2008,28(7) 徐盛玉等 : 卵母细胞质量评定的方法探讨 117 恢复减数分裂, 光镜下可见细胞核膜破裂, 核仁消失, 核内物质与核质混合, 此过程即为生发泡破裂 (GVBD) 卵母细胞在成熟发育过程期间, 其染色体 ( 二倍体 ) 经历了中期 I 后期 I 和末期 I, 排出第 1 极体后停

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(7):116~121 檪檪综述檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪卵母细胞质量评定方法徐盛玉吴德王定越 ( 四川农业大学动物营养研究所四川省动物营养与饲料工程重点实验室雅安 ) 摘要在辅助生殖领域及繁殖科学中常涉及对卵母细胞质量的评定, 据卵母细胞发育过程中的结构变化和生化变化, 卵母细胞的质量评定主要涵盖对卵母细胞形态和成熟度的考察从非侵袭性技术和侵袭性技术分析的角度论述了卵母细胞质量评定的方法, 为合理评价卵母细胞质量提供了多种有效途径关键词卵母细胞非侵袭性技术侵袭性技术质量评定中图分类号 Q2 在合子形成过程中, 精子和卵细胞都提供了遗传物质除此之外, 卵细胞还为早期胚胎的发育提供了大量必需的营养物质因而, 作为卵细胞的发生基础, 卵母细胞质量的高低直接关系到合子发育甚至是新生个体一生的命运大量的试验研究也表明, 卵母细胞质量的好坏将直接影响卵细胞的受精率受精卵的卵裂率早期胚胎的存活妊娠的建立和维持胎儿的发育, 甚至成年后的健康问题因此, 选择高质量卵母细胞对于辅助生殖及体细胞克隆等技术来说至关重要, 而如何来评价卵母细胞的质量则成了辅助生殖技术领域及繁殖科学面临的一个关键问题之一卵母细胞质量的评定工作各国学者的方法标准不一, 不利于进一步研究本文就卵母细胞的质量评定方法从非侵袭性技术和侵袭性技术分析的角度进行讨论, 旨在为卵母细胞质量的高效评定工作提供参考 1 卵母细胞发育及成熟过程中结构的变化卵母细胞质量的评定主要是分析卵母细胞的形态结构和其成熟度, 评定的基础是卵母细胞在生长发育过程中的结构变化和生化变化, 因此了解卵母细胞发收稿日期 : 修回日期 : 教育部创新团队计划 (IRT0555) 国家自然科学基金 ( ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :pig2pig@sina.com 育及成熟过程中超微结构的变化非常重要 1.1 卵母细胞质膜透明带与卵周隙由单层扁平颗粒细胞包围的卵母细胞, 质膜表面光滑并与颗粒细胞膜相贴, 之间有桥粒连接由立方颗粒细胞包围时, 卵质膜上开始出现短小的微绒毛当颗粒细胞变成两层时, 开始出现透明带, 微绒毛伸人透明带内卵泡腔出现时, 透明带增厚, 此时微绒毛多且长并垂直插入透明带内直径为 2mm 的牛卵泡和 0.5~1.0mm 的山羊卵泡中的卵母细胞, 透明带内的微绒毛开始缩短变粗, 并逐渐从透明带退出卵母细胞成熟后, 微绒毛则全部倒伏在卵的表面 [1,2] 卵母细胞第一次成熟分裂后, 排出第一极体, 卵细胞质收缩, 卵黄膜和透明带之间出现一个小的裂隙, 称卵周隙或围卵腔 1.2 细胞器的变化卵母细胞生长发育过程中细胞器的变化最为显著总的变化规律为 : 大多数细胞器最初分布于近核区, 随着卵母细胞的生长发育, 线粒体高尔基体粗面内质网皮质颗粒等细胞器不断丰富和增多, 并逐渐向皮质区迁移, 在细胞中央形成不含细胞器的透明区 [3,4] ; 卵母细胞成熟后, 除皮质颗粒外, 其他的细胞器又向卵子中央迁移, 最终高尔基体和内质网消失, 线粒体则分散在胞质中 [5~7] 1.3 细胞核的变化生发泡期 (GV 期 ) 卵母细胞, 在促性腺激素作用下

