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1 2015 年 4 月 Vol.33 No.4 April 2015 Chinese Journal of Chromatography 348 ~ 353 研究论文 DOI: / SP.J 固相萃取高效液相色谱串联质谱法同时测定养殖海水中 23 种抗生素杜鹃, 赵洪霞, 陈景文 ( 工业生态与环境工程教育部重点实验室, 大连理工大学环境学院, 辽宁大连 ) 摘要 : 建立了固相萃取高效液相色谱串联质谱 (SPE HPLC MS / MS) 同时检测水中 6 类 23 种抗生素的分析方法水样用固相萃取柱富集净化, 通过对比水样在不同上样 ph 洗脱液用量等条件下的回收率, 优化了前处理方法采用 0 1% (v / v) 甲酸 1 g / L 甲酸铵水溶液和甲醇乙腈 (1 1, v / v) 体系作为流动相, 经过梯度洗脱进行分离, 在 HPLC MS / MS 多反应监测模式下进行定性定量分析结果显示,23 种抗生素的方法检出限 ( MDL) 范围为 0 1 ~ 2 9 ng / L, 加标回收率为 47 3% ~ 132 6% 采用该方法对东营海水养殖区 5 个养殖池水样进行了检测, 除青霉素类之外的各类抗生素均有检出, 其中磺胺增效剂甲氧苄氨嘧啶的检出率达 100%, 氯霉素类抗生素氟甲砜霉素检出的最高质量浓度达到 ng / L 结果表明, 所建立的方法高效灵敏可靠, 可用于海水中多种抗生素的分析关键词 : 固相萃取 ; 高效液相色谱串联质谱 ; 抗生素 ; 养殖海水中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2015) Simultaneous determination of 23 antibiotics in mariculture water using solid phase extraction and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry DU Juan, ZHAO Hongxia, CHEN Jingwen (Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering of Ministry of Education, Department of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian , China) Abstract: A method for the determination of 23 antibiotics from 6 categories in water was developed by using solid phase extraction and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( SPE HPLC MS / MS). Water samples were enriched and cleaned up by sol id phase extraction cartridges. The MS detection parameters of the analyzed antibiotics, the ph values of loading buffers and the volumes of the eluents were optimized by comparing the sam ple recoveries under different conditions. All antibiotics were separated by gradient elution with the mobile phases of 0 1% (v / v) formic acid and 1 g / L ammonium formate in water and aceto nitrile methanol (1 1, v / v) mixture. The eluate was then analyzed by HPLC MS / MS in both positive and negative electrospray ionization conditions with multiple reaction monitoring (MRM) mode. The method detection limits (MDLs) were in the range of ng / L and the recoveries of 23 antibiotics in water ranged from 47 3% to 132 6%. The developed method was applied to the analysis of 5 water samples from mariculture ponds located in Dongying City, Shandong