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1 生物多样性 2008, 16 (2): Biodiversity Science doi: /SP.J http: // 中国野生大豆的遗传多样性和生态特异性分析 * 丁艳来赵团结盖钧镒 ( 南京农业大学大豆研究所 / 国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京 ) 摘要 : 野生大豆 (Glycine soja) 是栽培大豆的祖先, 为东亚特有种, 大部分分布在中国 我们采用 52 对 SSR 引物和 10 个植物学性状, 以遗传丰富度和 Simpson 多样性指数为指标, 对来自中国 3 个地理生态区域涉及 24 个省区的 196 份野生大豆所构成的代表性样本的遗传变异进行了研究, 以期从分子水平和表型水平两个层面上揭示中国野生大豆遗传多样性和地理生态特异性 结果表明 : 中国野生大豆群体 SSR 位点的等位基因平均丰富度 (NA) 和平均 Simpson 多样性指数 (H) 分别为 16.1 和 0.852, 高于栽培大豆 (NA = 11.4, H = 0.773), 野生群体的遗传多样性明显高于栽培群体 3 个地理生态群体中群体多样性最高 (NA = 12.9, H = 0.842), 群体最低 (NA = 11.4, H = 0.805), 群体居中 (NA = 12.5, H = 0.834) 群体间存在遗传分化, 不同群体具有不同的特异等位基因, 位点 AW (A2 连锁群 ) Satt522 (F) satt150 (M) Sat_332 (D1a) Satt046 (K) sct_190 (K) 等的一些等位基因只在特定群体出现, 表现出群体分化后的生态特异性 中国野生大豆植物学性状的群体变异丰富, 平均 Simpson 多样性指数为 地理群体间存在分化, 最明显的是生育期性状的分化, 反映了地理 光照和温度等生态因子的选择作用, 其中地理群体多样性最高 (H = 0.671) SSR 分子标记和植物学性状所获结果相对一致, 表明中国野生大豆地理群体间性状分化有其遗传分化的基础 关键词 : Glycine soja, SSR 标记, 植物学性状, 遗传多样性, 遗传分化 Genetic diversity and ecological differentiation of Chinese annual wild soybean (Glycine soja) Yanlai Ding, Tuanjie Zhao, Junyi Gai* Soybean Research Institute of Nanjing Agricultural University, Center of Soybean Improvement, and Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Abstract: The annual wild soybean (Glycine soja), known as the ancestor of the cultivated soybean (G. max), is endemic to East Asia with most of its range in China. It is believed that the wild soybean holds a reservoir of genetic variation potentially useful for improvement of cultivated soybeans. Our study combined molecular techniques with evaluation of botanical traits to investigate genetic diversity and genetic specificity caused by geographic differentiation in wild soybean populations in China. A total of 196 wild accessions from three distinct geographic regions (Northeast China, Huang-Huai-Hai Valleys and South China, abbreviated as, and, respectively) were genotyped using 52 SSR markers and phenotyped using 10 botanical traits. The average allelic richness (NA) of the entire wild population and Simpson diversity index (H) were 16.1 and 0.852, respectively; higher than those of cultivated populations (NA = 11.4, H = 0.773). Among the three geographic populations, the population had the highest genetic diversity (NA = 12.9, H = 0.842), the population the next highest (NA = 12.4 and H = 0.834), and the population the lowest (NA = 11.4, H = 0.805). Population-specific alleles existed on a number of loci (including AW (Linkage group A2), Satt522 (F), satt150 (M), Sat_332 (D1a), Satt046 (K), sct_190 (K), thus indicating the existence of genetic differentiation among, and ecological specificity of geographic populations. Analysis of botanical traits revealed high variation, diversity (H = 0.710) and geographic differentiation, especially in 收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 ( , ) 国家重点基础研究发展规划项目 (2006CB101708) 国家 863 项目 (2006AA100104) 国家科技支撑计划项目 (2006BAD13B05-7) 长江学者和创新团队发展计划资助项目 (PCSIRT) 和教育部高等学校创新引智计划 (B08025) * 通讯作者 Author for correspondence. sri@njau.edu.cn

2 134 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷 growth period traits. These differences in botanical traits indicate the significance of natural selection due to geographic variation in day-length and temperature. Analysis of molecular data and botanical traits indicated that the geographic differentiation observed in botanical traits was based on genetic differentiation, and that genetic diversity of the population was higher than the other two populations. Key words: Glycine soja, SSR marker, botanical traits, genetic diversity, genetic differentiation 一年生野生大豆 (Glycine soja, 以下简称野生大豆 ) 是栽培大豆 (G. max) 的祖先物种, 局限分布在中国 朝鲜半岛 日本 俄罗斯远东等地区 中国拥有最多的一年生野生大豆资源, 国家种质库已收集和保存了约 7,000 份野生大豆资源, 占世界保存的 90% 以上, 还有大量正待搜集 多位研究者利用 中国野生大豆资源目录 ( 李福山, 1990) 所记载的中国各地野生大豆资源生物学性状数据, 分析了其主茎明显程度 叶形 茸毛色等茎叶性状, 以及种子性状 脂肪与蛋白质含量等的多态性和地理分布特点 ( 李福山, 1993; 徐豹等, 1995; 庄炳昌等, 1996; 董英山等, 2000; Dong et al., 2001) 分析所用数据为不同地区 不同环境下的观测结果, 反映了野生大豆受基因型和环境两方面影响下的差异 最佳的设计是将生长在不同地理生态条件下的材料在相同环境下研究, 以排除环境的作用 南京地处我国中部纬度, 各种熟期组类型均能在自然条件下成熟, 是单一环境实验较好的地点 本文拟研究中国野生大豆地理群体在南京的遗传变异特点 分子标记不易受环境影响, 多态性高, 已广泛应用于野生大豆的遗传多样性研究 (Xu & Gai, 2003) RAPD AFLP 标记分析结果表明野生大豆存在丰富的核变异, 不同群体间有明显的遗传分化 ( 田清震等, 2001; Chen & Nelson, 2004a; Nichols et al., 2007) 细胞器 DNA 的 RFLP 分析也表明中国野生大豆存在着地理分化, 各地理群体的遗传多样性水平不同, 地理群体最高, 群体次之, 群体最低 (Shimamoto et al., 1998; 许东河等, 1999; 盖钧镒等, 2000) SSR 分子标记能较好地反映出种质资源之间的遗传差异而被广泛应用 (Powell et al., 1996; 吴晓雷等, 2001; 王彪等, 2003; Abe et al., 2003) 赵丽梅等(2005) 用 20 对 SSR 引物在野生大豆中所产生的条带数为指标评价了所构建的野生大豆核心种质的代表性, 赵茹等 (2006) 提出了利用 SSR 等标记进行野生大豆自然群体遗传多样 性估算与取样的策略, 进一步证实 SSR 技术在多样性评价中的有效性 Young 等 (1999) 和 Kuroda 等 (2006) 分别对韩国和日本的野生大豆自然群体进行了 SSR 遗传多样性评价 许多研究者以种质库中保存的野生大豆为材料进行了 SSR 遗传多样性研究 Xu 等 (2002) 分析了来自亚洲的 143 份野生大豆和 183 份栽培大豆的叶绿体基因组 SSR 多样性, 根据两个物种地理群体 cp SSR 的分布特点推测栽培大豆是多起源的 赵洪锟等 (2001) 采用 12 对 SSR 引物对我国不同纬度地区的野生大豆和栽培大豆各 22 份进行了多样性分析, 结果表明野生大豆的多样性比栽培大豆更丰富, 并且野生大豆和栽培大豆可明显分为两类 海林和王克晶 (2002) 利用 12 对 SSR 引物对 67 份半野生大豆种质进行了遗传多样性的检测分析, 发现省内 ( 或地区内 ) 的种质之间遗传差异较大, 表现在聚类上的分散 Wang 和 Takahata(2007) 比较了中国 (45 份 ) 和日本 (60 份 ) 野生大豆 10 个 SSR 标记的多样性特点, 认为二者可能是独立进化的 鉴于以上一些报道中有的研究材料样本较小, 推论总体上不明确 ; 有的标记数目较少, 覆盖的基因组范围狭窄, 因而有待增加样本量和标记数, 对我国野生大豆核 DNA 分子标记多样性特点作进一步探究 本研究从我国保存的种质资源中均匀抽取不同地理区域的野生大豆建立代表性样本, 选用均匀分布在各连锁群 ( 基因组 ) 的 SSR 标记, 对该样本分子标记和相同自然条件下植物学性状表型特点进行研究, 以揭示中国野生大豆群体及不同地理群体的遗传多样性和生态特异性, 以期为野生大豆的保护和利用提供参考 1 材料与方法 1.1 实验材料供试的 196 份野生大豆由国家大豆改良中心种质库提供, 来自 24 个省区 首先按代表性和均

