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1 中 国 农 业 科 学 2008,41(8): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 廖 兰 1,2, 饶 勇 1,3, 杨 桂 香 1, 黄 显 会 1, 曾 忠 良 3, 曾 振 灵 1 ( 1 华 南 农 业 大 学 兽 医 学 院 / 广 东 省 兽 药 研 制 和 安 全 评 价 重 点 实 验 室, 广 州 ; 2 西 南 大 学 荣 昌 校 区, 重 庆 ; 3 西 南 大 学 药 学 院, 重 庆 ) 摘 要 : 目 的 建 立 并 验 证 同 时 检 测 诺 氟 沙 星 氧 氟 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 洛 美 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 二 氟 沙 星 噁 喹 酸 萘 啶 酸 和 氟 甲 喹 等 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 在 鸡 蛋 中 残 留 的 高 效 液 相 色 谱 - 荧 光 检 测 分 析 方 法 方 法 鸡 蛋 样 品 以 乙 腈 - 三 氯 乙 酸 溶 液 匀 浆 和 超 声 提 取, 经 反 相 聚 合 物 SPE 净 化 和 浓 缩 ; 样 品 以 乙 腈 - 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液 为 流 动 相 经 C18 柱 HPLC 梯 度 洗 脱 分 离, 用 荧 光 检 测 器 程 序 波 长 检 测 结 果 线 性 范 围 除 达 氟 沙 星 为 5.0~160.0 μg kg -1 外, 其 余 11 种 药 物 为 12.5~400.0 μg kg -1 添 加 6 个 浓 度 测 得 的 校 正 曲 线 的 相 关 系 数 除 氟 甲 喹 为 以 外, 其 它 11 种 药 物 均 大 于 添 加 1/2 MRL MRL 2 MRL 共 3 个 浓 度 水 平 3 批 样 品 的 回 收 率 除 萘 啶 酸 为 52% 外, 其 它 11 种 药 物 为 68%~85% 批 内 变 异 系 数 <8%, 批 间 变 异 系 数 除 氟 甲 喹 1/2 MRL 为 18.0% 和 恩 诺 沙 星 1/2 MRL 为 18.8% 外, 其 它 药 物 均 13.0% 12 种 药 物 的 检 测 限 为 0.2~4.1 μg kg -1, 定 量 限 为 0.9~13.5 μg kg -1 结 论 建 立 的 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 简 便 快 速 使 用 有 机 溶 剂 少, 适 用 范 围 广, 适 合 大 量 样 品 的 筛 选 和 定 量 检 测 关 键 词 : 喹 诺 酮 类 ; 残 留 ; 高 效 液 相 色 谱 ; 鸡 蛋 Development of HPLC Method for Multiresidue Determination of 12 Quinolones in Egg LIAO Lan 1, 2, RAO Yong 1, 3, YANG Gui-xiang 1, HUANG Xian-hui 1, ZENG Zhong-liang 3, ZENG Zhen-ling 1 ( 1 College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Development and Safety Evaluation; Guangzhou ; 2 Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing ; 3 College of Pharmacy, Southwest University, Chongqing ) Abstract: Objective A high performance liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection (FLD) was developed and validated