Province. The results showed that the antibiotics could be detected in all water sam ples. The trimethoprim showed the highest detection rate, and the florfenicol had the highest mass concentration which reached ng / L. The results showed that the developed method is efficient, sensitive and reliable, which is suitable for the detection of antibiotics in seawater samples. 通讯联系人.Tel:(0411) ,E mail:jwchen@ dlut.edu.cn. 基金项目 : 国家重点基础研究计划 ( 973 ) 课题 (2013CB430403). 收稿日期 :

2 第 4 期杜鹃, 等 : 固相萃取高效液相色谱串联质谱法同时测定养殖海水中 23 种抗生素 349 Key words: solid phase extraction ( SPE); high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( HPLC MS / MS); antibiotics; mariculture water 近年来, 医药和个人护理化学品 ( PPCPs) 作为一类新型污染物因其对环境存在的潜在危害引起了广泛的关注 [1-3] 抗生素作为一类常见的 PPCPs, 除了用于疾病的治疗和预防外, 也被大量地用于畜牧业和水产养殖抗生素可通过污水处理厂出水医药废水养殖废水等多种途径进入环境 [4,5] 环境中存在的抗生素可诱导细菌出现抗药性, 影响生态平衡 [6,7], 人体接触环境中残留的抗生素可引起过敏反应和增加癌症发病风险 [8] 由于环境基质复杂多样, 环境中抗生素的分析受到了挑战, 而目前没有可用于环境样品中多种抗生素分析的标准方法已有的抗生素分析方法包括薄层色谱法毛管电泳法酶联免疫法和结合固相萃取 (SPE) 的色谱分析 [9-18], 如高效液相色谱紫外 / 荧光检测 ( HPLC DAD / FLD) [12,13] 高效液相色谱质谱 ( HPLC MS) [14,15] 高效液相色谱串联质谱 (HPLC MS / MS) [16,17] 及超高效液相色谱串联质谱 ( UPLC MS / MS ) [18] 等由于基于多反应监测 (MRM) 模式的 HPLC MS / MS 技术具有特异性强灵敏度高线性动态范围宽等特点, 在抗生素分析中 [19] 应用最为广泛例如高立红等使用电喷雾离子化正离子 (ESI+) 扫描 MRM 模式可在 33 min 内对 [20] 3 类 22 种抗生素进行分析 ;Zhang 等使用三重四极杆质谱可在 MRM 模式下 30 min 内完成 4 类 13 [21] 种抗生素的同时分析 ; 杨常青等采用电喷雾正负离子切换 (ESI+ / ESI-)MRM 模式可在 10 min 内分析 4 类 16 种抗生素然而, 已报道的这些研究工作一般分析抗生素的类别较少, 或者相对耗时较长, 因此, 对多类别多种抗生素快速准确分析方法的开发就显得格外重要本研究采用 SPE HPLC MS / MS 技术, 建立了水中 6 类 23 种抗生素的同时定量分析方法, 包括大环内酯类 ( macrolides) 磺胺类 ( sul fonamides) 青霉素类 ( penicillins ) 氯霉素类 (chloramphenicols) 氟喹诺酮类 ( fluoroquinolo nes) 和利福平 (rifampicin) 等, 可在 30 min 内完成全部目标抗生素分析, 并成功应用于 5 个海水养殖池水中目标抗生素的测定 1 实验部分 1.1 仪器和试剂固相萃取仪 ( Auto Trace 280, 美国 Thermo 公司 ) 氮吹仪 (HGC 12, 天津市恒奥科技发展有限公司 ) 高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪 (LC B, 美国 Agilent 公司 ) 标准品 : 罗红霉素 (roxithromycin) 磺胺氯哒嗪 (sulfachloropyridazine) 磺胺间二甲氧嘧啶 ( sul fadimethoxypyrimidine) 磺胺甲基异恶唑 ( sulfa methoxazole) 磺胺吡啶(sulfapyridine) 磺胺噻唑 (sulfathiazole) 磺胺甲基嘧啶( sulfamerazine) 磺胺二甲嘧啶 ( sulfamethazine) 磺胺嘧啶( sulfadia zine) 甲氧苄氨嘧啶 ( trimethoprim) 阿莫西林 (amoxicillin) 青霉素 G ( penicillin G ) 氯霉素 (chloramphenicol) 氟甲砜霉素(florfenicol) 甲砜霉素 ( thiamphenicol) 左氧氟沙星( ofloxacin) 诺氟沙星 (norfloxacin) 恩诺沙星( enrofloxacin) 依诺沙星 ( enoxacin) 利福平万古霉素 ( vancomy cin) 和氘代磺胺甲恶唑 ( sulfamethoxazole d4, 100 ng / μl, 溶剂为乙腈 ) 均购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司 ; 阿奇霉素 ( azithromycin) 购自英国 Fluoro chem 公司 ; 克拉霉素 ( clarithromycin) 购自上海 TCI 公司纯度均高于 98%, 满足定量分析需要甲醇 ( 色谱纯 ) 和乙腈 ( 色谱纯 ) 购自美国 Sig ma 公司, 甲酸 ( 分析纯 ) 购于天津市科密欧化学试剂有限公司, 甲酸铵 ( 分析纯 ) 购自国药集团化学试剂有限公司, 超纯水 ( 18 2 MΩ cm, 25 ) 由 Heal Force 超纯水系统 ( 上海力康公司 ) 提供标准溶液的配制 : 准确称取标准品 g, 用甲醇制成质量浓度为 1 g / L 的标准储备液, 保存于 -20 冰箱中使用时用初始流动相稀释 1.2 样品采集在 2014 年 6 月, 采集了东营海水养殖区 5 个海水养殖池水样养殖池水深 2 m 以内, 所采集样品均为表层水每个养殖池中一次性采集水样 4 L, 置于棕色玻璃瓶中, 在低温条件下保存并运回实验室,1 周之内完成所有水样前处理过程 1.3 仪器条件色谱柱 : Xterra C18 ( 100 mm 2 1 mm, 3 5 μm, 美国 Waters 公司 ); 进样量 :5 μl; 柱温 :40 ; 流动相 :0 1% (v / v) 甲酸 1 g / L 甲酸铵水溶液 (A), 甲醇乙腈 (1 1, v / v) ( B) 梯度洗脱程序 : 起始 5% B, 保持 3 min; 在 30 min 内线性变为 88% B 流速 0 3 ml / min 质谱条件 :ESI+ / ESI- 切换 ;MRM 数据采集模式每种抗生素的详细质谱检测参数见表 1

3 350 色谱第 33 卷表 1 所分析的抗生素的质谱检测参数 Table 1 MS detection parameters of the analyzed antibiotics Compound Precursor ion (m / z) Product ion (m / z) Fragmentor / V Azithromycin Clarithromycin Roxithromycin Sulfachloropyridazine Sulfadimethoxypyrimidine Sulfamethoxazole Sulfapyridine Sulfathiazole Sulfamerazine Sulfamethazine Sulfadiazine Trimethoprim Amoxicillin Penicillin G Chloramphenicol Florfenicol Thiamphenicol Ofloxacin Norfloxacin Enrofloxacin Enoxacin Rifampicin Vancomycin Sulfamethoxazole d CE: collision energy. 1.4 样品前处理方法 CE / ev 水样经 0 45 μm 玻璃纤维滤膜过滤, 准确量取 1 L, 加入回收率替代物氘代磺胺甲恶唑 50 ng, 用盐酸水溶液 (1 1, v / v) 调节 ph 至 2 5, 在 Oasis HLB SPE 小柱 ( 500 mg / 6 ml) 上进行富集上样前, SPE 柱依次用 20 ml 甲醇 6 ml 超纯水和 6 ml 盐酸溶液 ( ph 2 5) 活化平衡 ; 上样时流速设为 10 ml / min; 上样后先用 10 ml 超纯水淋洗萃取小柱, 用氮气吹扫 5 min, 最后用甲醇洗脱洗脱液在 40 水浴中用氮气吹至近干, 用初始流动相 (5% B) 溶解残渣, 定容至 1 ml, 过 0 22 μm 水相滤膜, 待测 2 结果与讨论 2.1 色谱质谱条件的优化 6 类抗生素的质谱行为不同, 氯霉素类在 ESI- 模式下有较强响应, 在 ESI+ 下信号非常弱, 而其他几类抗生素正好相反因此本方法中选择正负离子模式同时监测, 一次性对所有目标抗生素进行分析, 减少了分析所用时间分别考察了 Waters Xterra 色谱柱和 Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 液相色谱柱 ( 150 mm 3 0 mm, 3 5 μm) 对抗生素的分离效果, 结果显示 Xterra 色谱柱效果更佳对比甲醇乙腈和不同比例甲醇乙腈作流动相时抗生素的分离情况, 结果表明甲醇可以改善峰形, 而乙腈可以提高分离度, 在甲醇乙腈体积比为 1 1 的条件下各物质峰形响应值和分离度达到最佳状态由于液相色谱质谱分析中样品溶剂组成也会影响分析物的保留时间和峰形, 从而影响对目标化合物检测的灵敏度因此本研究考察了甲醇和初始流动相作为样品溶剂对色谱分离的影响甲醇作样品溶剂时, 