2 2008,28(7) 徐盛玉等 : 卵母细胞质量评定的方法探讨 117 恢复减数分裂, 光镜下可见细胞核膜破裂, 核仁消失, 核内物质与核质混合, 此过程即为生发泡破裂 (GVBD) 卵母细胞在成熟发育过程期间, 其染色体 ( 二倍体 ) 经历了中期 I 后期 I 和末期 I, 排出第 1 极体后停 [8] [2] 滞于第二次减数分裂中期 (MI) 研究牛和山羊发现, 从单层颗粒细胞包围的卵母细胞到早期有腔卵泡的卵母细胞, 核仁由颗粒性染色质丝的不规则缠绕 [2] 而逐渐形成网状结构, 其间有许多空泡羊卵泡直径为 0.5~1.6mm 时, 核仁中出现很多电子致密度较低的纤维中心, 此时的核仁由颗粒性染色质丝空泡及纤维中心组成,rRNA 和 hnrna 合成十分的活跃 (rrna 的合成场所在纤维中心, 核仁空泡则可能与核仁物质的运输和贮存有关 [9] ); 随后, 空泡消失, 核仁发生致密化核仁的致密化伴随着 rrna 合成的急剧下降, 使核仁由 RNA 的合成场所转变为 RNA 的贮存场所 [10,11] 核仁致密化的时间随动物不同而异, 如小鼠在卵泡腔形成之前发生核仁致密化, 猪则发生在早期有腔卵泡在卵母细胞的发育过程中, 核孔越来越明显, 密度增加, 且核周隙越来越难以分辨 [8] 2 非侵袭性技术对卵母细胞质量的评定非侵袭性技术也即无损分析技术, 通过观察卵母细胞的形态和其他不损害卵母细胞生物活性的方法进行判断, 由于不会影响卵母细胞的进一步发育, 因而很适合应用于辅助生殖等生物技术领域 2.1 卵巢重量和卵泡大小评价法卵巢和卵泡对卵母细胞的发育起着营养调控和支撑作用, 研究表明卵巢的大小与重量直接影响卵母细胞的质量和数量, 重量在 2.000~4.000g 的猪卵巢中能获得更多的 A 级卵母细胞 [12] 通过卵巢重量预测卵母细胞质量这种简单快捷的方法, 可提高卵母细胞的采集效率发育后期的卵母细胞浸润在卵泡液中, 不同阶段卵泡中卵泡液的成熟程度不同, 对卵母细胞成熟的影响存在差异将卵母细胞与来源于不同阶段卵泡的卵泡液共同培养, 结果显示, 较大卵泡卵泡液培养的卵母细胞成熟比例显著高于小卵泡卵泡液 [13] [14] Marchal 等研究猪卵泡大小对其卵母细胞减数分裂和体外受精后进一步发育能力的影响, 体外培养结果表明来自大卵泡 (>5mm) 和中型卵泡 (3~5mm) 卵母细胞的成熟度受精率及囊胚 [15] 率均显著高于小卵泡 (<3mm) Krisher 等认为卵泡的大小影响卵母细胞的质量可能与影响卵母细胞发育能力有关的 mrna 和蛋白的储存相关以上研究表明卵泡越大成熟度越高, 其中的卵母细胞质量越高 2.2 卵周隙第一极体的形态建立的评价方法卵母细胞成熟过程中经历两次减数分裂, 排出极体形成卵周隙极体的排出表明卵母细胞发育经历了正常的程序 ; 而卵周隙越大, 表明细胞质收缩越厉害, [16,17] 导致卵母细胞质量越差 Xia,Ebner 等在研究中将卵母细胞分级 I 级 : 卵周隙正常, 第一极体完整, 形状规则圆或椭圆, 表面光滑 ;I 级 : 卵周隙正常, 第一极体完整, 圆或椭圆, 表面粗糙 ; I 级 : 卵周隙正常, 第一极体破碎 ;IV 级 : 卵周隙过大, 第一极体巨大型 ;V 级 : 卵周隙过大, 第一极体破碎所以, 第一极体形态和卵周隙大小与卵母细胞的受精率和胚胎质量相关密切以上的研究结果表明,I 级卵母细胞体外受精率优质胚胎率种植率和临床妊娠率都显著或极显著高于其他各级形态的卵母细胞 [18] 说明根据卵周隙第一极体形态可有效地评价卵母细胞的质量 2.3 纺锤体形态观测法纺锤体是由极间微管染色体牵丝及区间牵丝排列组成的中部宽阔两极缩小的形如纺锤的结构细胞分裂过程中, 纺锤体对卵母细胞染色体的平衡运动分配和极体的排出有非常重要的作用纺锤体异常, 会导致异常的减数分裂, 所产生的不正常卵母细胞受精后可能产生异常胚胎 [19] 朱亮等应用 LC PolScope 纺锤体成像系统 ( 美国 SRI 公司生产 ) 观察人的成熟卵母细胞 ( 即有敌意极体存在的卵母细胞 ) 纺锤体存在的情况, 结果显示观测中有纺锤体的卵母细胞的正常受精率和良好胚胎形成率均明显高于无纺锤体的卵母细胞这提示, 成熟卵母细胞纺锤体的存在可以反映其质量的高低有相当一部分无纺锤体的卵母细胞本身存在染色体异常 [20] LC PolScope 纺锤体成像系统是一种能够对活体细胞纺锤体进行无毒无害的观测的技术此系统较以往研究卵母细胞纺锤体的技术而言突破了非侵袭性的观测这一难题 2.4 渗透压处理法质量不同的卵母细胞的渗透调节机能存在差异 [21], 因而可据此判断卵母细胞的质量 3% 蔗糖操作液 (3 % sucrose containing operation medium,3 SCOM) 处理小鼠 MI 期卵母细胞, 渗透压恢复后细胞形态也恢复的卵母细胞与未处理的卵母细胞进行 IVF ( 体外授精 ) 比较, 结果显示二者受精率和卵裂率差异