for simultaneous determination of residues of 12 quinolones (QNs), norfloxacin (NOR), ofloxacin (OFL), ciproflocacin (CIP), peflocacin (PEF), lomefloxacin (LOM), danofloxacin (DAN), enrofloxacin (ENR), sarafloxacin (SAR), difloxacin (DIF), oxolinic acid (OXO), nalidixic acid (NAL) and flumequine (FLU) in egg. Method Egg samples were extracted by a homogenater and an ultrasonic cleaner in 10% trichloroacetic acid (TCA) in water acetonitrile (8:2, v/v) and cleared and purified by a solid phase extraction (SPE) cartridges, Strata-X, based on a modified styrene-divinylbenzene polymer. Twelve QNs were separated by C 18 column (Hypersil BDS-C 18 ) with acetonitrile-citric acid/ammonium acetate buffer in water as the mobile phase using a linear gradient elution program and detected with fluorescence detection by means of a wavelength program. Result The tested ranges of quinolone calibrations were μg kg -1 for DAN, μg kg -1 for the other 11 QNs in egg with the correlation coefficients more than for 11 QNs exception to FLU (0.982). The validations for egg fortified with 12 QNs at three levels (1/2 MRL, MRL, and 2 MRL) obtained recoveries of 68%-85% exception to NAL (52%), intra-day coefficient of variability (CV) of less 8% and inter-day CV of less 13% exception to ENR (18.8% at 1/2 MRL) and FLU (18.0% at 1/2 MRL), limit of detection (LOD) of μg kg -1 and limit of quantification (LOQ) of μg kg -1. Conclusion The results suggested that the method for determination of 12 QNs residues in egg has a simple, fast sample treatment procedure with a little consumption of 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 基 金 项 目 : 科 技 部 食 品 安 全 重 大 项 目 (2001BA804A18-04) 作 者 简 介 : 廖 兰 (1969-), 女, 重 庆 荣 昌 人, 实 验 师, 硕 士, 研 究 方 向 为 兽 医 药 理 学 与 毒 理 学 [email protected] 通 讯 作 者 曾 振 灵 (1963-), 男, 广 东 兴 宁 人, 教 授, 博 士, 研 究 方 向 为 兽 医 药 理 学 与 毒 理 学, 动 物 源 食 品 安 全 Tel: ;Fax: ; [email protected]

