试验部分 1.1 仪器, 试剂与材料 Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱纯水机,Milli-Q 台式高速离心机漩涡震荡仪移液枪乙腈,HPLC 级 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱,60 mg,3 ml 1.2 样

Size: px

Start display at page:

Download "试验部分 1.1 仪器, 试剂与材料 Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱纯水机,Milli-Q 台式高速离心机漩涡震荡仪移液枪乙腈,HPLC 级 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱,60 mg,3 ml 1.2 样"

讲卜百陆
7 years ago
Views:

1 [ 应用纪要 ] 黄德凤,Kim Van Tran.,Michael S. Young,Jeremy C. Shia 沃特世公司应用优势样品处理方法可以同时净化不同种类的兽药残留 Quanpedia 数据库方便 LCMSMS 方法开发符合法规要求的方法灵敏度稳定的和精密度摘要本实验使用一种新型固相萃取小柱 (Oasis PRiME HLB) 处理牛奶样品, 建立牛奶中多兽药残留同时检测的检测方法牛奶样品经酸化乙腈提取并沉淀蛋白,Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱通过式净化处理, 经 UPLC -MSMS 检测对样品前处理过程和液相质谱条件进行了优化结果表明, 在 0.1~10.0 µg/l 的添加浓度范围内, 磺胺喹诺酮 β- 受体激动剂大环内脂类糖皮质激素氯霉素头孢青霉素类, 四环素类等常见的 9 大类, 共 72 种抗生素在 50~130%, 精密度 RSD <20%() 该方法简单快速准确, 适合牛奶中多兽药残留的筛查分析沃特世解决方案 ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S 系统 Quanpedia 数据库 Oasis PRiME HLB SPE 技术 AQUITY UPLC BEH C µm 色谱柱关键词 Oasis PRiME HLB, 牛奶, 多兽药残留 ACQUTIY UPLC 系统与 Xevo TQ-S 联用 1

2 试验部分 1.1 仪器, 试剂与材料 Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱纯水机,Milli-Q 台式高速离心机漩涡震荡仪移液枪乙腈,HPLC 级 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱,60 mg,3 ml 1.2 样品处理取鲜牛奶 1.00 ml, 加入 0.2% 甲酸乙腈 4 ml, 旋涡震荡 1 min,10000 r/min 高速离心 5 min, 取上清液准备过 PRiME HLB 固相萃取柱前言兽药残留 (Veterinary drug residue), 是指动物在使用了兽药后, 蓄积或储存在动物细胞组织或器官内的药物原型有毒性的代谢物或杂质我国在畜牧养殖方面使用较多的兽药主要有磺胺类喹诺酮类 β- 受体激动剂类大环内脂类糖皮质激素类氯霉素类头孢类青霉素类等滥用这些药物易造成畜牧产品的严重污染, 并通过代谢途径进入奶制品中, 最终通过食物链可在人体内蓄积, 并且这些药物具有导致过敏反应和使人体产生抗药性等副作用因此, 监测多种兽药在牛奶为代表的奶制品中的残留对保证奶品的安全具有积极意义目前, 相关标准和文献报道的多兽药残留的同时检测方法大多按照兽药种类分成若干种检测方法, 多种类的兽药同时检测分析受制于缺乏统一的前处理方法而不能实现同时, 多兽药残留同时检测的 LC/MSMS 仪器方法也具有相当的挑战性本方法中样品处理采用了沃特世 (Waters ) 最新 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱, 该产品创新的填料技术能够有效吸附牛奶中的磷脂等非极性干扰物, 结合蛋白沉淀技术, 能够有效去除牛奶样品中的大部分基质干扰, 获得准确分析结果取 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱,3 ml 80% 乙腈清洗 * 将上清液上 SPE 小柱, 保持一秒一滴的流速, 收集全部流出液, 氮气下吹干,1 ml 5% 甲醇水溶液定容, 过微孔滤膜, 上 LCMSMS 测试采用 Waters UPLC/Xevo TQ-S 系统, 结合 QUANPEDIA TM 兽药筛查数据库, 建立稳定高效的多兽药残留液相色谱串联四极杆分析方法 [*]:Oasis 系列 SPE 小柱不需要活化与平衡, 可直接上样本实验中预先用 3 ml 80% 乙腈清洗小柱的目的是该方式下不需要使用抽真空, 仅在重力作用下即可完成过柱有负压装置的试验室可省略此步骤, 过柱需要 2~3 psi 的负压条件 2