3 第 2 期丁艳来等 : 中国野生大豆的遗传多样性和生态特异性分析 135 衡原则初步确定 各生态区的材料数, 再根据 中国野生大豆资源目录 ( 李福山, 1990) 保存的 25 个省份的野生大豆信息及材料实际可获得状况, 从每个省份抽取一定数量的材料, 省内按不同地区 ( 县市 ) 均匀抽取 按盖钧镒和汪越胜 (2001) 提出的大豆品种生态区域, 选取 地区各 份材料 ( 图 1), 已经过多代自交 将这 196 份材料视为中国野生大豆总体的一个大样本, 对该样本进行分析, 推断中国野生大豆地理生态型的遗传多样性 为与野生大豆作比较, 本文使用了 95 份栽培大豆地方品种 ( 来自 21 个省区, 其中 地区分别有 份材料 )SSR 标记分析的未发表结果 ( 图 1) 1.2 SSR 分子标记分析大豆叶片 DNA 的提取采用 CTAB 法 (Doyle & Doyle, 1990) 将 2 g 左右叶片加液氮研磨至粉末状后装入 1.5 ml 离心管, 加入 650 μl CTAB 溶液于 65 水浴中保温 80 min; 加入等体积的氯仿 / 异戊醇溶液混匀, 静置 15 min, 12,000 r/min 离心 15 min; 取上清液至另一新管中, 加入预冷的无水乙醇沉淀 DNA, 并用枪头挑出白色 DNA 沉淀, 真空抽干 ; 加入 100 μl 的 ddh 2 O 或 TE 液溶解 DNA, 低温保存备用 根据 Cregan 等 (1999) 的大豆公共遗传图谱, 选择在连锁群上分布较均匀的 52 对 SSR 引物 ( 表 1) PCR 反应在 PTC-225 型 PCR 仪 (Bio-RAD, USA) 上进行, 反应体系为 10 μl PCR 反应程序为 : 94 预变性 3 min; 然后 95 变性 1 min, 55 退火 110 s, 72 延伸 60 s, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 8 min 后于 4 保存 PCR 扩增产物中加入 2 μl 溴酚蓝缓冲液, 在 8% 聚丙烯酰胺胶 (PAGE) 上 20W 恒功率电泳 1 h, 然后银染, 显色清楚后, 用 BIO-RAD visadoc (Bio-RAD, USA) 凝胶成像系统扫描胶片, 用 Quantity One 软件依据 pbr322 DNA Marker 计算出每个条带的分子量大小 SSR 分析中个别野生材料存在杂带情况, 在读带时只以主带记录 1.3 田间实验和表型鉴定 年在南京农业大学国家大豆改良中心江浦实验站夏播种植 196 份野生大豆材料, 穴播, 行长 4 m, 每行 5 穴, 穴距 0.8 m, 行距 1 m, 每穴定苗 8 10 株, 重复 2 次, 随机区组试验 植株生长期参考前人的标准 ( 许东河等, 1999) 记录与野生大豆地理生态分化及演变有关的植物学性状, 包括全生育期 营养生长期 生殖生长期等与光温反应特性及花色 种皮色 泥膜有无 叶形 百粒重 叶面积等表现较稳定且与大豆驯化有关的植物学性状 1.4 数据分析根据电泳条带将每个 SSR 等位基因变异的有 无分别用 1 和 0 表示, 计算遗传丰富度 (SSR 位点的等 图 1 中国野生与栽培大豆代表性样本地理分布示意图 ( 虚线将分成 和三大地理区 ) Fig. 1 Geographic distribution of Chinese wild and cultivated soybean samples. Dashed lines divide the whole country into three geographic regions (Northeast China, Huang-Huai-Hai Valleys and South China, abbreviated as, and, respectively).

4 136 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷 表 1 52 个 SSR 标记所检测的中国野生大豆地理群体的遗传多样性 Table 1 Genetic diversity detected by 52 SSR markers in geographic populations of Glycine soja in China 引物 ( 连锁群 ) Primer (LG) NA H NA H NA H NA H 引物 ( 连锁群 ) Primer (LG) NA H NA H NA H NA H Sat_385 (A1) BE (F) Satt225 (A1) Satt659 (F) BE (A2) Satt522 (F) AW132402(A2) Satt163 (G) Satt209 (A2) Satt324 (G) Satt509 (B1) AF (G) Satt665 (B1) Satt442 (H) Satt168 (B2) Satt302 (H) Satt020 (B2) Satt239 (I) Sat_337 (C1) Sat_299 (I) Sct_191 (C1) AW310961(J) Satt291 (C2) Satt244 (J) Satt286 (C2) Satt046 (K) Satt277 (C2) Sct_190 (K) Satt307 (C2) Sat_293 (K) Satt316 (C2) Satt284 (L) Sat_332 (D1a) Satt373 (L) Satt436 (D1a) Satt150 (M) Satt147 (D1a) Satt567 (M) BE475343(D1b) Satt210 (M) Satt005 (D1b) Satt683 (N) Sat_289 (D1b) Satt234 (N) Satt443 (D2) Satt347 (O) Satt311 (D2) Satt592 (O) Satt186 (D2) 最大值 Max Satt720 (E) 最小值 Min Satt606 (E) 总计 Total Satt269 (F) 平均 Average NA: 等位基因数 ; H: Simpson 指数 LG, Linkage group;, Northeast China;, Huang-Huai-Hai Valleys;, South China. NA, Number of allele; H, Simpson diversity index. 位基因数, 以 NA 表示 ) 离散度( 以 Simpson 指数 H 表 n 示, H = 1, 其中 P i 为某个 SSR 位点的第 i 个等 P i i= 1 位基因出现的频率, n 为该位点等位基因总数 ) 表型鉴定的 4 个质量性状 ( 种皮色 泥膜有无 花色 叶形 ) 按 Perry 和 McIntosh(1991) 方法计算频率, 数量性状参考王述民等 (2002) 方法进行分级, 以平均数 ( x ) 为基准, 0.25s 为级差 (s 为标准差 ), 最小级为小于 x 2s, 最大级为大于 x +2s, 用分级数据计算遗传多样性指数, 并采用 SPSS 13.0 对植物学性状的变异进行主成分分析 2 结果 2.1 中国野生大豆 SSR 位点的遗传多样性中国 196 份野生大豆在 52 个 SSR 位点上共检测出 837 个等位基因, 平均每个位点的丰富度为 16.1, 离散度 (Simpson 多样性指数 ) 为 0.852( 表 1) 位于 A2 连锁群上的 AW 标记的等位基因最多, 为 33 个 ; 位于 A2 上的 Satt209 等位基因最少, 只有 7 个 Simpson 指数最高的也是 AW132402, 为 0.948; 最低的是 G 连锁群上的 Satt163, 为 Simpson 指数的大小不一定能反映出等位基因数的差异 如连锁群

5 第 2 期丁艳来等 : 中国野生大豆的遗传多样性和生态特异性分析 137 I 上 Satt239 位点的等位基因数为 18, Simpson 指数为 0.915; 而连锁群 N 上 Satt683 的等位基因数是 27, 而 Simpson 指数只有 0.909, 两者等位基因数相差较大, 而 Simpson 指数值相差甚微, 是因为 Satt239 位点的等位基因频率比较均匀, 而 Satt683 位点的等位基因频率主要集中在少数几个等位基因上 因此最好结合丰富度和离散度两个指标来衡量种质资源的遗传多样性情况 使用 36 个 SSR 标记对 95 份中国栽培大豆分析所得的平均遗传丰富度和离散度分别为 11.4 和 0.773, 变幅分别为 4 21 及 ( 表 2) 栽培大豆地理群体遗传丰富度分别为 , 平均离散度分别为 ; 而对应的野生大豆地理群体遗传丰富度分别为 和 12.9, 平均离散度分别为 和 0.842( 表 1) 相比之下, 中国野生大豆及 地理群体的平均丰富度和离散度均高于相应的栽培大豆群体, 并且野生和栽培大豆群体中均以群体的多样性为最高 2.2 中国野生大豆地理群体间 SSR 位点的特异性 20 个连锁群上的 SSR 位点在不同群体中等位基因的频率互有差异, 表明各群体都有相对的优势等位基因, 这也表现在丰富度和离散度的不一致性上 ( 表 1) 表 3 归纳出在生态群体间出现频率变化的主要等位基因, 如位于 B2 连锁群上的 Satt168 位点在分子量为 208 bp 左右的等位基因在生态群体为优势等位基因, 所占比率为 40.3%, 在群体所占比率为 13.1%, 在群体所占比率则下降为 5.2% 又如分子量为 247 bp 左右的等位基因频率分别为 3.2% 8.2% 18.2%, 在为相对优势等位 表 2 36 个 SSR 标记所检测的中国栽培大豆地理群体的遗传多样性 Table 2 Genetic diversity detected by 36 SSR markers in geographic populations of Glycine max in China 遗传丰富度 Allele richness (NA) 遗传离散度 Simpson diversity index (H) 最大值 Maximum 最小值 Minimum 极差 Range 平均值 Mean 地理群体代号同图 1 Abbreviations for geographic populations are the same as in Fig. 1 表 3 中国野生大豆地理群体部分 SSR 位点等位基因 ( 条带大小 ) 的频率分布 Table 3 Frequency distribution of some SSR alleles (band size) in different geographic populations of Glycine soja in China 连锁群 LG 引物 Primer 等位基因 Allele (bp) 连锁群 LG 引物 Primer 等位基因 Allele (bp) A2 BE D1a Sat_ AW D2 Satt F Satt Satt I Satt K Satt Satt Sct_ B2 Satt M Satt 地理群体代号同图 1 Abbreviations for geographic populations are the same as in Fig. 1.