2 2420 中 国 农 业 科 学 41 卷 organic solvent and an extensive applicability. It could meet the screening and quantification requirements for residue analysis. Key words: Quinolones; Residue; High performance liquid chromatography (HPLC); Egg 0 引 言 研 究 意 义 喹 诺 酮 类 药 物 (quinolones,qns) 是 一 类 新 型 高 效 广 谱 的 人 工 合 成 抗 菌 药, 在 人 医 和 兽 医 临 床 上 都 应 用 广 泛 随 着 QNs 在 食 品 动 物 中 大 量 使 用, 微 生 物 的 耐 药 性 越 来 越 严 重 [1], 而 且 残 留 于 食 品 中 的 药 物 会 直 接 危 害 消 费 者 健 康 及 影 响 动 物 性 产 品 的 出 口 贸 易, 因 此, 世 界 各 国 近 年 来 加 强 了 QNs 在 动 物 性 食 品 中 的 残 留 监 控 前 人 研 究 进 展 在 检 测 QNs 残 留 的 标 准 方 法 中, 欧 盟 在 1994 年 发 布 了 检 测 环 丙 沙 星 和 恩 诺 沙 星 在 猪 肉 熏 肉 和 牛 肉 中 残 留 的 HPLC 方 法 [2], 中 国 在 2003 年 公 布 了 动 物 性 食 品 中 恩 诺 沙 星 和 环 丙 沙 星 残 留 检 测 方 法 噁 喹 酸 和 氟 甲 喹 在 鸡 组 织 和 鱼 组 织 的 残 留 检 测 方 法 高 效 液 相 色 谱 法 等 3 种 方 法 [3] [4] 在 常 规 分 析 方 面, 曾 振 灵 等 建 立 了 9 种 FQs 在 鸡 蛋 中 的 多 残 留 HPLC 检 测 方 法, 此 检 测 方 法 在 色 谱 条 件 的 筛 选 方 面 做 了 很 多 出 色 的 工 作, 但 只 能 检 测 恩 诺 沙 星 等 呈 两 性 的 FQs, 而 不 能 检 测 氟 甲 喹 等 [5] 呈 酸 性 QNs Yang 等 建 立 了 11 种 QNs 在 牛 奶 中 的 多 残 留 HPLC 检 测 方 法, 此 方 法 采 用 了 固 相 萃 取 净 化 样 品 曲 线 梯 度 洗 脱 和 波 长 变 化 等 技 术 手 段, 但 检 测 时 间 太 长 本 研 究 切 入 点 目 前, 在 国 内 专 门 研 究 鸡 蛋 中 QNs 的 多 残 留 检 测 方 法 少, 能 同 时 分 析 两 性 和 酸 性 QNs 的 方 法 还 未 见 报 道 拟 解 决 的 关 键 问 题 本 研 究 拟 建 立 中 国 兽 医 临 床 可 能 应 用 于 鸡 蛋 的 12 种 QNs 的 HPLC 残 留 检 测 方 法, 能 同 时 测 定 包 括 9 种 呈 两 性 的 药 物 [ 诺 氟 沙 星 (norfloxacin,nor) 氧 氟 沙 星 (ofloxacin,ofl) 培 氟 沙 星 (pefloxacin,pef) 环 丙 沙 星 (ciprofloxacin, CIP ) 洛 美 沙 星 (lomefloxacin,lom) 达 氟 沙 星 (danofloxacin, DAN) 恩 诺 沙 星 (enrofloxacin,enr) 沙 拉 沙 星 (sarafloxacin,sar) 二 氟 沙 星 (difloxacin,dif)] 和 3 种 呈 酸 性 药 物 [ 噁 喹 酸 (oxolinic acid,oxo) 萘 啶 酸 (nalidixic acid,nal) 氟 甲 喹 (flumequine, FLU)], 所 建 立 方 法 要 具 有 简 便 快 速 使 用 有 机 溶 剂 少 适 用 范 围 广, 适 合 大 量 样 品 的 筛 选 和 定 量 检 测, 为 中 国 的 兽 药 残 留 监 控 工 作 服 务 1 材 料 与 方 法 1.1 试 剂 对 照 品 : 盐 酸 环 丙 沙 星 甲 磺 酸 培 氟 沙 星 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星, 中 国 兽 医 药 品 监 察 所 ; 甲 磺 酸 达 氟 沙 星, 广 