经过梯度洗脱, 抗生素能够完全分离, 但响应值偏低且色谱峰出现前伸现象 ( 见图 1a), 严重影响定量分析结果 ; 而采用初始流动相 (5% B) 时, 各物质的响应和峰形都得到很大改善 ( 见图 1b) 2.2 固相萃取条件的优化亲水亲脂平衡 (HLB) 型固相萃取柱, 对极性和非极性物质都有很好的回收率和重复性, 因此常被用于类似研究中本实验选择了 Oasis HLB SPE 柱 (500 mg / 6 ml) 作为萃取柱, 优化了上样 ph 溶液 ph 可以影响抗生素在水中的存在形态稳定性和与萃取柱填料之间的相互作用, 从而影响萃取效果对比酸性中性 ( 未调节 ph) 和碱性条件下 HLB 柱对目标抗生素的富集效果, 发现大部分抗生素在酸性条件下的回收率最高 ( 见图 2), 因此确定上样 ph 为洗脱液的考察取 1 L 超纯水, 调节其 ph 至 2 5, 在其中添加抗生素混合标准工作液 100 μl, 经 HLB 柱富集, 淋洗吹干后用不同量的甲醇进行洗脱结果显示, 以 6 ml 甲醇洗脱两次, 效果较好 ; 继续增加洗脱液量, 洗脱效果增加不明显, 且会增加后续处理的工作量因此, 以 12 ml 甲醇分两次对萃取柱进行洗脱, 既保证了各抗生素都能有较高的回收率, 又减小了洗脱液体积, 有效地缩短了整个分析时间 2.4 回收率重现性和精密度在提取样品前添加回收率指示物, 以控制整个样品前处理过程的回收率同时进行方法空白和平行样的测定, 以进行质量控制与质量保证根据仪器对 23 种目标抗生素的响应以及水样中抗生素可能的浓度, 以初始流动相为溶剂配制抗生素混合标准工作液, 并稀释成 5 个系列梯度浓度经分析获得工作曲线, 所有目标物的线性相关系数 (r 2 [22] ) 均大于 0 995( 见表 2) 采用王艳洁等介绍的国际纯粹与应用化学联合会 ( IUPAC) 推荐方法测定并计算方法检出限 ( MDL), 除阿莫西林为 8 5

4 第 4 期杜鹃, 等 : 固相萃取高效液相色谱串联质谱法同时测定养殖海水中 23 种抗生素 351 图 1 抗生素标准样品的色谱图 Fig. 1 HPLC MS / MS chromatograms of the antibiotics standards Solvents: a. methanol; b. initial mobile phase. Peak identifications: 1. sulfadiazine; 2. sulfathiazole; 3. sulfapyridine; 4. sulfamerazine; 5. vancomycin; 6. thiamphenicol; 7. trime thoprim; 8. sulfamethazine; 9. enoxacin; 10. ofloxacin; 11. norfloxacin; 12. sulfachloropyridazine; 13. sulfamethoxazole d4; 14. sulfa methoxazole; 15. enrofloxacin; 16. florfenicol; 17. chloramphenicol; 18. sulfadimethoxypyrimidine; 19. azithromycin; 20. penicillin G; 21. amoxicillin; 22. clarithromycin; 23. roxithromycin; 24. rifampicin. Fig. 2 图 2 上样 ph 对回收率的影响 Effect of sample ph on the recoveries of target compounds 表 2 目标化合物的保留时间线性方程相关系数 (r 2 ) 和方法检出限 Table 2 Retention times, calibration equations, correlation coefficients (r 2 ) and method detection limits (MDLs) Compound Retention time / min Calibration equation r 2 MDL / (ng / L) Azithromycin 14.7 y = 272x Clarithromycin 21.0 y = 1838x Roxithromycin 21.4 y = 548x Sulfachloropyridazine 10.0 y = 131x Sulfadimethoxypyrimidine 13.8 y = 634x Sulfamethoxazole 10.6 y = 1878x Sulfapyridine 6.6 y = 274x Sulfathiazole 6.3 y = 154x Sulfamerazine 7.0 y = 213x Sulfamethazine 8.7 y = 143x