6 138 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷 基因 说明每个群体经过长时间的自然选择, 不同等位基因的频率会发生很大的变化以适应当地的生态环境, 造成了优势等位基因的出现 一些位点则表现为等位基因的有无 如位于 A2 连锁群上 AW 位点上, 分子量在 bp 之间的 6 个等位基因在和生态群体中没有出现, 而在生态群体中出现 ; 位于 F 连锁群的 Satt522 位点上 281 bp 的等位基因和 M 连锁群 satt150 位点上 169 bp 的等位基因为野生大豆特有 位于 D1a 连锁群 Sat_332 位点 230 bp 条带在 K 连锁群 Satt046 位点 183 bp 条带在 Sct_190 位点 218 bp 的条带在地区野生大豆中均未出现, 而在其他地区均出现 这里所表现出的生态特异性值得重视 2.3 中国野生大豆植物学性状的多样性在南京夏播条件下, 196 份野生大豆全生育期平均为 d, 变异系数为 18%( 表 4), 变幅为 d 全生育期由短到长大致可分为 d ( 有 56 份材料 ) d (83 份 ) d (29 份 ) 三个区段 营养生长期平均为 55.3 d, 变异系数为 35% 营养生长期次数分布图也表现出三个峰值, 分别在 d 之间 (53 份 ) d(57 份 ) d (56 份 ) 生殖生长期平均为 50.6 d, 变异系数为 13% 总的看来, 与生育期相关的几个指标均表现出较大的变异幅度, 变异系数顺序为营养生长期>全生育期>生殖生长期, 说明全生育期 的变异主要是由营养生长期的变异引起的 野生大豆百粒重平均为 2.00 g( 表 4), 变异系数 67%, 其中百粒重最小的 ZYD3714( 陕西黄陵 ) 仅 0.76 g, 最大的 ZYD6044( 福建福州 ) 为 9.61 g 通常认为百粒重在 2.5 g 以下的为典型野生大豆 ( 李福山, 1993; 徐豹等, 1995), 这样的材料有 158 份, 占总数的 80.61% 野生大豆所测叶面积的平均值为 17.7 cm 2, 变异系数为 64%, 叶面积最小的 ZYD3699 ( 陕西吴堡 ) 仅 1.1 cm 2, 最大的 ZYD3208( 山西垣曲 ) 达 cm 2 叶面积主要集中在 cm 2 之间, 20 cm 2 以下的占到总数的 69.90% 百粒重和叶面积表现出极显著正相关 (r = 0.792) 随着百粒重的增加, 叶面积也随之增加, 卵形和圆形叶的比重也逐渐增加 从表 4 可见, 大部分野生大豆表现为黑种皮 有泥膜 紫花 圆叶 196 份材料中有 174 份为黑种皮 ( 占总数的 88.78%), 173 份种子有泥膜 ( 占 88.27%), 185 份开紫花 ( 占 94.39%), 179 份复叶为卵圆或椭圆形 ( 占 91.33%) 此外还出现倾向栽培大豆的半野生化趋势, 如百粒重增加 种皮色变化 叶面积变大以及叶形变得宽圆等 样本中百粒重在 4.00 g 以上的材料有 17 份 ( 占总数的 8.67%); 种皮色为褐 黄 绿 双色的材料共有 22 份 ( 占 11.22%); 叶面积在 38.2 cm 2 以上的材料有 11 份 ( 占 5.61%); 叶形表现为圆形的材料有 15 份 ( 占 7.65%) 具有半野生化表现的材料合计约 10% 左右 表 4 中国野生大豆地理群体 6 个数量性状和 4 个质量性状的表现特点 Table 4 Six quantitative and four qualitative traits in different geographic populations of Glycine soja in China 性状 Trait (n = 196) (n = 62) (n = 61) (n = 73) x ± s H x ± s H x ± s H x ± s H 全生育期 Whole growth period (WGP) (d) 105.9± ± ± ± 营养生长期 Vegetative growth period (d) 55.3± ± ± ± 生殖生长期 Reproductive growth period (RGP) (d) 50.6± ± ± ± 生殖生长期 / 全生育期 RGP/WGP 49.3± ± ± ± 百粒重 100-seeds weight (g) 2.00± ± ± ± 叶面积 Leaf size (cm 2 ) 17.7± ± ± ± 黑 / 非黑种皮 Black seed coat/others 88.78/ / / / 有 / 无泥膜 With/without sootiness 88.27/ / / / 紫花 / 白花 Purple/white flower 94.39/ / / / 圆叶 / 披针叶 Ovate/narrow leaf 91.33/ / / / 平均值 Mean x : 平均数 ; s, 标准差 ; H: Simpson 指数 Abbreviations for geographic populations are the same as in Fig. 1. x, Average; s, Standard deviation, H, Simpson diversity index.

