Microsoft Word - 13-渠诗慧.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - 13-渠诗慧.doc"

缎乾凤
4 years ago
Views:

第 9 卷第 9 期 Vol.9 No.9 2016 年 5 月 May 2016 乳腺炎奶牛整合素 α4β7 表达的检测渠诗慧 1, 王海霞 2, 刘辉 3, 刘文博 4, 张乃生 (1. 吉林大学动物医学学院, 长春 130062; 2. 黑龙江省大庆市畜牧兽医局, 黑龙江大庆 163000; 3. 黑龙江省大庆市动物卫生监督所, 黑龙江大庆 163000; 4.

1 第 9 卷第 9 期 Vol.9 No 年 5 月 May 2016 乳腺炎奶牛整合素 α4β7 表达的检测渠诗慧 1, 王海霞 2, 刘辉 3, 刘文博 4, 张乃生 (1. 吉林大学动物医学学院, 长春 ; 2. 黑龙江省大庆市畜牧兽医局, 黑龙江大庆 ; 3. 黑龙江省大庆市动物卫生监督所, 黑龙江大庆 ; 4. 黑龙江省大庆市红岗区杏树岗镇人民政府, 黑龙江大庆 ) 摘要 : 奶牛乳腺炎是严重危害奶牛养殖业的重大疾病之一, 在全球造成了重大的经济损失乳腺是奶牛的重要器官, 其中的淋巴细胞不仅能够对抗病原菌侵袭, 还能通过乳汁给幼畜提供被动免疫有研究表明, 淋巴细胞的迁移具有组织特异性, 其依赖于细胞表面和血管内皮上粘附分子的表达为研究淋巴细胞归巢受体 α4β7 在健康及乳腺炎奶牛中的表达差异, 分别取健康及乳腺炎奶牛的血液和乳汁, 利用流式细胞术对其中表达 α4β7 的阳性淋巴细胞进行测定结果表明, 两组奶牛的血液和乳汁中淋巴细胞表面均表达 α4β7, 乳腺炎奶牛血液及乳汁中表达 α4β7 细胞的阳性率高于健康组关键词 : 临床兽医学 ; 乳腺炎 ; 淋巴细胞 ;α4β7 中图分类号 :S853.3 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) The detection of integrin α4β7 in mastitis cow QU Shihui 1, WANG Haixia 2, LIU Hui 3, LIU Wenbo 4, ZHANG Naisheng 1 (1. College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun , China; 2. Daqing Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Daqing, Heilongjiang , China; 3. Daqing Honggang District Animal Health Supervision, Daqing, Heilongjiang , China; 4. People s Government of Daqing Honggang District Xingshugang Town, Daqing, Heilongjiang , China) Abstract: Bovine mastitis is one of the major diseases which cause serious economic loss to the dairy farming worldwide. Mammary gland is an important organ to the cow, the lymphocyte can not only fight against pathogens, but also provide assistance from a passive immunization children through breast milk. Research has shown that the migration of lymphocyte has tissue specificity, which depends on the expression of adhesion molecules on the vascular endothelium and cell surface. To further research the differential expression of lymphocytes homing receptor α4β7 in healthy and mastitis bovine, we took blood and milk from healthy and mastitis bovine, respectively, and used flow cytometry to detect lymphocytes which positive express α4β7. The results showed that α4β7 was expressed on lymphocytes both in blood and milk from healthy and mastitis bovine, and the positive rate in mastitis bovine was higher than the healthy bovine. Key words: clinical veterinary medicine; mastitis; lymphocytes; α4β7 0 引言乳腺是哺乳动物所特有的一种皮肤腺, 被视为公共黏膜免疫系统的成员之一, 其特殊的组织学构造在某种程度上决定了它的免疫功能 [1~2] 然而, 免疫系统能否发生相应的应答反应, 在许多情况下又取 1* 基金项目 : 高等学校博士学科点专项科研基金 ( ) 作者简介 : 渠诗慧 (1994 ), 女, 本科生, 主要研究方向 : 奶牛乳腺炎通信联系人 : 张乃生, 教授, 主要研究方向 : 奶牛乳腺炎防治. zhangns@jlu.edu.cn