东 燕 塘 兽 药 有 限 公 司 ; 洛 美 沙 星, 中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ; 盐 酸 二 氟 沙 星, 广 州 惠 华 动 物 保 健 品 有 限 公 司 ; 噁 喹 酸 萘 啶 酸 和 氟 甲 喹,Sigma 公 司 乙 腈 为 色 谱 纯 ; 水 为 符 合 GB/T 6682 规 定 的 二 级 水 ; 柠 檬 酸 乙 酸 铵 三 乙 胺 乙 腈 甲 醇 三 氯 乙 酸 (TCA) 磷 酸 二 氢 钠 磷 酸 氢 二 钠 均 为 分 析 纯 1.2 设 备 高 效 液 相 色 谱 仪 :Waters 2695 分 离 系 统 在 线 负 压 脱 气 机 2475 荧 光 检 测 器 自 动 进 样 器 柱 温 箱, Empower 色 谱 工 作 站, 美 国 Waters 电 子 分 析 天 平 : AE160 型, 瑞 士 Mettler; 离 心 机 :Universal-16 型, 德 国 Hettich,5415D 型, 德 国 Eppendorf 组 织 匀 浆 机 超 声 波 洗 涤 仪 :HS10260D 型, 天 津 市 东 科 仪 器 设 备 有 限 公 司 旋 涡 混 合 仪 :MSI 型, 马 来 西 亚 IKA 多 功 能 振 荡 器 :HS250 Basic 型, 德 国 IKA 氮 气 浓 缩 仪 :TurboVap LV 型, 配 备 5 ml 20 ml 玻 璃 试 管, 美 国 Zymark 可 调 微 量 移 液 器 :Eppendorf Research 型, 德 国 Eppendorf 负 压 固 相 萃 取 装 置 : 配 备 真 空 泵, 美 国 Waters 反 相 聚 合 物 SPE 柱 :Strata-X,60 mg/3 ml, Phenomenex 1.3 试 液 单 药 标 准 贮 备 液 用 0.5 ml 0.5 mol L -1 NaOH 溶 解 对 照 品, 甲 醇 定 容 至 10 ml, 各 药 物 的 浓 度 为 1 mg ml -1 使 用 期 为 6 个 月 以 内 混 合 药 物 标 准 中 间 工 作 液 取 达 氟 沙 星 标 准 贮 备 液 4.0 ml, 用 甲 醇 定 容 到 10 ml 成 浓 度 为 400 μg ml -1 分 别 取 达 氟 沙 星 溶 液 (400 μg ml -1 ) 和 其 它 11 种 单 药 标 准 贮 备 液 (1 000 μg ml -1 ) 各 40 μl, 以 甲 醇 定 容 至 10 ml, 即 成 8 MRL 10 的 混 合 标 准 工 作 液 置 4 保 存, 使 用 期 为 1 个 月 以 内 混 合 药 物 系 列 标 准 工 作 液 ( 10) 按 2 倍 稀 释 法 配 制 10 倍 浓 度 混 合 药 物 系 列 标 准 工 作 液 :8 MRL 4 MRL 2 MRL MRL 1/2 MRL 和 1/4 MRL 样 品 提 取 液 含 三 氯 乙 酸 (TCA)10%(m/v) 和 乙 腈 20%(v/v) 的 水 溶 液 PBS 缓 冲 液 称 取 NaH 2 PO 4 2H 2 O g 和 Na 2 HPO 4 12H 2 O g, 用 蒸 馏 水 定 容 至 1 L

3 8 期 廖 兰 等 : 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 样 品 淋 洗 液 10%(v/v) 甲 醇 - 水 溶 液 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液 称 取 g 柠 檬 酸 和 g 乙 酸 铵, 用 纯 净 水 定 容 至 1 L, 加 三 乙 胺 1 ml,0.45 μm 过 滤, 为 流 动 相 的 水 相 流 动 相 量 取 色 谱 纯 乙 腈 10 ml, 用 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液 定 容 至 100 ml 1.4 样 品 前 处 理 过 程 试 样 的 制 备 取 鸡 蛋 3~5 枚, 去 蛋 壳, 食 品 均 质 器 处 理 3 min -20 以 下 保 存 备 用 提 取 样 品 室 温 解 冻, 称 样 (2.0±0.01)g, 加 PBS 缓 冲 液 4.0 