中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) 863 柱温 =30 ; 检测波长 =238nm; 流动相流速 =1 0 ml min -1 ; 进样阀定量为 10μl 样本预处理取

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1 862 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6):862~6 网络出版时间 : :04 网络出版地址 :htp:// 中药与天然药物药理学不同间隔时间冰片处理对大鼠栀子苷脑靶效应的影响喻斌 1, 阮鸣 2, 董小平 1, 金路 1 1, 瞿红霞 (1. 南京中医药大学药学院部省共建中药药理学实验室, 江苏南京 ; 2. 南京晓庄学院药用菌物研究所, 江苏南京 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2012) 中国图书分类号 :R 332;R284.1;R322.81;R969.1 摘要 : 目的研究不同间隔时间冰片处理对大鼠栀子苷脑内浓度的影响, 以指导临床用药方法冰片分别灌胃 min 后静脉注射栀子苷, 不同时间点取血取脑, 样本预处理后采用 HPLC 检测栀子苷浓度, 采用 3P97 计算血 - 药和脑 - 药参数, 并获取脑靶相关参数结果栀子苷在血浆和脑组织分布符合二室开放模型, 冰片处理后可提高栀子苷脑 - 药动力学的 C max 和 AUC, 延长 MRT, 缩短 T max 其中冰片 15min 组对栀子苷脑内相对生物利用度和脑靶指数的提高作用最明显结论冰片处理后可提高栀子苷入脑量和入脑速度, 冰片灌胃 15min 后血脑屏障开放最明显关键词 : 冰片 ; 给药间隔 ; 栀子苷 ; 血脑屏障 ; 脑靶 ; 高效液相色谱冰片是常用中药之一, 有悠久的应用历史, 在本草纲目等古籍中均有记载 2010 版中国药典收录的用于治疗心脑血管及中枢神经系统疾病的药物当中, 含有冰片的中成药就有苏合香丸冠心苏合丸安宫牛黄丸华佗再造丸冰硼散复方丹参类制剂等 20 余种从冰片在中成药中的应用不难发现, 冰片较少单独使用, 在许多成药中常作为引药, 对引诸药入经, 直达病所, 提高疗效有着重要意义 [1] 传统中医药理论认为冰片具有芳香走窜, 引药上行的特点开窍醒神的功效归心经 ( 心主神明 ), 这些似乎都在提示它对中枢神经系统有着不同寻常的关联而其对血脑屏障 (blood brainbarier) 的影响有可能为其阐明引药上行理论提供现代科学依据已有文献研究表明, 冰片不但本身极易透过血脑屏障, 还能促进其他药物如甲氨蝶呤尼莫司汀透收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ) 作者简介 : 喻斌 (1978-), 男, 博士生, 讲师, 研究方向 : 中药药理学,Tel: ,E mail:nzyyubin@163.com 过血脑屏障 [2-3] 后来又有学者研究发现它的这种促进药物入脑的作用可能和血脑屏障的通透性增加有关, 同时认为这种通透性增加属于生理性改变 [4] 目前对冰片的促进药物入脑作用已有研究 [5-6] 但是未见冰片和其他药物在给药间隔时间上对后者入脑相关性研究, 而这对冰片的血脑屏障开放作用至关重要, 正是基于上述原因进行本次研究 1 材料与方法 1.1 材料药物和试剂冰片, 南京市药材公司, 批号 : ; 栀子苷粉末, 潮州市泽润制药有限公司, 批号 : , 纯度 90%; 栀子苷标准品, 中国药品生物制品鉴定所, 批号 :201035, 纯度经 HPLC 检测大于 98% 仪器 1100 型高效液相色谱仪及其附件, 美国 Agilent 公司 ;XHF D 型高速分散器, 宁波新芝生物科技股份有限公司动物 SD 大鼠, 购于南京中医药大学实验动物中心, 许可证号 SYXK( 苏 ) 方法动物分组和给药方法选择清洁级 SD 大鼠 180 只, 按照有无采用冰片干预或冰片与栀子苷给药间隔时间, 将大鼠分为 4 组, 每组 45 只即 : 空白组冰片 min 组冰片组灌胃冰片 0 2g kg -1 冰片 min 组分别于灌胃冰片 5,15,30min 后尾静脉注射栀子苷 300mg kg -1 空白组只注射栀子苷, 不给冰片处理控制注射速度为 0 1ml s -1 各组动物给予栀子苷后于 min 眼眶取血 1 5ml 于肝素化离心管中, 全血离心取血浆同时处死大鼠, 取脑, 剔除脑部大血管, 称重每个时间点 5 只大鼠血浆和脑样本按照项进行预处理后备用进样色谱条件色谱柱 :HederaODS 3C 18 (250 mm 4 6mm,5μm); 流动相 : 甲醇水 =35 65;