3 118 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 不显著 [22] [21,23] Wang 等在核移植的去核操作中采用 3SCOM 处理小鼠卵母细胞, 后经 IVF 和 ET, 已得到产仔说明使用 3SCOM 处理后的卵母细胞的进一步发育不受影响 [24] 周佳勃等利用 0.3mol/L 的蔗糖溶液处理排出第一极体的成熟卵母细胞, 发现体外成熟的山羊卵母 [21] 细胞在高渗液中呈现不同形态, 按 Wang 等的分类法分类并进行卵胞浆内单精子注射 (ICSI) 时, I 类卵的注射后存活率受精率和桑椹 / 囊胚率均高于 I I 类卵这说明体外成熟的卵母细胞即使排出了第一极体, 质量仍有很大差异 3SCOM 对卵母细胞具有高渗作用, 采用 3SCOM 对卵母细胞进行预处理, 不仅在形态上, 而且在功能上能区分具有不同渗透调节机能的卵母细胞运用渗透压处理法在辅助生殖过程中不仅能有效的评价卵母细胞的质量, 而且可以直接淘汰质量差的卵母细胞 2.5 体外受精 (IVF) 体外胚胎培养评定法卵母细胞质量的好坏直接影响卵母细胞的受精率卵裂率早期胚胎的存活妊娠的建立和维持胎儿的发育, 因此这些指标是考察卵母细胞质量的可靠依据 Grazul Bilska 等 [25], 通过体外受精并培养 8d 后观察绵羊胚胎的发育情况, 考察不同母体营养水平对卵 [26] 母细胞的质量影响 Adamiak 等在研究小母牛不同体况与不同饲喂水平和饲粮不同组成对卵母细胞质量的影响时, 通过考察体外受精胚胎培养等方法评价卵 [27] 母细胞的质量 Wu 等为了比较生长成熟系统和传统的成熟体系在支持小卵泡卵母细胞的胞质发育上的能力差异, 观测了孤雌发育和体外授精胚胎在附植前的发育情况, 评估了电激活和授精 24h 和 72h 的 2 细胞期和 8 细胞期的卵裂率, 培养 7d 测定囊胚率从而比较生长成熟系统和传统的成熟体系在体外培养卵母细胞质量的差异可见, 尽管 IVF 体外胚胎培养评定要耗费更多时间和人力物力去检验卵母细胞质量, 相对快速评定有一定的滞后性, 但上述评定方法体现了卵母细胞进一步发育的能力, 是卵母细胞质量高低最直观的反应, 是评价卵母细胞质量最直接的方法 3 侵袭性技术对卵母细胞质量的评定不同发育阶段卵母细胞内的生化变化是建立侵袭性评定技术的基础尽管侵袭性评定技术对卵母细胞造成不可逆损伤, 但由于测定指标的可量化性准确性和客观性, 仍不失为一种有效的评定手段 3.1 ATP 含量测定法 ATP( 三磷酸腺苷 ) 由线粒体产生, 除为机体提供能量外, 其功能还包括维持细胞活力, 细胞内环境的稳态以及调控细胞存活等 [28] 因而,ATP 的含量在一定 [29] 程度上能有效反映整个细胞的活力 Catherine 等在评价由绒毛膜促性腺激素重复刺激后的小鼠的卵母细胞质量时, 通过测定不同时期的 ATP 含量来评价卵 [30] 母细胞质量 Tiziana 等深入论述了 ATP 与猪卵母细胞活力的关系也即卵母细胞质量间的关系, 并通过测定 ATP 的含量反映卵母细胞发育的成熟度该研究发现从猪卵巢中收集的卵母细胞未经成熟培养时 ATP 含量为 1.21±0.1pmol/ 卵母细胞, 而成熟培养后每个卵母细胞的 ATP 含量可达 3.60±0.51pmol, 差异达极显著水平说明通过监测 ATP 含量的变化可有效反应该阶段的卵母细胞质量 3.2 GSH 含量评价方法谷胱甘肽 (GSH) 在卵母细胞中的主要功能是参与抗氧化作用和抵抗活性氧 (reactiveoxygenspecies, ROS) 的毒害 [31], 维持减数分裂纺锤体的形态, 并且在胞核和线粒体周围 GSH 浓度较高, 可保护 DNA 免受氧自由基的损害, 从而起到保护卵母细胞的作用卵母细胞胞质的成熟度可以通过细胞内 GSH 含 [32] 量来判断研究显示体内成熟的猪卵母细胞中 GSH 浓度为 36.26pmol/oocyte [33], 远高于体外成熟卵母细胞的 GSH 浓度这种差异可能的原因是体内外环境氧气含量差异大, 雌性生殖道中氧气浓度仅相当于体外成熟液中的 1/3, 体外成熟过程中, 卵母细胞动员内部 GSH 来抵抗氧化作用的伤害, 导致 GSH 的浓度急剧降低, 并显著低于体内成熟卵母细胞的 GSH 浓度牛卵母细胞 IVM 过程中低氧压可以降低卵母细胞内 H 2 O 2 的浓度, 这有助于降低 ROS 而提高卵母细胞发育的能力 [34] 在成熟液中添加 1.00mmol/L 的 GSH, 对于提高性未成熟山羊卵母细胞成熟率非常有效 [35] 这些研究表明, 低氧或添加 GSH 有利于卵母细胞的发育成熟,GSH 可以抵抗 ROS 的毒害作用而保护卵母细胞因而细胞内 GSH 的浓度反映细胞质成熟的程度, 可以作为卵母细胞细胞质成熟程度的一个特征性的指标 [36,37] 3.3 CyclinB 蛋白检测法 CyclinB 又称周期素 B 是减数分裂成熟过程中最