ml, 涡 旋 30 s 加 样 品 提 取 液 10 ml, 组 织 匀 浆 机 r/min 匀 浆 3 min, 另 用 5 ml 提 取 液 洗 刀 头 和 匀 浆 杯, 合 并 样 液, 涡 旋 30 s; 超 声 处 理 5 min;8 000 g 离 心 6 min; 样 液 用 10 ml 蒸 馏 水 稀 释 后 供 SPE 净 化 SPE 净 化 将 反 相 聚 合 物 SPE 柱 (Strata-X) 以 3 ml 甲 醇 活 化,3 ml 蒸 馏 水 平 衡 ; 将 样 品 液 加 入 SPE 柱 上 接 的 贮 液 库 中, 过 柱 流 速 约 为 1~2 ml min -1 ; 样 品 淋 洗 液 3 ml 淋 洗, 抽 干 ; 甲 醇 3 ml 洗 脱, 抽 干 洗 脱 液 于 60~70 氮 气 ( 或 者 空 气 ) 吹 干, 用 μl 流 动 相 溶 解 残 留 物, 涡 旋 混 匀, g 离 心 6 min, 上 清 液 供 HPLC 测 定 1.5 测 定 色 谱 柱 :C 18 ( 封 尾 ),250 mm 4.6 mm(i.d), 粒 径 5 μm, 大 连 伊 利 特 分 析 仪 器 有 限 公 司 保 护 柱 : C 18,4 mm 3.0 mm(i.d),phenomenex 柱 温 :50 进 样 量 :40 μl 流 动 相 A 液 为 乙 腈 B 液 为 柠 檬 酸 / 乙 酸 铵 缓 冲 液,A 液 的 变 化 为 :0~11 min,9%;11~ 20 min,9%~29%;20~25 min,29%~37%;25.01 min, 9% 流 速 2 ml min -1 荧 光 检 测 器 检 测 波 长 :9 种 FQs(NOR OFL CIP PEF LOM DAN ENR DAR 和 DIF)Ex=278 nm,em=465 nm;3 种 QNs(FLU NAL 和 OXO) Ex=312 nm,em=366 nm 波 长 变 化 的 时 间 在 DIF 和 OXO 之 间, 不 同 的 试 验 条 件 下 保 留 时 间 可 能 会 发 生 变 化, 测 定 前 应 预 测 保 留 时 间 1.6 校 正 曲 线 和 线 性 范 围 称 取 (2.0±0.01)g 空 白 鸡 蛋 试 样, 加 系 列 混 合 标 准 工 作 液 (1.3.3)200 μl, 按 1.4 方 法 进 行 样 品 前 处 理 和 按 1.5 方 法 测 定 添 加 1/4 MRL 1/2 MRL MRL 2 MRL 4 MRL 和 8 MRL 共 6 个 浓 度, 各 浓 度 水 平 包 含 3 个 重 复 样 品 将 3 个 重 复 样 品 的 色 谱 峰 面 积 的 平 均 值 (Y) 和 相 对 应 的 药 物 质 量 浓 度 (X) 进 行 线 性 回 归, 得 到 各 个 药 物 的 校 正 曲 线 1.7 回 收 率 测 定 和 变 异 系 数 测 定 将 10 浓 度 的 混 合 标 准 工 作 液 (1.3.3)200 μl 加 入 到 2.0 g 空 白 鸡 蛋 中, 按 方 法 1.4 进 行 样 品 处 理 和 1.5 分 析, 测 定 1/2 MRL MRL 和 2 MRL 共 3 个 浓 度 水 平, 每 一 添 加 水 平 包 括 6 个 重 复 样 品 ; 同 时 测 定 相 同 浓 度 的 标 准 液 ( 取 10 浓 度 的 混 合 标 准 工 作 液 200 μl, 加 800 μl 流 动 相, 混 匀 ) 以 相 应 水 平 的 标 准 液 为 校 正 点, 用 单 点 校 正 的 方 法 以 EMPOWER 工 作 站 处 理 得 到 添 加 样 品 的 实 测 浓 度 批 内 变 异 系 数 为 各 个 添 加 水 平 的 6 个 重 复 样 品 (n=6); 批 间 变 异 系 数 为 各 个 添 加 水 平 在 不 同 的 日 期 共 做 3 个 批 次 的 所 有 重 复 样 品 (n=18) 不 同 批 次 时 间 间 隔 为 1 d 或 1 d 以 上, 可 能 由 不 同 的 操 作 者 试 验 1.8 灵 敏 度 测 定 计 算 回 收 率 测 定 的 最 低 质 量 浓 度 (1/4 MRL) 的 18 个 添 加 样 品 的 HPLC 色 谱 图 的 信 号 / 噪 声 比 (S/N) 的 平 均 值, 计 算 检 测 限 (LOD)=3 S/N 和 定 量 限 (LOQ) =10 S/N 2 结 果 与 分 析 2.1 色 谱 图 空 白 鸡 蛋 样 品 没 有 干 扰, 结 果 见 图 1 1/2 MRL 标 样 和 添 加 于 空 白 鸡 蛋 样 品 的 HPLC-FLD 的 色 谱 图 分 别 见 图 2 和 图 3 12 种 药 物 的 保 留 时 间 (min) 为 : NOR 8.30 OFL 8.99 CIP 9.62 PEF LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU 22.72, 所 有 药 物 均 达 到 了 基 线 分 离, 分 离 度 好 图 1 空 白 鸡 蛋 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 1 Chromatogram of blank egg by HPLC 2.2 标 准 曲 线 和 线 性 范 围 添 加 1/4 MRL 1/2 MRL MRL 2 MRL 4 MRL 和 8 MRL 共 6 个 浓 度 水 平, 各 水 平 包 含 3 个 重 复 样 品 结 果 见 表 1 NOR OFL CIP PEF LOM ENR

4 2422 中 国 农 业 科 学 41 卷 各 药 物 浓 度 分 别 为 25 μg kg -1 (NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU) 和 10 μg kg -1 (DAN) 下 同 Concentritions of 12 QNs are 25 μg kg -1 (NOR, OFL, CIP, PEF, LOM, ENR, SAR, DIF, OXO, FLU) and 10 μg kg -1 (DAN) respectively. The same as below 图 2 12 种 QNs 标 样 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 2 Chromatogram of 12 QNs stand solution by HPLC SAR DIF OXO NAL 和 FLU 11 种 药 物 的 线 性 范 围 定 为 12.5~400 μg kg -1,DAN 的 线 性 范 围 定 为 5.0~ 160 μg kg -1 在 上 述 的 线 性 范 围 内, 添 加 6 个 浓 度 测 得 的 校 正 曲 线 的 相 关 系 数 除 FLU 为 以 外, 其 它 11 种 QNs 均 大 于 0.995, 表 明 线 性 关 系 良 好 2.3 回 收 率 与 变 异 系 数 鸡 蛋 添 加 1/2 MRL MRL 2 MRL 共 3 个 浓 度 药 物 的 3 批 回 收 率 和 变 异 系 数 见 表 2 回 收 率 除 个 别 药 物 较 低 (NAL 为 52%) 外, 其 它 11 种 均 大 于 70% 批 内 变 异 系 数 <8%, 批 间 变 异 系 数 除 个 别 药 物 较 大 外 ( 如 FLU 的 3 个 浓 度 分 别 为 18.0% 14.9% 10.6%, ENR 在 1/2 MRL 为 18.8%), 其 它 各 药 物 和 各 浓 度 的 变 异 系 数 均 13% 表 2 鸡 蛋 中 添 加 12 种 QNs 的 回 收 率 和 变 异 系 数 Table 2 Recoveries and CVs of 12 QNs spiked in egg 药 物 QNs 回 收 率 Recovery (%) 变 异 系 数 CV (%) 1/2 MRL MRL 2 MRL 1/2 MRL MRL 2 MRL NOR OFL CIP 图 3 空 白 鸡 蛋 添 加 12 种 QNs 标 样 的 HPLC 色 谱 图 Fig. 3 Chromatogram of egg spiked 12 QNs 1/2 MRL stand by HPLC 表 1 鸡 蛋 添 加 12 种 QNs 的 校 正 曲 线 Table 1 Calibration curves of 12 QNs spiked in egg 药 物 QNs 添 加 浓 度 Ranges of conc. 