南京晓庄学院药用菌物研究所, 江苏南京 211171) doi:10.3969/j.isn.1001-1978.2012.06.029 文献标志码 :A 文章编号 :1001-1978(2012)06-0862-05 中国图书分类号 :R 332;R284.1;R322.81;R969.

2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) 863 柱温 =30 ; 检测波长 =238nm; 流动相流速 =1 0 ml min -1 ; 进样阀定量为 10μl 样本预处理取血浆 0 3ml, 加入甲醇 1 ml, 涡旋混匀 1min, 离心 16000r min -1,10min, 取上清液,40 氮气流下吹干, 残留物溶于 500μl 流动相中, 涡旋混匀 1min, 离心后取上清液 10μl 进样脑组织按照脑重 (g)/ns 体积 (ml)=2/3 的比例进行匀浆, 取 1ml 脑匀浆, 加入甲醇 3ml, 涡旋混匀 1min, 离心 3000r min -1,10min, 取上清,40 氮气流下吹干, 残留物溶于 500μl 流动相中, 涡旋混匀 1min, 离心后取上清液 10μl 进样方法学考查专属性试验分别取大鼠空白血浆脑匀浆, 加入栀子苷标准品的空白血浆脑匀浆及大鼠注射栀子苷后获取的血浆脑匀浆样品, 按项下操作, 观察其他成分对栀子苷的干扰情况标准曲线的绘制取大鼠空白血浆 0 3 ml, 加入栀子苷系列标准品, 配制成相当于浓度为 1 4,0 7,0 35,0 175,0 0875, 和 g L -1 的血浆标准品溶液, 按照上述方法中项下操作以血浆中栀子苷浓度 (C) 为横坐标, 栀子苷峰面积 (Y) 为纵坐标绘制标准曲线, 确定线性范围另外取血浆标准品溶液逐级稀释, 以信噪比 S/N=3 和 S/N=10 时的浓度, 分别作为最低检测限和最低定量限取空白脑匀浆 1ml, 加入栀子苷系列标准品, 配制成相当于浓度为 0 106,0 053,0 0265, , , 和 g L -1 的脑匀浆标准品溶液, 按照上述方法中项下操作以脑匀浆中栀子苷浓度 (C) 为横坐标, 栀子苷峰面积 (Y) 为纵坐标绘制标准曲线, 确定线性范围另外取脑匀浆标准品溶液逐级稀释, 以信噪比 S/N=3 和 S/N=10 时的浓度, 分别作为最低检测限和最低定量限提取回收率利用空白血浆配制 0 7, 和 g L -1 3 种不同浓度的标准品溶液, 按项下进行样品处理, 分别测定栀子苷的峰面积另外再利用空白血浆, 按照项下进行预处理后再加入栀子苷, 使之浓度分别为 0 7,0 