2008,28(7) 徐盛玉等 : 卵母细胞质量评定的方法探讨 119 重要的蛋白之一, 它的合成和降解对于卵母细胞减数分裂的连续性是必须的 CyclinB 蛋白的含量是成熟促进因子 (MPF) 活化的一个首要限制性因子 [38,39] MPF 是调节细胞周期进程重要的蛋白激酶,MPF 启动细胞由 G 2 期进入 M 期 [40], 在卵母细胞减数分裂过程中起中心调控作用 Sun 等 [41]

4 2008,28(7) 徐盛玉等 : 卵母细胞质量评定的方法探讨 119 重要的蛋白之一, 它的合成和降解对于卵母细胞减数分裂的连续性是必须的 CyclinB 蛋白的含量是成熟促进因子 (MPF) 活化的一个首要限制性因子 [38,39] MPF 是调节细胞周期进程重要的蛋白激酶,MPF 启动细胞由 G 2 期进入 M 期 [40], 在卵母细胞减数分裂过程中起中心调控作用 Sun 等 [41] [42] [27] Jese 等和 Wu 等的研究分别考察了不同处理卵母细胞 cyclinb 的表达量, 通过 Western blot 和光密度分析, 表明 CyclinB 的表达量可以作为考察卵母细胞胞质成熟的有效指标 3.4 线粒体和细胞质的区室化观测法线粒体在细胞代谢中起主导作用, 其形态数量及分布的变化与细胞的代谢水平增殖及分化密切相关卵母细胞成熟时线粒体由皮质转向胞质中央区扩散, 有利于卵母细胞成熟过程中能量的利用 [4] 因而线粒体的形态数量及分布可以作为评定卵母细胞胞质成熟度的依据细胞质的区室化作用同样被认为是协调胞核和胞质成熟的重要因素 [43] 线粒体的活性和在胞质中的分布可作为胞质区室化的标记, 是卵母细胞成熟变化特征的众多标志之一 [44] 多数物种包括小白鼠苍鼠牛和猪线粒体的分布形式和代谢活力在卵母细胞成熟过程中均在不断变化胞质中由微管网络介导的线粒体迁移运动过程对于卵母细胞体外成熟条件下获得完整的发育能力是必需的图 1 是在激光共聚焦显微镜下观察到的猪卵母细胞线粒体经荧光染色后的图像, 可见胞质中由微管网络介导的线粒体迁移运动 [45] 可见, 通过卵母细胞的荧光染色并和共聚焦显微镜结合观察线粒体微管驱动蛋白 (kinesines) 的分布可反映卵母细胞胞质区室化的程度并能以此评定卵母细胞的质量 3.5 基因表达差异法哺乳动物早期胚胎的发育完全依赖卵子发生时期合成的母源核糖核酸 (mrna) 和蛋白的驱动母源信息发挥作用的时间长短因动物种类而存在差异哺乳动物母源 / 胚胎信息转换 (MET) 发生可以早到 2 细胞期的后期, 如小白鼠, 晚一些的如猪在 4 细胞期, 人在 4 到 8 细胞期, 兔在 8 细胞期 [46] 由此我们可以推断, 未受精之前的卵母细胞储存的 mrna 含量将直接影响胚胎基因组具有完全的转录活性之前的早期胚胎的发育研究发现体外成熟过程中牛卵丘卵母细胞复合体 (COCs) 的 FSHr 的表达发生变化, 推测它可能是显示图 1 猪卵母细胞结构线粒体 ( 红 ), 微管 ( 绿 ), 驱动蛋白 ( 紫红 ), 脱氧核糖核酸 ( 蓝 ) 荧光染色 Fig1 Pigoocytesstainedformitochondria(red), microtubules(green),kinesines(magenta), anddeoxyribonucleicacid(blue) LeftOocyteswithlowdevelopmentalcompetencedisplayaveryweak stainingthatisconfinedtothecorticalarea.theunevendistribution wilprobablycauseincorectcompartmentalisationoftheooplasm. Right:oocyteswithhighdevelopmentalcompetenceshow auniform