7 第 2 期丁艳来等 : 中国野生大豆的遗传多样性和生态特异性分析 139 还发现野生大豆种皮色和泥膜有无与百粒重有关, 种皮色为黄 褐 绿 双色的种子百粒重平均值分别为 6.24 g 4.64 g 3.51 g 2.80 g, 明显高于种皮色为黑色的 1.72 g 无泥膜种子百粒重(4.67 g) 也高于有泥膜种子的百粒重 (1.65 g) 综合数量和质量性状数据所计算的中国野生大豆群体 Simpson 指数平均为 0.701( 表 4), 地理群体平均 Simpson 指数分别为 和 0.671, 总体上表现出较高的遗传多样性, 群体略高, 特别在营养生长期 百粒重 叶面积等性状的多样性最高 2.4 中国野生大豆植物学性状演变趋势和地理群体间的相异性从表 4 可见, 由南向北野生大豆的全生育期逐渐缩短且变异幅度很大, 由晚熟型逐渐变成早熟型, 由光温敏感型逐渐转变成不敏感型 ; 群体间营养生长期平均数差异很大, 而生殖生长期变化不大, 说明全生育期的变异主要是由营养生长期的变异引起的 野生大豆的百粒重和叶面积也表现出由向 生态群体表现出逐渐增加的趋势 和三个地理群体中种皮色均以黑色为主, 但所占比率由北向南依次下降, 分别 为 96.77% 88.52% 和 82.19%, 非黑种皮类型比例则上升 此外, 种皮色的种类也发生变化, 由北向南种皮颜色类型逐渐增多 群体种皮色出现了黑 褐 双色 3 种, 群体出现了黄 黑 褐 双色 4 种, 群体出现了黄 绿 黑 褐 双色 5 种 种子以有泥膜为主, 但有泥膜的种子所占的比率由北向南依次降低, 和群体分别为 93.55% 88.52% 和 83.56% 另外, 每个生态区均以紫花为主 在叶形方面, 只有群体出现 1 份线形材料, 其他两个群体则没有出现 群体中披针形叶所占比率较大, 为 24.19%, 而在 群体中披针形叶所占的比率分别只有 1.64% 和 1.37% 在圆形叶中, 椭圆叶在 和群体所占比率分别为 66.13% 32.79% 和 32.88%, 而卵圆叶比例分别为 9.68% 65.57% 65.75% 由北向南叶形的总体变化趋势是由狭长变得宽圆 2.5 中国野生大豆植物学性状的主成分分析群体的主成分分析可以指示性状的空间变异方向和程度, 并能够较好地从众多性状中解释方差的主要来源 ( 金伟栋和洪德林, 2006) 从表 5 可见, 第一主成分占总变异的 33.83%, 主要反映在全生育 表 5 中国野生大豆地理群体植物学性状的主成分分析结果 Table 5 Three principal components and corresponding vectors of botanical traits in geographic populations of Glycine soja in China 指标 / 性状 主成分 Principal components Indicator / trait 特征值 Eigenvalues 贡献率 Contribution 全生育期 Whole growth period (WGP) (d) 营养生长期 Vegetative growth period (d) 生殖生长期 Reproductive growth period (RGP) (d) 生殖生长期 / 全生育期 RGP/WGP 百粒重 100-seeds weight 叶面积 Leaf size 种皮色 Seed coat color 泥膜 Sootiness of seed 花色 Flower color 叶形 Leaf shape Abbreviations for geographic populations,, and are the same as in Fig. 1.