175 和 g L -1, 分别测定栀子苷的峰面积每种浓度均为 5 个样本用含药血浆经处理后的进样峰面积除以血浆经处理后加栀子苷溶液的进样峰面积的比值作为血浆样本提取回收率利用脑匀浆配制 0 053, 和 g L -1 3 种不同浓度的标准品溶液, 按项下进行样品处理, 分别测定栀子苷的峰面积另外再利用空白脑匀浆, 按照项下进行预处理后再加入栀子苷, 使之浓度分别为 0 053, 和 g L -1, 分别测定栀子苷的峰面积每种浓度均为 5 个样本用含药脑匀浆经处理后的进样峰面积除以脑匀浆经处理后加栀子苷溶液的进样峰面积的比值作为脑样本提取回收率日间和日内精密度测定参照标准曲线与定量范围, 利用空白血浆配制 0 7,0 175 和 g L -1 3 种不同浓度的标准品溶液, 另外再利用脑匀浆配制 0 053, 和 g L -1 3 种不同浓度的标准品溶液按项下进行样品处理, 在 1d 内不同时间进样, 计算日内 RSD 另外在 5 日内进样, 计算日间 RSD 稳定性考察对 0 7,0 175 和 g L -1 3 种不同浓度的血浆标准品溶液 (n=5) 和 0 053, 和 g L -1 3 种不同浓度的脑匀浆标准品溶液 (n=5) 在室温 (20 )24h - 20 冰冻 24h, 以及反复冻融 3 次后, 观察回收率数据分析所有时间点血药浓度和脑药浓度测定值以均值表示并绘制血药浓度 - 时间曲线和脑药浓度 - 时间曲线 ( 见 Fig2 3), 用 3P97 软件进行数据处理, 选择拟和优度值最小者为最佳权重, 再比较该权重下不同房室模型的 AIC 值,AIC 值最小者, 为最佳房室模型, 求出药代动力学参数 C max 和 T max 直接由血 - 药浓度值和脑 - 药浓度值获取同时按照下列公式计算各组血浆和脑组织的相对生物利用度 (F) 以及冰片的药物靶向指数 (Drugtarget index,dti) [7] F=AUC 干预组 /AUC 空白组 100% DTI=[AUC 干预组 - 脑 /AUC 干预组 - 血 ]/[AUC 空白组 - 脑 / AUC 空白组 - 血 ] 干预组分别为冰片 min 组干预组 - 脑和干预组 - 血分别为以上干预方法的脑和血样本 2 结果 2.1 方法专属性实验结果色谱结果见 Fig1 所示, 色谱分离良好, 不受内源性杂质峰干扰, 栀子苷的保留时间为 7 84min 2.2 标准曲线和线性范围栀子苷血药浓度标准曲线的回归方程为 ^Y=16631C ,r= 线性范围 : ~1 400g L -1 栀子苷脑药浓度标准曲线的回归方程为 ^Y=19923C ,r= 线性范围 : ~