5 352 色谱第 33 卷表 2 ( 续 ) Table 2 ( Continued) Compound Retention time / min Calibration equation r 2 MDL / (ng / L) Sulfadiazine 4.9 y = 77x Trimethoprim 8.5 y = 763x Amoxicillin 16.5 y = 16x Penicillin G 15.7 y = 245x Chloramphenicol 12.8 y = 13x Florfenicol 10.9 y = 12x Thiamphenicol 7.9 y = 3x Ofloxacin 9.6 y = 1511x Norfloxacin 9.7 y = 976x Enrofloxacin 10.7 y = 207x Enoxacin 9.3 y = 1555x Rifampicin 22.5 y = 76x Vancomycin 7.2 y = 3x y: peak area of the target compound; x: mass concentration, ng / L. ng / L, 其他目标抗生素为 0 1 ~ 2 9 ng / L 在低中和高 3 个添加水平下考察方法回收率 ( n = 3) 分别为 47 3% ~ 122 2% 53 9% ~ 132 6% 58 6% ~ 125 7%, 相对标准偏差 ( RSD) 分别为 1 6% ~ 18 8% 0 6% ~ 14 5% 1 2% ~13 8% ( 见表 3), 表明该方法具有较好的重现性和稳定性表 3 目标化合物的加标回收率及相对标准偏差 (n = 3) Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the target compounds (n = 3) Compound Spiked / (ng / L) Recovery / % RSD / % Compound Spiked / (ng / L) Recovery / % RSD / % Azithromycin Amoxicillin Clarithromycin Penicillin G Roxithromycin Chloramphenicol Sulfachloropyridazine Florfenicol Sulfadimethoxypyrimidine Thiamphenicol Sulfamethoxazole Ofloxacin Sulfapyridine Norfloxacin Sulfathiazole Enrofloxacin Sulfamerazine Enoxacin Sulfamethazine Rifampicin Sulfadiazine Vancomycin Trimethoprim

6 第 4 期杜鹃, 等 : 固相萃取高效液相色谱串联质谱法同时测定养殖海水中 23 种抗生素实际样品的分析使用所建立的方法对东营地区 5 个养殖海水样品中的抗生素进行分析, 水样中共检出 6 种抗生素, 总质量浓度在 7 4 ~ ng / L 之间, 该结果与 [18] Zhang 等在莱州湾采集的水样中检测到的抗生素含量相当, 且海参养殖池水中抗生素总浓度明显高于对虾池如表 4 所示, 大环内酯类中罗红霉素共检出 2 次, 平均质量浓度为 0 8 ng / L; 磺胺类中磺胺甲恶唑在 3 个水样中被检出, 平均质量浓度为 0 3 ng / L, 而磺胺增效剂甲氧苄氨嘧啶检出频率为 100%, 检出质量浓度可达 98 2 ng / L; 氯霉素类中甲砜霉素和氟甲砜霉素被检出, 其中氟甲砜霉素检出质量浓度最高, 达到 ng / L; 氟喹诺酮类中恩诺沙星被检出 1 次, 检出质量浓度为 18 7 ng / L; 利福平检出 1 次, 检出质量浓度为 0 3 ng / L 同时对所检出 6 种抗生素在高添加水平 ( 参见表 3) 下的模拟海水 ( 盐度 35 0 ) 进行了加标试验, 回收率的结果分别为罗红霉素 74 5% 磺胺甲恶唑 53 9% 甲氧苄胺嘧啶 77 9% 氟苯尼考 71 6% 恩诺沙星 65 9% 以及利福平 64 1% 所检出的抗生素基本涵盖了所有目标种类, 显示出本方法对实际水体抗生素分析的实用性和有效性表 4 养殖池水样中抗生素的分析结果 Table 4 Analytical results of antibiotics in mariculture water Category Compound Mass concentration / (ng / L) Shrimp pond 1 Shrimp pond 2 Shrimp pond 3 Sea cucumber pond 1 Sea cucumber pond 2 Macrolides roxithromycin Sulfonamides sulfamethoxazole trimethoprim Chloramphenicols florfenicol Fluoroquinolones enrofloxacin Others rifampicin Total : not detected. 