回 归 方 程 Regression equations 相 关 系 数 r (μg kg -1 ) NOR 12.5~400 Y = X OFL 12.5~400 Y = X CIP 12.5~400 Y = X PEF 12.5~400 Y = X LOM 12.5~400 Y = X DAN 5.0~160 Y = X ENR 12.5~400 Y = X SAR 12.5~400 Y = X DIF 12.5~400 Y = X OXO 12.5~400 Y = X NAL 12.5~400 Y = X FLU 12.5~400 Y = X X 为 药 物 浓 度 ;Y 为 峰 面 积 X is concentration of QNs; Y is peak area PEF LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU n= 灵 敏 度 鸡 蛋 中 12 种 QNs 的 LOD 和 LOQ 见 表 3,LOD 为 0.2~4.1 μg kg -1,LOQ 为 0.9~13.5 μg kg -1 DAN 灵 敏 度 最 高 (LOD=0.2 μg kg -1,LOQ=0.9 μg kg -1 ), 氧 氟 沙 星 的 灵 敏 度 最 低 (LOD=4.1 μg kg -1,LOQ=13.5 μg kg -1 ), 均 能 达 到 残 留 分 析 的 要 求 3 讨 论 3.1 药 物 的 提 取 方 法 鸡 蛋 中 含 有 大 量 的 水 分 蛋 白 质 和 卵 磷 脂, 因 此 样 品 的 提 取 和 净 化 的 主 要 目 的 是 沉 淀 蛋 白 质 和 去 脂

5 8 期 廖 兰 等 : 检 测 鸡 蛋 中 12 种 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 的 HPLC 方 法 2423 表 3 鸡 蛋 中 添 加 12 种 QNs 的 灵 敏 度 Table 3 LODs and LOQs for 12 QNs spiked in egg 药 物 QNs 保 留 时 间 Ret. time(min) LOD (μg kg -1 ) LOQ (μg kg -1 ) NOR OFL CIP PEF LOM DAN ENR SAR DIF OXO NAL FLU 肪 沉 淀 蛋 白 常 用 的 方 法 有 使 用 乙 醇 甲 醇 和 乙 腈 等 有 机 溶 剂, 或 者 用 乙 酸 甲 酸 磷 酸 和 三 氯 乙 酸 等 酸 性 的 溶 液, 在 建 立 本 方 法 的 过 程 中, 进 行 过 以 上 各 种 沉 淀 蛋 白 方 法 的 比 较, 若 用 有 机 溶 剂 提 取, 虽 然 回 收 率 较 好, 但 一 般 都 需 要 先 挥 发 掉 有 机 溶 剂 后 才 能 进 行 SPE 等 净 化 处 理, 增 加 了 操 作 的 复 杂 性, 同 时, 大 量 有 机 溶 剂 的 使 用 不 利 于 废 液 的 处 理 及 环 境 保 护 在 比 较 各 种 酸 对 蛋 白 的 沉 淀 过 程 中, 三 氯 乙 酸 的 效 果 明 显 较 乙 酸 甲 酸 和 磷 酸 的 效 果 好, 而 加 入 了 柠 檬 酸 后, 沉 淀 蛋 白 的 效 果 很 差, 溶 液 呈 混 浊 状 态, 很 难 进 行 净 [6] 化 Posyniak 等 研 究 表 明 提 取 液 中 乙 腈 的 比 例 与 样 品 的 回 收 率 及 提 取 的 杂 质 的 量 有 较 大 的 关 系, 在 鸡 肝 和 鸡 肉 提 取 时 用 10% 三 氯 乙 酸 : 乙 腈 (8:2,v/v) 混 合 液, 效 果 最 为 理 想 笔 者 的 研 究 证 实 了 此 提 取 溶 剂 也 适 合 对 鸡 蛋 的 处 理, 为 了 不 影 响 在 SPE 柱 上 的 保 留, 样 液 要 用 水 或 者 PBS 液 稀 释 到 乙 腈 的 含 量 低 于 10% 在 加 入 10% 三 氯 乙 酸 : 乙 腈 (8:2,v/v) 混 合 液 提 取 之 前, 加 入 2 倍 量 的 ph 7.4 PBS 液 的 目 的 是 调 节 ph 和 防 止 加 入 提 取 液 后 蛋 白 质 迅 速 变 性 而 形 成 大 块 的 沉 淀 为 了 提 取 更 为 充 分, 采 用 了 先 高 速 匀 浆 再 用 超 声 波 处 理 的 提 取 过 程 3.2 净 化 方 法 在 QNs 残 留 分 析 方 法 中, 