2 第 9 卷第 9 期 2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文 956 决于机体对淋巴细胞归巢的调控 [3] 近几年已发现整合素分子对淋巴细胞的归巢与定居起到重要作用,α4β7 就是其中之一, 主要表达于淋巴细胞表面, 与相应配体结合后介导淋巴细胞向特定部位的迁移并参与免疫应答 [4~5] 据报道, 乳腺中分泌 IgA 的浆细胞主要来自胃肠道相关淋巴组织 [6] [7] 王家鑫等通过首次对奶牛乳腺肥大细胞的染色观察揭示了乳腺的黏膜免疫学属性然而, 有关奶牛乳腺黏膜免疫特性的深入研究却一直未见报道本实验应用流式细胞仪技术, 初步检测正常健康奶牛和患临床型乳腺炎奶牛的乳汁及血液中表达 α4β7 的细胞的阳性率, 为今后的研究工作奠定基础 1 材料 1.1 主要试剂牛淋巴细胞分离液购于 TBD 公司 ;Rat anti-bovine α4 和 Rabbit anti-bovine β7 多克隆抗体为先前实验室制备 ;Goat anti-rat IgG-FITC 和 Goat anti-rabbit IgG-PE 抗体购于 BD 公司 ;EDTA 多聚甲醛等其他常规试剂购于北京化工有限公司 1.2 主要仪器流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 ); 水平离心机 ( 上海天美 ) 1.3 实验动物选取患临床型乳腺炎 3~10 d 的奶牛 5 头, 患病乳区表现出红肿热痛等炎性症状, 乳汁中出现絮状物, 乳汁分泌不畅健康奶牛 3 头, 乳中体细胞数 (somatic cell count,scc) 小于 20 万 /ml. 所选奶牛胎次产奶量均相近, 实验过程中正常饲喂, 不采取任何方式的治疗编号 : 临床型乳腺炎患牛为 A B C D E; 健康奶牛为 a b c. 2 方法 2.1 样品的采集与处理血液样品乳下静脉采集新鲜血液 10 ml, 加入 l ml EDTA 抗凝剂混匀将 2 ml 抗凝血与 2 ml D-Hank s 液混匀, 缓慢加到 4 ml 淋巴细胞分离液液面上,18,1 500~2 000 r/min 水平离心 20 min. 收集中间白膜层, 用 4 ml D-Hank s 液洗涤,2 000 r/min 离心 10 min, 弃上清重复洗涤一次加入 l ml PBS 重悬细胞, 调整细胞终浓度为 /ml 乳汁样品取乳汁 5 ml 加入 5 ml D-Hank s 液混匀,2 000 r/min 离心 20 min. 吸去脂肪和上清, 用适量 D-Hank s 悬浮沉淀,2 000 r/min 离心 20 min, 弃上清加入 l ml PBS 重悬细胞, 调整终浓度至 /ml. 2.2 样品的流式细胞仪检测取 1.5 ml 的离心管, 加入 100 μl 上述制备的细胞悬液, 加入适量浓度自制的 Rat anti-bovine α4 和 Rabbit anti-bovine β7 多克隆抗体作为一抗,4 冰箱中避光孵育 20 min. 以 PBS 作空白对照, 以未免疫的大鼠和兔子血清作阴性对照孵育完成后, 加入 l ml PBS 缓冲液, r/min 离心 5 min, 弃上清重复洗涤 2 次加入二抗 Goat anti-rat IgG-FITC 和 Goat anti-rabbit IgG-PE 抗体,4 冰箱中避光孵育 20 min. 洗涤细胞 2 次加入 500 μl PBS 重悬细胞, 流式细胞仪检测 ; 或用 1% 的多聚甲醛固定液重

结果显示健康组奶牛 α4β7 的阳性率平均值为 6.00±1.02 % 患临床型乳腺炎的奶牛 α4β7 的阳性率平均值为 11.00±1.90 % 两者比较差异显著 P<0.05 3.

3 Vol.9 No.9 May 2016 渠诗慧等乳腺炎奶牛整合素α4β7 表达的检测 957 悬细胞 4 避光保存待检 2.3 数据处理所有数据以平均数±标准差 Means±SD 表示并应用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析 3 结果 3.1 血液中表达 α4β7 的淋巴细胞的阳性率在门内收集个淋巴细胞如图 1 所示血液中淋巴细胞的检测如图 2 所示结果以二维点图表示纵坐标为 α4 参数横坐标为 β7 参数观察淋巴细胞表面表达 α4 和 β7 的双阳区域 Q2. 结果显示健康组奶牛 α4β7 的阳性率平均值为 6.00±1.02 % 患临床型乳腺炎的奶牛 α4β7 的阳性率平均值为 11.00±1.90 % 两者比较差异显著 P< 乳汁中表达 α4β7 的淋巴细胞的阳性率乳汁中淋巴细胞的检测如图 3 所示结果以二维点图表示观察淋巴细胞表面表达 α4 和 β7 的双阳区域 Q2. 结果显示健康组奶牛 α4β7 的阳性率平均值为 12.00±2.07 % 患临床型乳腺炎的奶牛 α4β7 的阳性率平均值为 18.00±2.58 % 两者比较差异显著 P<0.05 图1 Fig. 1 淋巴细胞收集区 Collected region of lymphocytes

