1. 抑菌作用藉由敏感性試驗, 經過多種精油的篩選之後, 發現精油中有一種較為明顯, 進而分析其主成分為 citral, 因此進一步分析

5 citral 對 M. furfur 的抑菌作用結果顯示 citral 大概在 239μg/ml 與 265 μg/ml 濃度間有明顯的抑菌作用 ( 圖一 ), 藉此推測其最低抑菌濃度約為 250μg/ml, 且 citral 對 M. furfur 的抑菌與殺菌濃度範圍似乎相當狹窄, 在 295μg/ml 時可見到菌落所剩無幾 DMSO (control) Citral 239μg/ml Citral 265μg/ml Citral 295μg/ml 圖一 citral 對 M. furfur 的抑菌作用 2. Malassezia lipase 抑制物活性篩選為建立 Malassezia lipase 活性測試帄台, 乃先選擇 M. globosa M. furfur 與 M. pachydermatis 測試其 lipase 活性 ; Malassezia 培養於 modified Dixon broth 至混濁後 (5-10 天 ), 分別收下菌體 (pellet) 與上清液 (supernatant), 以 2 mm 之 pnpp 進行活性測試, 結果以 M. globosa 的菌體 lipase 活性最容易偵測 ( 圖二 ), 考量到實驗準備難易度, 因此決定利用 M. globosa 的菌體

6 lipase 進行抑制物活性篩選圖二各菌株 lipase 活性測試以 2 mm pnpp, 加入不同量的粗. 萃取酵素液 (50μl,100μl,200μl) 進行活性測試 Blank 未加酵素粗萃取液, 以作為濁度對照組為建立 Malassezia lipase 抑制物活性篩選帄台, 首先以 2 mm pnpp 進行活性篩選, 篩選物為各種精油, 發現加入 1/100 反應體積的精油後, 整個反應液呈現混濁現象, 而干擾吸光值的偵測, 推測酵素受質 -pnpp 與精油皆為疏水性物質, 雖然反應緩衝液中含有 1% Triton X-100, 但溶解度仍低, 因此降低酵素受質 -pnpp 的濃度, 改以 1 mm pnpp 進行 lipase 抑制物活性篩選, 結果發現精油 1-3 對 lipase 活性, 似乎有一點抑制效果 ( 圖二 ) 雖然溶解度問題有所改善, 但發現許多精油帶有顏色, 在最終稀釋濃度為 100 倍下, 仍有明顯的顏色會干擾吸光值判讀, 因此進一步再降低精油的濃度, 重新篩選先將精油利用 DMSO 稀釋 10 倍, 再加入 1/100 反應體積的精油, 使精油最終稀釋濃度為 1000 倍, 而 DMSO 最終稀釋濃度為 100

7 倍在此情況下, 認為精油顏色的吸光干擾有變小的現象 ( 圖三 ), 因此以此為篩選帄台, 進行後續的 lipase 抑制物活性分析圖三 lipase 抑制物活性篩選以 1 mm pnpp,50 l 酵素粗萃. 取液, 分別加入各種精油, 使最終稀釋 100x. 圖四 lipase 抑制物活性篩選以 1 mm pnpp,50 l 酵素粗萃取液, 分別加入各種精油, 使最終稀釋 1000x

8 3. Citral 對 lipase 活性之影響藉由敏感性試驗篩選, 發現 Citral 對 M. furfur 有明顯的抑菌效果, 因此進一步分析其對 lipase 活性之影響 ; 結果發現, 當 Citral 的濃度提高至 4.5 mg/ml 時, 對於 lipase 的確有抑制作用 ( 圖四 ). 圖五 Citral 對 lipase 活性之影響以 1 mm pnpp,50 l 酵素粗萃取液, 加入不同濃度 citral 五討論由於 Malassezia 菌屬的生長速度不一, 因此本研究中主要以 Malassezia furfur 及 Malassezia globosa 為主要的研究菌株在本次研究中, 篩選出中草藥之精油內有一活性物質, 即為 Citral, 對於 Malassezia 菌屬有抑菌的效果, 在較高濃度下, 對於 lipase 也有抑制其活性的效果, 但 citral 對 lipase 活性的抑制效果遠不及抑菌作用, 顯示 citral 有其他的抑制機制, 有待進一步釐清 Malassezia 菌屬對於 Citral 有一定的感受性, 可作為之後的研究方向, 了解 Citral 對 Malassezia 菌屬的抑菌機制為何, 進而瞭解

9 Malassezia 菌屬的致病機制, 希望可以作為治療此類皮膚病變的新途徑六參考資料 1. M. J. CRESPO,* M. L. ABARCA, AND F. J. CABAN ES.1999, Isolation of Malassezia furfur from a Cat,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,, p Ashbee, H. R., and E. G. Evans Immunology of diseases associated withmalassezia species. Clin Microbiol Rev 15: Gupta, A. K., R. Batra, R. Bluhm, T. Boekhout, and T. L. Dawson, Jr Skin diseases associated with Malassezia species. J Am Acad Dermatol 51: Guillot, J., S. Hadina, and E. Gueho The genus Malassezia: old facts and new concepts. Parassitologia 50: Batra, R., T. Boekhout, E. Gueho, F. J. Cabanes, T. L. Dawson, Jr., and A. K. Gupta Malassezia Baillon, emerging clinical yeasts. FEMS Yeast Res 5: Brunke, S., and B. Hube MfLIP1, a gene encoding an extracellular lipase of the lipid-dependent fungus Malassezia furfur. Microbiology 152: Shibata, N., N. Okanuma, K. Hirai, K. Arikawa, M. Kimura, and Y. Okawa Isolation, characterization and molecular cloning of a lipolytic enzyme secreted from Malassezia pachydermatis. FEMS Microbiol Lett 256: Dawson, T. L., Jr Malassezia globosa and restricta: breakthrough understanding of the etiology and treatment of dandruff and seborrheic dermatitis through whole-genome analysis. J Investig Dermatol Symp Proc 12:15-9.

脂漏性皮膚炎之介紹及其藥物治療暫時性受損, 導致 C18:1 的數量增加而病因素, 整理如表一所示 C18:2 的數量減少 1 下列將 SD 可能的致表一可能造成脂漏性皮膚炎的因素 1

脂漏性皮膚炎之介紹及其藥物治療暫時性受損, 導致 C18:1 的數量增加而病因素, 整理如表一所示 C18:2 的數量減少 1 下列將 SD 可能的致表一可能造成脂漏性皮膚炎的因素 1 第 2 期脂漏性皮膚炎之介紹及其藥物治療國軍臺中總醫院藥劑科藥師謝永宏吳承恩陳俊源國軍臺中總醫院醫師陳冠宇壹前言脂漏性皮膚炎 (seborrheic dermatitis, SD) 是一種慢性的發炎性疾病, 常可在脂漏性腺體發達的地方發現,