常 用 的 净 化 方 法 包 括 液 - 液 萃 取 (liquid-liquid extraction,lle) 固 相 萃 取 (solid phase extraction, SPE ) 免 疫 亲 和 层 析, 据 [7] Hernández-Arteseros 等 的 统 计, 在 分 析 QNs 残 留 的 净 化 方 法 中,LLE 占 34% SPE 占 26% LLE+SPE 占 8%, 无 特 定 净 化 方 法 占 21% LLE 为 传 统 的 净 化 方 法, 一 般 需 要 消 耗 大 量 的 有 机 溶 剂, 净 化 的 选 择 性 差 ; 免 疫 亲 和 层 析 的 选 择 性 很 高, 但 要 获 得 理 想 的 抗 体 难 度 很 大, 抗 体 性 质 的 稳 定 性 和 检 测 成 本 使 此 类 净 化 方 法 应 用 受 到 很 大 的 限 制 SPE 方 法 具 有 简 便 快 速 选 择 性 较 强 使 用 有 机 溶 剂 少 等 优 点 Strata-X SPE 柱 的 填 料 是 新 型 的 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 (styrene divinylbenzene) 聚 合 物, 和 传 统 的 C 18 柱 相 比, 具 有 高 保 留 效 率, 柱 容 量 可 达 10% 填 料, 少 量 的 填 料 就 可 以 净 化 大 量 的 样 品, 流 速 快 且 均 匀, 操 作 简 便 和 能 重 复 使 用 等 优 点 3.3 测 定 方 法 HPLC 是 分 析 QNs 应 用 最 为 广 泛 的 分 析 方 法, 其 检 测 器 通 常 使 用 的 是 紫 外 检 测 器 (UVD, 包 括 二 极 管 阵 列 检 测 器 ) 和 荧 光 检 测 器 (FLD), 因 为 FLD 较 UVD 有 更 高 的 选 择 性 和 灵 敏 度, 所 以 后 者 应 用 更 多 [8] 但 有 个 别 化 合 物 如 麻 保 沙 星 (marbofloxacin) 和 伊 诺 沙 星 (enofloxacin) 用 UVD 检 测 更 为 灵 敏 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 方 法 作 为 此 类 药 物 的 确 证 有 较 多 研 究 报 道 [9~16] 本 文 所 检 测 的 12 种 QNs 包 括 9 种 呈 两 性 的 FQs(NOR,OFL,PEF,CIP,LOM,DAN, ENR,SAR,DIF) 和 3 种 呈 酸 性 的 QNs(OXO,NAL, FLU), 这 两 类 化 合 物 的 检 测 波 长 有 较 大 的 差 异, 因 此 采 用 了 程 序 波 长 变 化 来 同 时 检 测 该 两 类 药 物,FQs 为 Ex=278 nm,em=465 nm;qns 为 Ex=312 nm, Em=366 nm 为 了 能 有 效 分 离 12 种 药 物, 采 用 了 等 度 与 梯 度 相 结 合 的 洗 脱 方 式 3.4 灵 敏 度 在 中 国, 鸡 蛋 中 只 规 定 了 OXO 的 MRL 为 50 μg kg -1 [17], 其 它 QNs 的 MRL 参 照 OXO 的 标 准 暂 定 为 50 μg kg -1,DAN 的 荧 光 反 应 性 很 强, 灵 敏 度 更 高, 其 MRL 暂 定 为 20 μg kg -1 提 高 灵 敏 度 的 措 施 有 : 样 品 分 析 量 为 2 g 而 上 机 前 定 容 为 1 ml, 相 当 于 样 品 浓 缩 了 2 倍 ; 采 用 高 效 的 梯 度 洗 脱 分 离, 提 高 柱 效 ; 进 样 量 为 40 μl 4 结 论 建 立 了 12 种 QNs 在 鸡 蛋 中 残 留 的 HPLC-FLD 分 析 方 法, 能 同 时 分 析 9 种 FQs 和 3 种 酸 性 的 QNs, 具 有 操 作 简 便 快 速 和 适 用 范 围 广 等 优 势 References [1] Appelbaum P C, Hunter P A. The fluoroquinolone antibactetials: past,

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