本应用简报展示了一种分析筛查方法, 能够将 Ultivo 三重四极杆液质系统与 Agilent 129 Infinity II UHPLC 联用, 分析猪肉和鸡蛋中 27 个类别的 151 种兽药 我们还证明了 Agilent EMR-Lipid 样品前处理试剂盒具有广泛的应用范围 EMR- Lip

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1 应用简报 使用 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统对猪肉和鸡蛋中的兽药进行多类别残留分析 作者 Tony Zhang Dan-Hui Dorothy Yang 安捷伦科技公司 前言 主要成分为抗菌剂和激素的兽药已广泛用于疾病防治 促进生长和提高饲料转化率 动物源性产品中, 能够引发过敏反应和抗生素耐药性的兽药残留已成为全球消费者在购买产品时关注的问题 为保护公共健康,US FDA 于 215 年 6 月通过兽药饲料指令颁布了管控抗微生物药物使用的最终规定 1 欧盟法规请参见立法提案 214/257(COD) 2, 该法规将废止并替代指令 21/82/EC 新法规旨在达成影响评估所确定的目标, 并解决抗生素耐药性带来的公共健康风险问题 在中国, 为设定动物源食品中兽药含量的最大限值 3, 农业部发布了第 235 号公告 3 根据分析物和基质的不同, 实现准确定量要求的范围为 ppt 至 ppb 级 基质的复杂性加上不同类别兽药的特性 ( 如不同 ph 条件下的疏水性和稳定性 ), 导致难以在一次运行中检测多个类别的分析物 常用标准方法可涵盖一个类别或一小组相似类别的兽药 为有效监测兽药并保护公共健康, 迫切需要能够在一次运行中检测多个类别的分析物 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统十分符合这一要求 Ultivo 专门设计用于解决以环境和食品安全领域为代表的常规生产实验室所面临的许多挑战 该系统融入了多项革命性创新, 体积远小于上一代三重四极杆系统, 但性能丝毫不打折扣 双六极杆设计使系统拥有卓越的离子传输效率 硬件和电子元件方面的提升使极性切换速度更快 此外,Ultivo 减少了用户对系统维护的干预, 使非专业质谱用户也能够通过 VacShield 真空盾和可拆卸检测器从容应对系统运行和维护

2 本应用简报展示了一种分析筛查方法, 能够将 Ultivo 三重四极杆液质系统与 Agilent 129 Infinity II UHPLC 联用, 分析猪肉和鸡蛋中 27 个类别的 151 种兽药 我们还证明了 Agilent EMR-Lipid 样品前处理试剂盒具有广泛的应用范围 EMR- Lipid 能够有效去除动物源基质中的高脂成分, 并提供优异的兽药回收率 实验部分 标准品和试剂兽药标准品购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH WITEGA laboratorien Berlin-Adlershof GmbH Toronto Research Chemicals (TRC) 或 AccuStandard, Inc 表 1 列出了该溶液中含有的 151 种化合物 在流动相配制中使用超纯水 (> 18.2 MΩ,Milli-Q 水系统 ) 乙腈(LC-MS 级,Fluka) 和甲酸 (98% 左右, 质谱用,Fluka) 在样品前处理中使用乙腈(HPLC 级,Sigma- Aldrich) 二甲基亚砜(DMSO,> 99.9%,Aldrich) 乙酸铵 ( 98%,Sigma-Aldrich) 和甲酸 (98% 左右,HPLC 级, Fluka) 表 1. 分析的 151 种兽药 分类 名称 CAS 西马特罗 克仑特罗 氯丙那林 喷布洛尔 β- 激动剂 普奈洛尔 莱克多巴胺 沙丁胺醇 特布他林 妥洛特罗 醋酸甲孕酮 雄激素 甲睾酮 诺龙 /19- 去甲睾酮 睾酮 氨基氟苯达唑 羟基甲苯咪唑 阿苯达唑 阿苯达唑砜 阿苯达唑亚砜 阿苯达唑 -2- 氨基砜 坎苯达唑 苯硫氨酯 苯并咪唑类 芬苯达唑 氟苯咪唑 甲苯咪唑 甲苯达唑胺 奥吩达唑 奥芬那唑砜 / 芬苯达唑砜 奥苯达唑 噻菌灵 羟基噻菌灵 三氯苯达唑 氯霉素 氯霉素类 氟甲砜霉素 甲砜霉素 分类 名称 CAS 倍氯米松 倍他米松 地塞米松 氟米松 氢化可的松 糖皮质激素类 甲基泼尼松 泼尼松龙 泼尼松 去炎松 曲安奈德 乙酰异戊酰泰乐菌素 / 泰乐菌素 红霉素 吉他霉素 / 柱晶白霉素 大环内酯类 竹桃霉素 替米考星 泰乐菌素 二甲硝咪唑 羟基迪美唑 (HMMNI) 硝基咪唑类 甲硝唑 羟基甲硝唑 罗硝唑 肽段 维吉尼霉素 M 环丙沙星 达氟沙星 二氟沙星 依诺沙星 恩诺沙星 氟罗沙星 氟甲喹 洛美沙星 喹诺酮类 萘啶酸 诺氟沙星 氧氟沙星 奥比沙星 奥索利酸 培氟沙星 沙氟沙星 司帕沙星