distributionofcytoplasmicorganeleswithahomogeneouslocalisationof themitochondriathroughouttheooplasm(originalmagnification400 ) 卵母细胞发育能力的一种标志成熟培养 0~6h 时, FSHrmRNA 达最高峰, 接着下降在成熟培养 6~24h 的过程中 LHrmRNA 的相对量没有改变但在质量较差的 COCs 中,FSHrmRNAs 和 LHrmRNAs 的水平均降低 [47] 提示监测 FSHrmRNAs 和 LHrmRNAs 的含量可以对卵母细胞质量进行评估 P34 cdc2 蛋白对 MPF 激活有重要作用 G2/M 转变期 P34 cdc2 蛋白被激活, 使 P34 cdc2 的 14Thr 和 15Tyr 位点发生去磷酸化,MPF 被激活, 促进 G2/M 转变 P34 cdc2 基因的表达直接影响 P34 cdc2 蛋白的含量进而影响卵母细胞 G2/M 的转变 [40] 因而,P34 cdc2 mrna 的差量表达可以表征该阶 [48] 段的卵母细胞质量 Claude 等研究发现在牛的卵母细胞中 P34 cdc2 mrna 的相对表达量在成熟卵母细胞中显著的高于未成熟的卵母细胞可见卵母细胞中特定阶段特定物质 FSHr 及 LHr 和 P34 cdc2 等的 mrna 表达量的差异可以表征卵母细胞在该阶段的质量 4 小结非侵袭性方法以不损伤细胞为目的, 因而不会对细胞的进一步发育造成不利影响, 非常适用于辅助生殖技术侵袭性技术建立在细胞的生化变化基础上, 主要以测定细胞内有关物质的变化为手段, 用于测定后的细胞不再具有进一步发育的能力, 但测定结果具有可量化性

5 120 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 准确性和客观性, 适用的范围更加的广泛参考文献 [1]SunQY,QinPC.Studyonultrastructureofbovineoocyte development. JournalofShandong AgriculturalUniversity, 1989,4:9~16 [2]TanJH,SunQY,YangZM,etal.Ultrastructuralstudieson thegoatoogenesis.actaanatomicasinica,1992,23:106~ 110 [3]FairT,HulshofSC,HytelJP,etal.Ultrastructureinbovine primordialtoearlytertiaryfolicles.anatembryol,1997,195: 327~365 [4]AseyR J.HytelP,GreveT,etal.Oocytemorphologyin dominantandsubordinatefolicles.molreproddev,1994,37: 335~344 [5]GreewaldGS.Isolationandpreliminarycharacterizationofpig primordialfolicles.jreprodfert,1989,87:561~571 [6]GronD G.Finestructureofthesheepoocyteduringantral folicledevelopment.reprodfert,1980,59:125~132 [7] LiY L,Qin P C. Ultrastructuralstudieson the oocyte developmentofswineovaries.actaveterinariaetzootechnica Sinica,1985,16:73~82 [8]SunQY,QinPC.Changesinthenucleusofthedeveloping bovineoocyte.jnortheastagriculturecolege,1990,21:234 ~248 [9]CrozetN,MotlikJ,SzolosiD.Nucleolarfinestructureand RNAsynthesisinporcineoocytesduringtheearlystagesof antralfolicles.biolcel,1981,41:35~42 [10]MotlikJ.Meiotlicinvitroofpigoocyteisolatedfromearlyantral folicles.jreprodfertil,1984,72:323~328 [11]CrozetN,KankaJ,MotlikJ,etal.Nucleolarfinestructure andrna synthesisin bovineoocytefrom antralfolicles. GameteRes,1986,14:65~73 [12]HuangBD,HuJH,LiQ W,etal.Theresearchonthe relationbetweenweightofovaryandquantityoftheporcine oocytes.journalofnorthwestsci TechUnivofAgrandFor (NatSci,Ed),2005,33(8):12~15 [13]Georgios,Vatzias,DanielR H.Efectsofporcinefolicular fluid and oviduct conditioned media on maturation and fertilizationofporcineoocytesinvitro.biologyofreproduction, 1999,60:42~48 [14]MarchalR,VigneronC,PereauC,etal.Efectoffolicular sizeon meiotic and developmentalcompetence ofporcine oocytes.theriogenology,2002,57:1523~1532 [15]KrisherRL.Theefectofoocytequalityondevelopment.J AnimSci,2004,82(ESuppl):14~23 [16] Xia P. Intracytoplasmic sperm injection: corelation of oocytegradebased on polarbody, periviteline space and cytoplasmic inclusions with fertilization rate and embryo quality.humreprod,1997,12(8):1750~1755 [17]EbnerT,YamanC,MoserM,eta1.Prognosticvalueoffirst polarbodymorphologyonfertilizationrateandembryoqualityin intracytoplasmicsperminjection.humreprod, (2): 427~430 [18]ZouSH,WuRY,LiFL,etal.TheimpactofMIoocyte morphologyontheoutcomeofintracytoplasmicsperminjection. JournalofReproductiveMedicine.2004,13(5):266~269 [19]ZhuL,ChenSL,XingFQ.Therelationshipbetweenspindles andhumanoocytesquality.chinesejournalofobstetricsand Gynecology.2005,40(4):275~276 [20]WangW H,MengL,HacketR J,etal.Developmental abilityofhumanoocyteswithorwithoutbirefringentspindles imagedbypolscopebeforeinsemination.hum Reprod.2001, 16:1464~1468 [21]WangM K,LiuJL,LiGP,etal.Sucrosepretreatmentfor enucleation:aneficientandnon damagemethodforremoving thespindleofthemousemioocyte.mol.reprod,2001,58: 432~436 [22]WangMK,LianL,ZhuZY,etal.Progresontheestimation