8 140 生物多样性 Biodiversity Science 第 16 卷 期 营养生长期和生殖生长期 / 全生育期上的差异 ; 第二主成分占总变异的 26.73%, 主要反映在百粒重 种皮色 生殖生长期 叶形的差异 ; 第三主成分占总变异的 11.99%, 主要反映在泥膜 叶面积上的差异 由三个主成分的变异累积引起的变异占到总变异量的 72.50%, 全生育期 营养生长期 生殖生长期 百粒重 泥膜 花色 种皮色等均具有高的遗传变异 野生大豆地理群体的变异方向和程度有所不同 在三个群体中前三个主成分的累计贡献率分别为 75.76% 75.26% 69.51%, 第一主成分的贡献率分别达 35.10% 47.82% 和 35.28%, 其中群体中种子百粒重 泥膜有无在第一主成分中有最大载荷量, 而在和群体中生育期性状有较大载荷量, 百粒重也贡献了主要变异 各生态群体的第二主成分主要为生育期性状, 群体中泥膜有无 百粒重等也较重要 第三主成分中群体主要为生育期性状, 为叶形, 群体为叶面积和生殖生长期等主导 从及 3 个地理群体主成分分析结果可见, 生育期等性状受到不同生态区光温条件的自然选择, 表现为显著的地理分化, 而籽粒 叶形等性状的变异则表现为多方向性 2.6 中国野生大豆 SSR 位点和植物学性状变异的比较从表 1 和表 4 可见中国野生大豆群体的植物学性状和分子标记均表现出较高的遗传多样性 中国野生大豆群体分子标记的 Simpson 多样性指数的最大值 (H = 0.948) 最小值(0.317) 平均值(0.852) 均相应高于植物学性状的遗传多样性指数 ( 分别为 和 0.701), 而植物学性状的 Simpson 指数的变幅 (0.710) 则高于分子标记 (0.631), 其原因在于一些质量性状如种子泥膜有无 种皮色等离散度很小, 导致植物学性状的遗传多样性指数平均值较小, 变幅则变大 分子标记所反映的中国野生大豆地理群体的遗传变异高于植物学性状表型所显示的遗传变异, 而且分子标记和植物学性状所反映的遗传多样性均以野生群体最高 3 讨论一些研究根据国家种质库保存的 5,279 份中国 野生大豆资源原产地籽粒和茎叶形态性状变异特点发现, 中国野生大豆籽粒等性状的变异中心在我国北方以郑州为中心的黄河流域和地区, 并推测黄河流域的黄土高原及毗邻的华北 黄淮平原和东部山地及西南毗邻的平原为栽培大豆的起源中心 ( 徐豹等, 1995; 庄炳昌等, 1996) 董英山等 (2000) 进一步分析了国家种质库保存的 6,172 份中国野生大豆资源 12 个形态性状的特点, 认为中南部 黄河中下游和秦岭山区 东南沿海地区的野生大豆均具有高的遗传多样性和综合变异系数, 推测中国野生大豆形成了不均衡的三个多样性中心 : 即为初生多样性中心, 黄河中下游和秦岭山区 东南沿海地区分别为次生和再生多样性中心 鉴于这些研究所依据的是野生大豆基因库来自各地的身份数据 (passport data), 而各地生态和生产条件有相当大的差异, 因此这些数据反映了遗传基因与环境共同作用的结果 精确的遗传分析还有待于分子标记的分析和同一环境条件下表型变异的分析 本研究对野生大豆的植物学性状和 SSR 分子标记的分析结果均表明我国 野生大豆代表性群体具有较高的遗传变异, 且野生和栽培大豆的多样性均高于北方, 这与盖钧镒等 (2000) 细胞器 DNA 的 RFLP 的结果相一致 赵洪锟等 (2000, 2001) 对中国不同纬度野生和栽培大豆小样本的 AFLP SSR 分析结果也表明北方大豆多样性相对低于 鉴于本研究和上述细胞器 DNA RFLP 研究的设计相对较为严格, 结果的可信度应是较高的 若按中国野生大豆以为变异中心的假设, 向北扩散时各群体应大同小异, 只是增加了在各地的适应性变异 ; 若按多变异中心假设, 则不同野生群体应有较大差异 本研究分子标记的大同而小异的情况支持了前者 当然这有待进一步探究, 本研究的后续研究将从细胞质和细胞核两方面的分子标记分析来验证上述假设 在长期的自然选择作用下, 相同环境条件下野生大豆生物学性状具有趋同性 本研究结果表明一些植物学性状也有较高的遗传多样性, 并且不同地理群体中也存在着高度的分化, 体现了野生大豆对不同生态环境的适应 生态类型全生育期较长 光温反应敏感 叶形宽圆 ; 生态群体全生

9 第 2 期丁艳来等 : 中国野生大豆的遗传多样性和生态特异性分析 141 育期较短 光温反应钝感 叶形狭小 但在每个野生大豆地理群体中都有一些材料出现百粒重增大 种皮非黑色 无泥膜 叶片较大等类似栽培大豆的性状, 表现出半野生化特征 野生大豆在人工选择驯化成栽培大豆的过程中, 其中间类型可能就是这类半野生化的材料 ( 庄炳昌等, 1996) 这类材料既可能来自野生和栽培大豆的杂交重组, 也可能来自基因突变 (Chen & Nelson, 2004b; Kuroda et al., 2006) 本研究发现群体百粒重 叶面积等形态性状的自然变异大, 这一特点可能先为人类所利用 深入研究这类材料的来源将有助于揭示栽培大豆的起源 SNP 分析表明栽培大豆在驯化过程中出现明显的 瓶颈 效应 (Hyten et al., 2006) 本研究中 SSR 标记分析也表明野生大豆遗传变异和多样性均远高于栽培大豆 究其原因, 一是栽培大豆是由特定地区部分野生大豆驯化而来, 因此只具有部分野生大豆的多样性 ; 同时栽培大豆经历了长期的人工选择, 很多自然变异被淘汰 因此需要系统研究不同地区栽培和野生大豆群体的多样性特点, 有针对性地选择野生大豆基因资源, 拓宽大豆育种的遗传基础 参考文献 Abe J, Xu DH, Suzuki Y, Kanazawa A (2003) Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSR. Theoretical and Applied Genetics, 106, Chen YW, Nelson RL (2004a) Genetic variation and relationships among cultivated, wild, and semiwild soybean. Crop Science, 44, Chen YW, Nelson RL (2004b) Identification and characterization of a white-flowered wild soybean plant. Crop Science, 44, Cregan PB, Jarvik T, Bush AL, Shoemaker RC, Lark KG, Kahler AL, Kaya N, VanToai TT, Lohnes DG, Chung J, Specht JE (1999) An integrated genetic linkage map of the soybean genome. Crop Science, 39, Dong YS ( 董英山 ), Zhuang BC ( 庄炳昌 ), Zhao