于 500μl 流动相中, 涡旋混匀 1min, 离心后取上清液 10μl 进样脑组织按照脑重 (g)/ns 体积 (ml)=2/3 的比例进行匀浆, 取 1ml 脑匀浆, 加入甲醇 3ml, 涡旋混匀 1min, 离心 3000r min -1,10min, 取上清,40 氮气流下吹干, 残留物溶于

3 864 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) g L -1 血浆标准品溶液检测限和定量限分别为 g L -1 和 g L -1 脑匀浆标准品溶液检测限和定量限分别为 g L -1 和 g L -1 h 处理, 栀子苷回收率均在 94% ~103% 之间, 表明栀子苷在这 3 种状态下稳定, 具体结果见 Tab 冰片和栀子苷不同间隔时间给药后大鼠血液和脑内栀子苷动力学分析按项下分组给药后, 大鼠血药浓度 - 时间曲线经 3P97 软件进行分析, 发现栀子苷血 - 药浓度曲线和脑 - 药浓度曲线均符合二室开放模型,W =1 其血 - 药和脑 - 药浓度曲线见 Fig2 3, 药动学参数见 Tab3 4, 脑靶参数见 Tab5 Tab1 Stabilityofgeniposideinplasmaunder diferentstorageconditions( x±s,n=5) 珋 Storage Remain condition added/g L -1 found/g L -1 percentage/% Freeze thaw ± ± ± Roomtemperature,24h ± ± ± ,24h ± ± ± Tab2 Stabilityofgeniposideinbraintisueunderdiferent storageconditions( x±s,n=5) 珋 Storage Remain Fig1 SpecificityofHPLCchromatogramas A:Geniposidestandard;B:Blankplasmasample;C:Blankbrainsample; D:Plasmasample;E:Brainsample 2.3 提取回收率结果血浆栀子苷和 g L -1 3 种浓度的回收率分别为 (94 1± 3 90)%,(95 6±0 79)%,(95 0±4 73)% 脑匀浆栀子苷和 g L -1 3 种浓度的回收率分别为 (94 3±3 59)%,(92 7± 2 40)%,(95 4±1 15)% 2.4 日间和日内精密度测定结果血浆栀子苷和 g L -1 三种浓度的日内精密度测试中 RSD 分别为 4 77% 3 49% 和 2 33%, 日间精密度测试中 RSD 分别为 3 30% 3 34% 和 4 52% 脑组织栀子苷和 g L -1 3 种浓度的日内精密度测试中 RSD 分别为 2 28% 2 54% 和 3 89%, 日间精密度测试中 RSD 分别为 3 32% 4 49% 和 1 79% 2.5 稳定性考察结果血浆和脑组织栀子苷稳定性考察中发现经过冻融 3 次室温 24h 或 conditions added/g L -1 found/g L -1 percentage/% Freeze thaw ± ± ± Roomtemperature,24h ± ± ± ,24h ± ± ± Fig2 Plasmaconcentration timecurveofgeniposidein ratstreatedwithborneol(n=5)

6 冰片和栀子苷不同间隔时间给药后大鼠血液和脑内栀子苷动力学分析按 1 2 1 项下分组给药后, 大鼠血药浓度 - 时间曲线经 3P97 软件进行分析, 发现栀子苷血 - 药浓度曲线和脑 - 药浓度曲线均符合二室开放模型,W =1 其血 - 药和