3 1.3 仪器条件液相条件色谱柱 : Waters BEH C 18 色谱柱 ( mm,1.7 µm) 流动相 : A:10 mm 乙酸铵 ( PH=5) 水溶液 B:10 mm 乙酸铵 ( PH=5) 甲醇溶液梯度 : 0 到 0.25 min,2% B;0.25 到 min,2% B 升至 99% B; min 到 min,99% B; 到 min,99% B 到 2% B;13.01 到 17 min,2% B 流速 : 0.45 ml/min 柱温 : 45 样品温度 : 10 进样量 : 5 µl 结果与讨论样品处理的优化牛奶基质复杂, 含有大量的蛋白以及非极性磷脂类干扰物, 形成基质干扰, 因此必须净化牛奶的复杂基质, 同时释放出目标, 减少基质影响试验中使用不同浓度甲酸酸化的乙腈溶液, 按不同比例加入牛奶样品, 提取目标, 同时沉淀蛋白试验中尝试了 0.2% 甲酸和 1% 甲酸两种不同比例的有机酸, 同时比较了乙腈和样品比例为 3:1 和 4:1 分别提取净化试验结果表明当采用 1% 甲酸乙腈和样品比例为 4:1 时蛋白沉淀效果最好, 但是 1% 甲酸的添加对磺胺类等碱性影响较大, 原因可能是酸性条件下碱性的离子化趋势增大, 在高比例有机相中溶解性减弱实验最终选用 0.2% 甲酸乙腈,4:1 比例加入样品提取并沉淀蛋白质谱条件离子源 : ESI + 采集方式 : MRM 毛细管电压 : 3.5 kv 离子源温度 : 150 脱溶剂气温度 : 600 脱溶剂气流速 : 1000 L/h 锥孔气 : 150 L/h 碰撞气流速 : 0.15 ml/min 图 % 甲酸和 1.0% 甲酸条件下磺胺类的对比注 : 部分缺失柱状图的磺胺表示未能测到稳定的 3

4 牛奶中大量磷脂的存在, 极大地干扰目标的分析, 同时降低色谱柱寿命, 增大仪器系统的维护成本和难度试验采用 Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱净化样品, 能有效去除磷脂等非极性干扰物同时, 采用通过式净化策略也极大地提高了样品分析通量图 2 比较了仅通过沉淀蛋白净化和经沉淀蛋白后 PRiME HLB 净化的空白牛奶样品的磷脂监测信息图 2. 蛋白沉淀和 Oasis PRiME HLB 两种净化方式对磷脂净化效果比较上图可以看出, 未经 SPE 净化的样品磷脂含量明显高于经过 SPE 净化的样品 4

5 仪器方法的优化多残留分析的仪器方法开发费时耗力, 且常常带来实验室间方法开发的差异, 导致实验室间检测结果的差异本实验 UPLC/MSMS 方法建立过程使用的 Waters QUANPEDIA 数据库库中包含了 1000 多种的 LC-MS/MS 方法, 这些包含了几乎所有的食品检测所要求的兽药种类 Waters QUANPEDIA 数据库能够提供现成的仪器方法数据包括 : 各的从液相条件采集方法到定量处理方法的完整的方法包供实验人员调用, 免去用户的方法开发流程, 最大程度的减少了方法开发的难度和误差, 减少实验室的工作量和时间金钱成本表 1. 各 MRM 信息及保留时间西马特罗 Cimaterol 盐酸克伦特罗 Clenbuterol 莱克多巴胺 Ractopamine 沙丁胺醇 Salbutamol 特布他林 Terbutaline 妥布特罗 TμLobuterol 齐帕特罗 Zilpaterol 克林霉素 Clindamycin 红霉素 Erythromycin 吉他霉素 kitasamycin 林可霉素 Lincomycin 螺旋霉素 Spiramycin 替米考星 Tilmicosin 泰乐菌素 Tylosin 土霉素 Oxytetracycline 电离模式母离子 CV (V) 碎片离子 CE (V) RT (min) ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI

6 四环素 Tetracycline 磺胺苯酰 Sulfabenzamide 磺胺氯哒嗪 Sulfachlorpyridazine 磺胺氯吡嗪 Sulfaclozine 磺胺嘧啶 Sulfadiazine 磺胺二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine 磺胺脒 / 磺胺胍 Sulfaguanidine 磺胺甲嘧啶 Sulfamerazine 磺胺甲氧嘧啶 Sulfameter 磺胺二甲基嘧啶 Sulfamethazine 磺胺甲二唑 Sulfamethizole 磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole 磺胺甲氧哒嗪 Sulfamethoxypyridazine 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine 磺胺恶唑 Sulfamoxol 磺胺醋酰 Sulfanilacetamide 磺胺苯吡唑 Sulfaphenazole 磺胺吡啶 Sulfapyridine 磺胺喹噁啉 Sulfaquinoxaline 磺胺噻唑 Sulfathiazole 电离模式母离子 CV (V) 碎片离子 CE (V) RT (min) ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI

7 磺胺二甲基异嘧啶 Sulfisomidine 磺胺异恶唑 Sulfisoxazole 甲氧苄啶 ( TMP) Trimethoprim 西诺沙星 Cinoxacin 环丙沙星 Ciprofloxacin 达氟沙星 Danofloxacin 双氟沙星 Difloxacin 伊诺沙星 Enoxacin 恩诺沙星 Enrofloxacin 氟甲喹 Flumequine 洛美沙星 Lomefloxacin 麻保沙星 Marbofloxacin 萘啶酸 Nalidixic acid 诺氟沙星 Norfloxacin 氧氟沙星 Ofloxacin 奥比沙星 Orbifloxacin 噁喹酸 Oxolinic acid 培氟沙星 Pefloxacin 沙拉沙星 Sarafloxacin 氯霉素 Chloramphenicol 电离模式母离子 CV (V) 碎片离子 CE (V) RT (min) ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI+ ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI

8 氟苯尼考 Florfenicol 甲砜霉素 Thiamphenicol 阿莫西林 Amoxicillin 青霉素 V Penicillin V 倍他米松 Betamethasone 可的松 Cortisone 地塞米松 Dexamethasone 氢化可的松 Hydrocortisone 泼尼松 Meprednisone 甲基泼尼松龙 Methylprednisolone 氢化泼尼松 Prednisolone 曲安西龙 Triamcinolone 曲安奈德 Triamcinolone acetonide 头孢氨苄 Cefalexin 头孢喹肟 Cefotaxime 头孢噻呋 Ceftiofur 头孢匹林 Cephapirin 电离模式母离子 CV (V) 碎片离子 CE (V) RT (min) ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI+ ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI ESI+ ESI ESI

9 方法和精密度采用在空白牛奶处理液中添加标准溶液的方法进行添加测定分别添加 0.1 µg/l,0.5 µg/l, 1.0 µg/l, 和 10 µg/l 4 个浓度水平, 按所建立的方法进行样品处理及测定, 每个浓度水平进行 5 次重复测定定量方法采用空白基质标准曲线, 外标法定量平均加标和精密度见表 2 表 2. 各的加标 RSD() 及基质效应加标 0.1 µg/l 加标 0.5 µg/l 加标 1.0 µg/l 加标 10.0 µg/l 基质效应 RSD RSD RSD RSD 加标 10.0 µg/l 西马特罗盐酸克伦特罗莱克多巴胺沙丁胺醇特布他林妥布特罗齐帕特罗克林霉素红霉素吉他霉素林可霉素螺旋霉素替米考星泰乐菌素土霉素四环素磺胺苯酰磺胺氯哒嗪磺胺氯吡嗪磺胺嘧啶磺胺二甲氧嘧啶磺胺脒磺胺甲嘧啶磺胺甲氧嘧啶磺胺二甲基嘧啶磺胺甲二唑磺胺甲恶唑磺胺甲氧哒嗪磺胺间甲氧嘧啶磺胺恶唑磺胺醋酰磺胺苯吡唑磺胺吡啶

10 加标 0.1 µg/l 加标 0.5 µg/l 加标 1.0 µg/l 加标 10.0 µg/l 基质效应 RSD RSD RSD RSD 加标 10.0 µg/l 磺胺喹噁啉磺胺噻唑磺胺二甲基异嘧啶磺胺异恶唑甲氧苄啶 ( TMP) 西诺沙星环丙沙星达氟沙星双氟沙星伊诺沙星恩诺沙星氟甲喹洛美沙星麻保沙星萘啶酸诺氟沙星氧氟沙星奥比沙星噁喹酸培氟沙星沙拉沙星氯霉素氟苯尼考甲砜霉素阿莫西林青霉素 V 倍他米松可的松地塞米松氢化可的松泼尼松甲基泼尼松龙氢化泼尼松曲安西龙曲安奈德头孢氨苄头孢噻肟头孢噻呋头孢匹林

11 结论实验成功建立了同时测定 9 类共 72 种兽药残留的分析方法分析结果满足牛奶中兽药残留相关法规的限量要求和, 精密度要求 Oasis PRiME HLB SPE 简单的通过式净化处理能有效去除牛奶中磷脂等干扰物, 样品处理过程简单, 有效, 适合大批量日常分析检测 Waters QUANPEDIA 数据库平台包含多兽药残留分析所需要的 LCMSMS 方法为试验室仪器方法开发带来极大的便利沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,The Science of What s Possible,Oasis,UPLC,ACQUITY UPLC,Xevo 是沃特世公司的注册商标 QUANPEDIA 是沃特世公司的商标其它所有商标均归各自的拥有者所有 2015 年沃特世公司印制于中国 2015 年 6 月 ZH 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

Oasis PRiME HLB-UPLC-MS-MS测定猪肉中78种兽药残留

Oasis PRiME HLB-UPLC-MS-MS测定猪肉中78种兽药残留黄德凤, Kim Van Tran, Michael S. Young, Jeremy C. Shia 沃特世公司应用优势通过使用 Oasis PRiME HLB 这种独特填料的 SPE 技术, 第一次实现了猪肉组织中多种兽药同时分析的样品处理方法采用通过式的 SPE 净化策略, 使得样品处理过程简单方便快速该方法能清除掉样品中 99% 的磷脂类基质干扰物, 使得质谱分析的基质效应降到最低,