4 第9 卷第9 期 2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文注 a~h 依次为临床型乳腺患牛 A B C D E 下同图2 Fig. 2 血液中表达 α4β7 的淋巴细胞的阳性率 Positive rate of lymphocytes that express α4β7 in blood a c 健康奶牛 d h 临床型乳腺炎患牛 a-c-healthy cows; d-h-cows suffered from clinical mastitis 958

5 Vol.9 No.9 May 2016 渠诗慧等 : 乳腺炎奶牛整合素 α4β7 表达的检测 959 图 3 乳汁中表达 α4β7 的淋巴细胞的阳性率 Fig. 3 Positive rate of lymphocytes that express α4β7 in milk a~c 健康奶牛 ;d~h 临床型乳腺炎患牛 a-c-healthy cows; d-h-cows suffered from clinical mastitis 4 结论 BIENENSTOCK 在提出公共黏膜免疫系统这一概念时, 就将乳腺归为该系统的成员之一黏膜免疫应答的效应成分主要是 B 细胞分泌的 IgA. 据报道乳腺中分泌 IgA 的浆细胞主要是来自胃肠道相关淋巴组织, 胃肠道发生炎症时淋巴细胞表面的 α4β7 会发生相应的变化, 以调节淋巴细胞向肠道的归巢并参与应答反应 α4β7 作为整合素家族的重要成员, 已有大量研究证实,α4β7 介导淋巴细胞向特定部位的迁移归巢并参与免疫应答反应 [8] 患乳腺炎时,α4β7 在淋巴细胞上的表达情况, 大多数是以老鼠为实验模型进行研究的本文检测了奶牛患乳腺炎时 α4β7 的表达, 结果表明奶牛不论是生理还是病理状态下, 其血液及乳汁中淋巴细胞的表面都表达 α4β7, 只是表达量多少的差异 ; 患临床型乳腺炎的奶牛血液及乳汁中表达 α4β7 细胞的阳性率高于健康组奶牛 (P<0.05) 本文通过流式细胞技术测定了健康及患乳腺炎奶牛血液及乳汁中表达 α4β7 的淋巴细胞阳性率结果表明, 患临床型乳腺炎的奶牛血液乳汁中淋巴细胞表达 α4β7 的阳性率平均值均显著高于健康组 (P<0.05) [ 参考文献 ] (References) [1] McDERMOTT M R, BIENENSTOCK J. Evidence for a common mucosal immunologic system I. Migration of B immunoblasts into intestinal, respiratory, and genital tissues[j]. The Journal of Immunology, 1979, 122(5): [2] KOHYAMA M, SAIJYO K, HAYASIDA M, et al. Direct activation of human CD8 + cytotoxic T lymphocytes by Interleukin-18[J]. Japanese Journal of Cancer Research, 1998, 89(10): [3] 王晓蕾, 赵旭东, 曹筱梅, 等. 淋巴细胞归巢及其分子基础 [J]. 生命的化学,1998,18(5): WANG X L, ZHAO X D, CAO X M, et al. Lymphocyte homing and its molecular basis[j]. Chemistry of Life, 1998, 18(5): (in Chinese) [4] 常凯凯, 姚晓英. 趋化因子与黏膜淋巴细胞归巢 [J]. 细胞与分子免疫学杂志,2011,27(3): ,355. CHANG K K, YAO X Y. Chemokines and mucosal lymphocyte homing[j]. Chinese Journal of Cellular and Molecular

6 第 9 卷第 9 期 2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文 960 Immunology, 2011, 27(3): , 355. (in Chinese) [5] 康伟芳, 蒋就喜, 胡婷婷, 等. 整合素 α4β7 在肠道表达的意义 [J]. 中国现代医学杂志,2014,24(8): KANG W F, JIANG J X, HU T T, et al. Significance of integrin α4β7 expression in intestine[j]. China Journal of Modern Medicine, 2014, 24(8): (in Chinese) [6] 杨建军, 秦环龙. 淋巴细胞归巢及黏附分子在肠免疫屏障中的作用 [J]. 肠外与肠内营养,2006,13(1):44-47,50. YANG J J, QIN H L. The effect of lymphocyte homing to intestine and adhension molecules to intestinal immunologic barrier[j]. Parenteral & Enteral Nutrition, 2006, 13(1): 44-47, 50. (in Chinese) [7] 王家鑫, 陈耀星, 赵香汝, 等. 奶牛乳腺肥大细胞的粘膜免疫学特征 [J]. 上海免疫学杂志,2001,21(3): WANG J X, CHEN Y X, ZHAO X R, et al. Mucosal immunologic properties of mast cells in mammary gland of dairy cow[j]. Shanghai Journal of Immunology, 2001, 21(3): (in Chinese) [8] NISHIMURA T. Expression of potential lymphocyte trafficking mediator molecules in the mammary gland[j]. Veterinary Research, 2003, 34(1): 3-10.