4 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) 865 Fig3 Brainconcentration timecurveofgeniposide inratstreatedwithborneol(n=5) Tab3 Efectofdiferenttreatingintervalsbetweenborneol andgeniposideonthepharmacokineticsinratplasma Units Control Borneol Borneol Borneol 5min 15min 30min AUC 0 g L -1 min AUMC MRT min C max g L Tab4 Efectofdiferenttreatingintervalsbetweenborneol andgeniposideonthepharmacokineticsinratbraintisue Units Control Borneol Borneol Borneol 5min 15min 30min AUC 0 g L -1 min AUMC MRT min T max min C max g L Tab5 Efectofdiferenttreatingintervalsbetweenborneol andgeniposideonbrain targetingparameters Borneol5min Borneol15min Borneol30min F plasma F brain DTI 讨论观察血脑屏障的开放情况虽然可通过伊文思蓝染色来进行推测, 但该法缺乏灵敏性和精确性, 与临床吻合度低通过 HPLC 直接观察药物的入脑量, 在接近临床实际的同时也增加了检测的准确性和灵敏度 [8-9] 栀子苷对神经细胞均具有一定的保护作用, 以它为追踪对象接近临床实际 [10] 本实验建立的栀子苷血浆和脑组织检测方法专属性强, 数据可靠, 适合生物样品的测定要求 3P97 为中国药理学会专门为药物代谢动力学研究设计的相关软件, 目前在国内外均得到广泛应用和认可本实验结果显示冰片 3 种处理方式对栀子苷在血浆中的 C max MRT 和 AUC 均无明显影响, 提示冰片对栀子苷的消除并没有明显影响而脑组织中栀子苷含量比较可见冰片 min 组的 T max 为 1 min, 提前于空白组的 5min T max 的提前提示冰片可促进 BBB 的开放, 加速药物入脑, 这为其用于临床中枢神经系统疾病的抢救治疗提供依据而冰片 min 组的 AUC 0 和 MRT 均大于空白组, 表明冰片可增加栀子苷的入脑量, 延长后者的大脑留滞时间, 增加其大脑蓄积效应冰片增加药物的脑内含量以及延长药物中枢效应时间, 对于部分入脑困难的中枢神经系统药物疗效的发挥具有重要意义此外冰片 15 30min 组的 C max 高于空白组, 也进一步明确了冰片对药物入脑的促进作用冰片的 3 种处理组相互比较, 发现冰片 15min 组在 AUC 0 和 C max 均优于其他两组, 这也提示冰片口服 15min 后给药对于药物入脑的促进作用最明显而脑组织栀子苷 MRT 的变化趋势和 C max 完全相反, 提示当栀子苷脑内浓度较大时, 其脑内消除速度也更快冰片脑靶参数结果表明冰片处理对于栀子苷的血浆相对生物利用度似乎未见明显影响, 但是对脑组织中栀子苷的生物利用度可提高 17% ~27%, 此外冰片还能提高脑靶参数 ( 提高 18% ~32%) 而冰片 3 种处理组中比较, 冰片 15min 组对这两个指标的提高作用最明显, 提示临床冰片促进 BBB 开放和药物入脑的最佳时机是口服冰片后 15min 左右另外, 对于栀子苷的脑内分布数据还可发现冰片 5min 组虽可使 T max 提前, 但是 C max 确未见明显改变, 其增加 AUC 0 主要是通过 MRT 的延长来贡献的, 提示冰片的早期效应可能与抑制脑内药物消除相关, 而对药物的入脑速度影响不大冰片 30min 组的开放 BBB 效应不及冰片 15min 可能与冰片较快的代谢速度有关参考文献 : [1] 肖衍宇, 平其能. 冰片 β 环糊精包合物对磷酸川芎嗪在小鼠血浆及脑组织分布的影响 [J]. 中国药科大学学报,2009,40 (5): [1] XiaoYY,PingQN.Efectsofborneol β cyclodextrininclusion complexontheplasmaandbrainconcentrationsoftetrameth ylpyrazinephosphateinmice[j].jchinapharm Univ,2009,40 (5): [2] 高晨, 高, 史卫忠, 等. 冰片对甲氨蝶呤透过血脑屏障影响的实验研究 [J]. 中国临床药理学杂志,2009,25(2):134-