3 分类 名称 CAS 磺胺苯甲酰胺 磺胺醋酰 磺胺氯哒嗪 磺胺氯吡嗪 磺胺嘧啶 磺胺地托辛 磺胺多辛 磺胺胍 磺胺甲嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺二甲嘧啶 磺胺类 磺胺甲二唑 磺胺甲恶唑 磺胺甲氧哒嗪 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺二甲唑 磺胺苯吡唑 磺胺吡啶 磺胺喹恶啉 磺胺噻唑 磺胺索嘧啶 磺胺异恶唑 甲氧苄啶 金霉素 四环素类 多西环素 四环素 结晶紫 / 碱性紫 三苯甲烷类 隐性孔雀石绿 孔雀石绿 二萜 沃尼妙林 吩噻嗪类 氯丙嗪 塞拉嗪 喹喔啉类 喹乙醇 抗吸虫药 硝碘酚腈 氯羟吡啶 地克珠利 乙氧酰胺苯甲酯 卤夫酮 抗球虫药 尼卡巴嗪 氯苯胍 妥曲珠利 妥曲珠利砜 妥曲珠利亚砜 球痢灵 分类 名称 CAS 抗病毒药物 金刚烷胺 克百威 杀虫脒 蝇毒磷 敌敌畏 农药 倍硫磷亚砜 马拉硫磷 五氯酚 (PCP) 胺丙畏 敌百虫 林可胺类 林可霉素 氨苯砜类 氨苯砜 8-8- N- 乙酰氨苯砜 有机酸类 十七氟辛烷磺酸 (PFOS) 全氟辛酸 (PFOA) ,6- 二硝基邻甲酚 (DNOC) 硝基类 硝呋烯腙 复硝酚钠 /4- 硝基苯酚 1-2-7/ 镇静剂 阿扎哌醇 阿扎哌隆 乙酰氨基安替比林 甲酰氨基安替比林 氟灭酸 氟尼辛 吲哚洛芬 非甾体抗炎药 (NSAID) 酮洛芬 甲芬那酸 美洛昔康 吡罗昔康 舒林酸 替诺昔康 托美汀 驱虫剂 左旋咪唑 喹乙醇 3- 甲基喹喔啉 -2- 羧酸 喹啉 -2- 羧酸

4 样品前处理 1. 称取 5 ±.5 g 均质样品置于 5 ml 离心管中 ( 加入标准品作为校准标样和质量控制样品 ) 2. 加入 1. ml 水和两粒陶瓷均质子 ( 部件号 ), 然后在机械振荡器中混合样品 ( 分析鸡蛋时请跳过该步骤 ) 3. 加入 1 ml 5% 甲酸的乙腈溶液, 手动剧烈振摇使样品分散, 然后用机械振荡器混合 5 分钟 (2 rpm) 4. 以 4 rpm 的转速离心 5 分钟 5. EMR 活化 : 将 5. ml 5 mm 乙酸铵缓冲液 ( 分析鸡蛋时加入 3. ml) 加入 15 ml EMR-Lipid dspe 增强型脂质去除净化管 ( 部件号 ) 中, 然后立即涡旋混合至少 3 6 秒 (2 rpm) 确保所有 EMR 吸附剂均已完全水合 ( 形成乳浊液 ) 6. 转移 5. ml( 分析鸡蛋时转移 7. ml) 上清液至完成活化的 EMR-Lipid dspe 增强型脂质去除净化管中 7. 立即涡旋混合 2 分钟 (2 rpm) 8. 以 4 rpm 的转速离心 5 分钟 9. 向新 5 ml 离心管中加入两粒陶瓷均质子 ( 部件号 ), 将所有提取物倒入该离心管并加入 Polish 除脂萃取盐包 ( 部件号 ) 内容物, 然后剧烈振摇 1. 立即涡旋混合 2 分钟 (2 rpm) 11. 以 4 rpm 的转速离心 5 分钟 12. 将 2. ml 上层液体转移至玻璃试管中, 加入 5. µl DMSO, 然后氮吹浓缩定容 (4 C, 约 5 µl) 13. 用.95 ml 15% 乙腈水溶液复溶, 然后涡旋混合 1 分钟 (2 rpm) 14. 将溶液转移至 2. ml 离心管, 在 1 rpm 下离心 5 分钟, 然后将上清液转移至进样样品瓶, 供 LC/MS 分析使用 仪器参数 表 2. 液相色谱参数 色谱柱 进样量 15 µl 柱温 4 C 流速 流动相 梯度 运行时间 后运行时间 进样针清洗 电离模式 扫描类型 液相色谱参数 Agilent ZORBAX Eclipse plus C18,3. 15 mm, 1.8 µm ( 部件号 ).5 ml/min A).2% 甲酸水溶液 B).2% 甲酸乙腈溶液 时间 (min) %A %B 分钟 4 分钟 清洗模式 : 清洗口针清洗溶剂 :95% 乙腈 / 水针清洗时间 : 至少 15 秒 正离子 / 负离子 动态 MRM 干燥气温度 2 C 干燥气流速 雾化器 11 L/min 35 psi 鞘气温度 275 C 鞘气流速 11 L/min 质谱参数 毛细管电压 3( 正离子 );35( 负离子 ) 喷嘴电压 2( 正离子 );15( 负离子 ) 结果与讨论 检测灵敏度 对一组九种浓度基质加标校准标样 (.1 ng/g.2 ng/g.5 ng/g 1. ng/g 2. ng/g 5. ng/g 1 ng/g 2 ng/g 和 4 ng/g) 进行连续分析 采用线性拟合生成每种分析物的校准曲线, 其中猪肉样品中校准曲线 R 2 值.99 的化合物占 87%, 而鸡蛋样品中 R 2 值.99 的占 89% 4