ofthequalityofoocytes,zygotesandearlyembryos.journalof ReproductiveMedicine,2002,6,11(3):171~175 [23]WangMK,ChenDY,LiuJL,eta1.Invitrofertilizationof mouseoocytestransferofmetaphase Ichromosomesresultsin livebirths.zygote,2001,9(1):14~19 [24]ZhouJB,WuYG,HanD,etal.Efectsofspermandoocyte qualitycontrolonintracytoplasmicsperm injection(icsi)in goats.actabiologiaeexperimentalissinica,2004,37(5): 367~374 [25]Grazul BilskaA T,BorowczykE A,EvoniukW J,etal. Efectsofovernutritionandundernutritiononinvitrofertilization (IVF) andearlyembryonicdevelopmentinsheephetinger rsearchextensioncenter,47 th annyalsheepandbeefday,north DakotaStateUniversity,2006:56~66 [26]AdamiakSJ,MackieK,WatRG,etal.Impactofnutrition onoocytequality:cumulativeefectsofbodycompositionand diet leading to hyperinsulinemia in catle. Biology of Reproduction,2005,73:97~105 [27]WuD,QueenieC K,Cheung,etal.A growth maturation systemthatenhancesthemeioticanddevelopmentalcompetence ofporcineoocytesisolated from smalfolicles. Biologyof Reproduction,2006,75:547~554 [28]StJohnJC.ThetransmisionofmitochondrialDNAfolowing asistedreproductivetechniques. Theriogenology,2002,57 (1):109~123 [29]CatherineM H,Combeles,DavidFA.Asesmentofoocyte quality folowing repeated gonadotropin stimulation in the mouse.blologyofreproduction,2003,68:812~821 [30]TizianaA L,BreviniR,Vasena,etal.Roleofadenosine triphosphate,activemitochondria, and microtubulesin the acquisitionofdevelopmentalcompetenceofparthenogeneticaly activatedpigoocytes.biolreprod,2005,72:1218~1223

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第 30 卷第 3 期 011 年 6 月华中农业大学学报 JnaHazhngAgaUnvy V.30 N.3 Jn011,80~84 猪卵母细胞体外成熟的影响因素华再东 1 郑新民魏庆信许厚强 1 刘西梅李莉 1. 贵州大学动物科学学院 / 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 55005;. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 / 动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室, 武汉 430064