5 866 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) 7,157. [2] GaoC,GaoM,ShiW Z,etal.Experimentalstudyontheefect ofborneolformethotrexatepenetratingacrosbloodbrainbarier [J].ChinJClinPharmacol,2009,25(2):134-7,157. [3] 史卫忠, 赵志刚. 冰片作用下尼莫司汀透过血脑屏障的药动学 [J]. 中国医院药学杂志,2008,28(22): [3] ShiW Z,ZhaoZG.Pharmacokineticsstudyofnimustine(AC NU)throughbloodbrainbarierafterintragastricadministrationof borneol[j].chinhosppharmj,2008,28(22): [4] 赵保胜, 刘启德. 冰片促血脑屏障开放与病理性开放的比较 [J]. 中药新药与临床药理,2002,13(5): [4] ZhaoBS,LiuQD.Comparisonbetweenborneol inducedoper= ningofblood brainbarieranditspathologicalopening[j].tradit ChinDrugResClinPharmacol,2002,13(5): [5] 刘启德, 梁美蓉, 陈芝喜, 等. 冰片对庆大霉素透血脑屏障的影响 [J]. 广州中医药大学学报,1994,11(1): [5] LiuQD,LiangM R,ChenZX,etal.Theinfluenceofborneol onthepasingofgentamycinthroughblood brainbarier[j].j GuangzhouUnivTraditChinMed,1994,11(1): [6] 陈新梅, 朱家壁, 孙卫东, 张立健. 吸收促进剂对人参皂苷 Rg1 鼻腔吸收的促进作用及鼻腔毒性 [J]. 药学学报,2006,41(2): [6] ChenXM,ZhuJB,SunW D,ZhangLJ.Efectofabsorption enhancersonnasalginsenosiderg1deliveryanditsnasalciliotox icity[j].actapharmsin,2006,41(2): [7] CaiZ,HouS,LiY,etal.Efectofborneolonthedistributionof gastrodintothebraininmiceviaoraladministration[j].jdrug Target,2008,16(2): [8] YuB,RuanM,SunY,etal.Efectofborneolandelectroacu punctureonthedistributionofhyperforinintheratbrain[j].neu ralregenres,2011,6(24): [9] 魏丽丽, 陈虹, 姜勇, 等. 高效液相法测定松果菊苷在脑缺血大鼠血浆和脑组织中的浓度 [J]. 中国药理学通报,2011, 27(5): [9] WeiLL,ChenH,JiangY,etal.DeterminationofECHoncere bralischemiainjuryratplasmaandbraintisuebyhplcmethod [J].ChinPharmacolBul,2011,27(5): [10] 侯金才, 张鹏, 刘建勋, 等. 栀子苷对缺氧 / 复氧小胶质细胞 TLR4 通路的影响 [J]. 中国药理学通报,2011,27(6): [10]HouJC,ZhangP,LiuJX,etal.GeniposideonTLR4pathwayin culturedratmicrogliawithhypoxia/reoxygenation[j].chinphar macolbul,2011,27(6): Theinfluenceofborneoltreatmentintervalonthe concentrationofgeniposideinratbrains YUBin 1,RUANMing 2,DONGXiao ping 1,JINLu 1,QUHong xia 1 (1.KeyPharmacologyofTCM LaboratoryConstructedbyMinistryofEducationandJiangsuProvince,NanjingUniversityofTraditional ChineseMedicine,Nanjing ,China;2.InstituteofMedicinalFungi,NanjingXiaozhuangColege,Nanjing ,China) Abstract:Aim Toresearchonthetheinfluenceof borneoltreatmentintervalontheconcentrationofgeni posideinratbrainsforclinicappliance.methods Ratsweretreatedwithborneoloralyandgeniposideby intravenousinjectionwiththeintervalof5,15,30min. Theconentrationofgeniposideintheplasmaandbrain tisuewasdetectedbyrt HPLCthechnologyandthe datawasanalyzedby3p97software.results Pharma cokineticsofgeniposideintheplasmaandbrainmet withtwo compartmentmodel.borneolcouldenhance thecmaxandaucofgeniposidecomparedwithcon trolgroup.inaddition,themrtwasprolongedand Tmaxwasshortened.Theborneol15mingroupwas themostnotableonthefbrainanddti.conclusion Borneolcanincreasethequantityandvelocityofgeni posidepermeatingthebrainandtheopeningofthe BBBisthemostobviousafteritisintragastricalyad ministeredfor15min. Keywords:borneol;dosinginterval;geniposide;blood brainbarier;braintarget;hplc 我们收到投稿, 登记后会回复给您稿号及论文投送调查表, 请注意查收

Pharmacokineticsstudyofnimustine(AC NU)throughbloodbrainbarierafterintragastricadministrationof borneol[j].chinhosppharmj,2008,28(22):1933-6. [4] 赵保胜, 刘启德. 冰片促血脑屏障开放与病理性开放的比较 [J].

FX1.s92

FX1.s92 知识目标 : 了解药物鉴别的意义学习目标理解药物鉴别试验的项目掌握药物鉴别试验的常用方法能力目标 : 能熟练应用药物鉴别的常用方法对药物进行鉴别第一节概述药物的鉴别试验是根据药物的组成分子结构和理化性质, 采用化

中 国 药 理 学 通 报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) 863 柱 温 =30 ; 检 测 波 长 =238nm; 流 动 相 流 速 =1 0 ml min -1 ; 进 样 阀 定 量 为 10μl 样 本 预 处 理 取

中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Jun;28(6) 863 柱温 =30 ; 检测波长 =238nm; 流动相流速 =1 0 ml min -1 ; 进样阀定量为 10μl 样本预处理取