LM ( 赵丽梅 ), Sun H ( 孙寰 ), Zhang M ( 张明 ), He MY ( 何孟元 ) (2000) The genetic diversity centers of annual wild soybean in China. Acta Agronomica Sinica ( 作物学报 ), 26, (in Chinese with English abstract) Dong YS, Zhuang BC, Zhao LM, Sun H, He MY (2001) The genetic diversity of annual wild soybeans grown in China. Theoretical and Applied Genetics, 103, Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12, Gai JY ( 盖钧镒 ), Wang YS ( 汪越胜 ) (2001) A study on the varietal eco-regions of soybeans in China. Scientia Agricultura Sinica ( 中国农业科学 ), 34, (in Chinese with English abstract) Gai JY ( 盖钧镒 ), Xu DH ( 许东河 ), Gao Z ( 高忠 ), Shimamoto Y, Abe J, Fukushi H, Kitajma S (2000) Studies on the evolutionary relationship among ecotypes of G. max and G. soja in China. Acta Agronomica Sinica ( 作物学报 ), 26, (in Chinese with English abstract) Hai L ( 海林 ), Wang KJ ( 王克晶 ) (2002) Genetic diversity of semi-wild soybean using SSR markers. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica ( 西北植物学报 ), 22, (in Chinese with English abstract) Hyten DL, Song QJ, Zhu YL, Choi IY, Nelson RL, Costa JM, Specht JE, Shoemaker RC, Cregan PB (2006) Impacts of genetic bottlenecks on soybean genome diversity. Proceedings of the Academy of Sciences, USA, 103, Jin WD ( 金伟栋 ), Hong DL ( 洪德林 ) (2006) Genetic diversity in japonica rice landraces (Oryza sativa) from the Taihu Lake region. Biodiversity Science ( 生物多样性 ), 14, (in Chinese with English abstract) Kuroda Y, Kaga A, Tomooka N, Vaughau DA (2006) Population genetic structure of Japanese wild soybean (Glycine soja) based on microsatellite variation. Molecular Ecology, 15, Li FS ( 李福山 ) (1990) A Catalog of Wild Soybean Germplasm in China ( 中国野生大豆资源目录 ). China Agricultural Press, Beijing. (in Chinese) Li FS ( 李福山 ) (1993) Studies on the ecological and geographical distribution of the Chinese resources of wild soybean (G. soja). Scientia Agricultura Sinica ( 中国农业科学 ), 26, (in Chinese with English abstract) Nichols DM, Wang LZ, Pei YL, Glover KD, Diers BW (2007) Variability among Chinese Glycine soja and Chinese and North American soybean genotypes. Crop Science, 47, Perry MC, McIntosh MS (1991) Geographical patterns of variation in the USDA soybean germplasm collection. I. Morphological traits. Crop Science, 31, Powell W, Morgante M, Doyle JJ, McNicol JW, Tingey SV, Rafalski AJ (1996) Genepool variation in genus Glycine subgenus Soja revealed by polymorphic nuclear and chloroplast microsatellites. Genetics, 144, Shimamoto Y, Fukushi H, Abe J, Kanazawa A, Gai JY, Gao Z, Xu DH (1998) RFLPs of chloroplast and mitochondrial DNA in wild soybean, Glycine soja, growing in China. Genetic Resources and Crop Evolution, 45, Tian QZ ( 田清震 ), Gai JY ( 盖钧镒 ), Yu DY ( 喻德跃 ), Lu HN ( 吕慧能 ), Jia JZ ( 贾继增 ) (2001) AFLP fingerprint analysis of G. soja and G. max in China. Scientia Agricultura Sinica ( 中国农业科学 ), 34, (in Chinese with English abstract) Wang B ( 王彪 ), Chang RZ ( 常汝镇 ), Tao L ( 陶莉 ), Guan RX

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