5 图 1 所示为实验获得的阿苯达唑 倍氯米松 氯霉素 四环 素 竹桃霉素 依诺沙星 磺胺氯哒嗪和克仑特罗八个不同化学类别的八种化合物的校准曲线 1 5 阿苯达唑 1.1 y = * x R 2 = 氯霉素 1.4 y = * x R 2 = 竹桃霉素 5.5 y = * x R = 磺胺氯哒嗪 y = * x R 2 = 倍氯米松 y = * x R 2 = 四环素 1. y = * x R 2 = 依诺沙星 y = * x R 2 = 克仑特罗 1.8 y = * x R = 图 1. 鸡蛋中的阿苯达唑 (A) 倍氯米松 (B) 氯霉素 (C) 四环素 (D) 竹桃霉素 (E) 依诺沙星 (F) 磺胺氯哒嗪 (G) 和克仑特罗 (H) 在 Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用系统上获得的校准曲线 5

6 Ultivo 表现出极高的分析灵敏度 多数化合物都可以在基质加标浓度为 2 ng/g 的条件下检出 例如, 鸡蛋样品中有 93% 的化合物能够以信噪比 (S/N) 大于 1 的水平检出, 对定性离子和定量离子均是如此 图 2 是加标浓度为 2 ng/g 的鸡蛋样品的样品色谱图 图 3 所示为不同基质浓度条件下定性离子和定量离子 S/N > 1 的化合物所占的比例 采集时间 (min) 图 2. 以 2 ng/g 的浓度添加 151 种兽药的鸡蛋样品的示例色谱图 1 5 猪肉 鸡蛋 2 浓度 (ppb) % 图 3. 不同基质浓度条件下定性离子和定量离子 S/N > 1 的化合物所占的比例 6

7 方法精度通过七次重复测定对方法在加标浓度 5 ng/g 条件下的重现性进行研究 图 4 所示为猪肉和鸡蛋样品加标浓度为 5 µg/kg 时分布比例的 %RSD (n = 7) 结果表明 %RSD 小于 2% 的化合物占 92%, 重现性良好 结论 本研究开发了一种能够分析猪肉和鸡蛋中 27 个类别的 151 种兽药的便捷分析方法 分析灵敏度 准确度和精度结果证明,Agilent Ultivo 三重四极杆液质联用是兽药分析的可行解决方案 5 µg/kg 加标浓度下鸡蛋样品的 %RSD 9% 7% 8% > 2 76% 5 µg/kg 加标浓度下猪肉样品的 %RSD 7% 14% 8% > 2 71% 图 4. 猪肉和鸡蛋样品加标浓度为 5 µg/kg 时的 %RSD 分布 (n = 7) 7

8 参考文献 1. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 21 CFR Parts 514 and 558, FDA-21-N Proposal for a regulation of the European parliament and of the council on veterinary medicinal products, European Commission, 214/257 (COD) 3. Maximum residue limits in animal derived foods, Announcement No. 235, Ministry of Agriculture, China, 22 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : [email protected] 在线询价 : 仅限研究使用 不可用于诊断目的 本文中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 12 月 19 日, 中国出版 ZHCN