3 结论本研究采用 SPE HPLC MS / MS 技术建立了水中 6 类 23 种抗生素同时测定的分析方法, 结果表明该方法具有较好的灵敏度和稳定性用该方法对东营某海水养殖区 5 个养殖池水样进行了初步检测, 除青霉素类外各类抗生素均有检出, 证明该方法可用于实际水样的分析参考文献 : [1] Daughton C G, Ternes T A. Environ Health Persp, 1999, 107(S6): 907 [2] Dussault E B, Balakrishnan V K, Sverko E, et al. Environ Toxicol Chem, 2008, 27(2): 425 [3] Simmons D B D, Trudeau V L, Marlatt V L, et al. Environ Toxicol Chem, 2008, 27(2): 442 [4] Gómez M J, Petrovic ' M, Fernández Alba A R, et al. J Chro matogr A, 2006, 114: 224 [5] Wollenberger L, Halling Sørensen B, Kusk K O. Chemo sphere, 2000, 40(7): 723 [6] Göbel A, McArdell C S, Suter M J F, et al. Anal Chem, 2004, 76(16): 4756 [7] Hu W J, Yang S Y, Zhu X M. Journal of Xiamen University: Natural Science ( 胡文佳, 杨圣云, 朱小明. 厦门大学学报 : 自然科学版 ), 2007, 46(S1): 197 [8] Tamim H M, Hajeer A H, Boivin J F, et al. Int J Cancer, 2010, 127(4): 952 [9] Zhang Q H, Zhang Z J, Tian H. Journal of Instrumental Analysis ( 张启华, 张志军, 田华. 分析测试学报 ), 1998, 17 (4): 54 [10] Li A M, Huang Z, Lu W P, et al. Chinese Journal of Chro matography ( 李爱梅, 黄茁, 卢文平, 等. 色谱 ), 2014, 32 (8): 897 [11] Pastor Navarro N, Morais S, Maquieira Á, et al. Anal Chim Acta, 2007, 594(2): 211 [12] Fernandez Torres R, Consentino M O, Lopez M A B, et al. Talanta, 2010, 81(3): 871 [13] Li L, Liu F, Chen H H, et al. Chinese Journal of Chroma tography ( 李璐, 刘菲, 陈鸿汉, 等. 色谱 ), 2013, 31(6): 567 [14] Renew J E, Huang C H. J Chromatogr A, 2004, 1042( 1 / 2): 113 [15] Sun P Z, Barmaz D, Cabrera M L, et al. J Chromatogr A, 2013, 1312: 10 [16] Yan C X, Yang Y, Zhou J L, et al. Environ Pollut, 2013, 175: 22 [17] Bao X L, Ren Y P, Zhang H. Chinese Journal of Analytical Chemistry ( 包晓丽, 任一平, 张虹. 分析化学 ), 2009, 37 (3): 389 [18] Zhu S C, Wang J, Shao W W, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 朱赛嫦, 王静, 邵卫伟, 等. 色谱 ), 2013, 31(1): 15 [19] Gao L H, Shi Y L, Li W H, et al. Chinese Journal of Chro matography ( 高立红, 史亚利, 厉文辉, 等. 色谱 ), 2010, 28(5): 491 [20] Zhang R J, Zhang G, Zheng Q, et al. Ecotox Environ Safe, 2012, 80: 208 [21] Yang C Q, Wang L X, Hou X H, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 杨常青, 王龙星, 侯晓虹, 等. 色谱 ), 2014, 30(8): 756 [22] Wang Y J, Na G S, Wang Z, et al. Chemical Analysis and Meterage ( 王艳洁, 那广水, 王震, 等. 化学分析计量 ), 2012, 21(5): 85

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