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1 浙江大学发育生物学课程生殖细胞发育范衡宇浙江大学生命科学研究院第一节 : 概论什么是生殖细胞? 生殖细胞 (germ cell) 是多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称, 包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞此术语由 A 恩格勒和 K 普兰特尔于 1897 年提出以与体细胞相区别体细胞最终都会死亡, 只有生殖细胞有延存至下代的机会物种主要依靠生殖细胞而延续和繁衍长期的自然选择使每一种生物的结构都为其生殖细胞的存活提供最好的条件年诺贝尔奖 : 通过研究卵子成熟找到细胞周期调控的关键蛋白 ( 同源重组和基因敲除小鼠 ) 年诺贝尔奖 : 试管婴儿 2012 年诺贝尔奖 : 体细胞核重编程历时三十年的人类试管婴儿实验 ( ) 英国生理学家 Rbert G. Edwards, 在 1978 年创造了第一个试管婴儿多年以来, 许多宗教领袖一直要求他停止扮演上帝 5 日本京都大学山中伸弥 (Shinya Yamanaka) 与英国发育生物学家 John Gurdon 因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献, 获得 2012 年诺贝尔生理学奖 6 1

对生命科学和人类社会贡献最大的华人生物学家第一节 : 生殖细胞的起源在很多动物类群中, 如昆虫

germ cells,gc) 并不是在生殖腺内形成, 而是在身体其他部位形成以后再迁移到生殖腺张民觉,

1938 年赴英国,1941 年获剑桥大学博士学位 1945 年赴美国, 长期担任波士顿大学教授 1947

年在世界上首次成功获得体外受精兔子为现代生殖医学和动物繁殖学奠定了理论基础, 被誉为试管婴儿之父于

genome hypothesis) 8 原始生殖细胞的起源果蝇线虫斑马鱼非洲爪蟾小鼠生殖质 (Germ

mrna 构成在卵裂过程中获得这团物质的细胞将发育为原生殖细胞这种特殊的细胞质成分被称为生殖质

由果蝇的生殖质 pole plasm 决定, 包含 Nanos 和 Vasa mrnas,

2 对生命科学和人类社会贡献最大的华人生物学家第一节 : 生殖细胞的起源在很多动物类群中, 如昆虫线虫和脊椎动物, 生殖细胞在发育很早期就与体细胞区分开来生殖细胞的前体原生殖细胞 (primordial germ cells,gc) 并不是在生殖腺内形成, 而是在身体其他部位形成以后再迁移到生殖腺张民觉, 美籍华人生殖生物学家口服避孕药的创始人之一 1908 年生于山西省岚县 1933 年毕业于清华大学心理系 1938 年赴英国,1941 年获剑桥大学博士学位 1945 年赴美国, 长期担任波士顿大学教授 1947 年在世界上首次成功实现胚胎移植, 1951 年发现精子获能的生理现象,1961 年在世界上首次成功获得体外受精兔子为现代生殖医学和动物繁殖学奠定了理论基础, 被誉为试管婴儿之父于 1990 年当选美国科学院院士, 三次获得诺贝尔奖提名 7 关于生殖细胞发育的惰性基因组假说 (inert genome hypothesis) 8 原始生殖细胞的起源果蝇线虫斑马鱼非洲爪蟾小鼠生殖质 (Germ plasm) 生殖质 : 在线虫果蝇和青蛙胚胎发育过程中, 卵子中有一团特殊的细胞质成分, 由多种蛋白质和 mrna 构成在卵裂过程中获得这团物质的细胞将发育为原生殖细胞这种特殊的细胞质成分被称为生殖质 (germ plasm) 果蝇 :GC 最早在胚胎后端形成, 称为极细胞 (pole cells) 由果蝇的生殖质 pole plasm 决定, 包含 Nanos 和 Vasa mrnas, 以及一些功能尚不清楚的非编码 RNA 线虫的生殖质 : granule 含有转录抑制因子和 RNA 结合蛋白, 如 Nanos 和 Vasa 鱼类无尾两栖类的生殖质 12 2

原始生殖细胞的起源和迁移 DC: day post coitus D: postnatal

Endocrino 2010) GCs 的迁移表明它应答于一种由生殖嵴释放的诱导因子,

并且在迁移至生殖嵴后的 1 2 天也进行有丝分裂增殖在生殖腺中,GCs 数量从受精后第

存活率并且促进其增殖 GC 的衍生物 :ES 细胞 EG 细胞 EC 细胞小鼠从 GC

5 天的小鼠卵巢中, 生殖细胞停止增殖, 进入第一次减数分裂期 Embryonal

5 天, 雄性生殖细胞阻滞在有丝分裂的 G0 或 G1 期, 出生后重新启动有丝分裂

3 原始生殖细胞的起源和迁移 DC: day post coitus D: postnatal day 原始生殖细胞的起源和迁移 (Ewen and Koopman, Mol Cell Endocrino 2010) GCs 的迁移表明它应答于一种由生殖嵴释放的诱导因子, 可能是趋化因子 CXCL12 或生长因子配体 KITL 随后,GCs 改变形态, 运动性降低并持续增殖 1 2 天, 因此在受精后第 13.5 天生殖腺中有大约个生殖细胞性腺的分化 GC 在进入减数分裂期前的存活和增殖 GC 存活和增殖对于维持正常生殖功能是必要的为了增加数量, GCs 在迁移至生殖嵴的整个过程中都在进行有丝分裂增殖, 并且在迁移至生殖嵴后的 1 2 天也进行有丝分裂增殖在生殖腺中,GCs 数量从受精后第 8.5 天的约 100 个细胞迅速增加到第 13.5 天的约个细胞, 每次倍增时间约为 16 小时 GC 数量受很多胞外生长因子蛋白质和基因的调节, 生长因子通过旁分泌和自分泌途径提高 GC 存活率并且促进其增殖 GC 的衍生物 :ES 细胞 EG 细胞 EC 细胞小鼠从 GC 到产生成熟的配子的时间表在大约受精后第 13.5 天的小鼠卵巢中, 生殖细胞停止增殖, 进入第一次减数分裂期 Embryonal carcinoma (EC) cells 在大约受精后第 13.5 天, 雄性生殖细胞阻滞在有丝分裂的 G0 或 G1 期, 出生后重新启动有丝分裂 Teratocarcinoma ( 畸胎癌 ) 在雄性中, 减数分裂在整个生命过程中持续发生, 由精原干细胞提供持续的精子发生 Embryonic germ (EG) cells: GC derived stem cells in vitro. (Bowles and Koopman, Development 2007) 3

是一种小的极性分子, 很容易扩散透过组织, 并与细胞核的 RA 受体 (RARs) 结合而发挥功能 RAR 与类视黄醇 X 受体 (RXR) 形成异二聚体 RAR RXR 异二聚体与 RA 反应元件 (RAREs) 结合来控制 RA

expressed in the male gonad (at 11.5 dpc), Cyp26b1 expression is up regulated.

5 dpc germ cells in the developing ovary enter meiosis in an anterior to posterior wave. Marker gene expression in 13.

4 是什么引起了生殖细胞的性别分化? 视黄酸 (RA) 诱导 GC 进入减数分裂生殖细胞最初的性别分化不是由它的染色体组成决定的, 而是由它所处的环境决定的有一种被普遍接受的假说解释了雄性中生殖细胞命运的决定 : 发育中的睾丸组织产生了一种减数分裂抑制因子 RA 是一种小的极性分子, 很容易扩散透过组织, 并与细胞核的 RA 受体 (RARs) 结合而发挥功能 RAR 与类视黄醇 X 受体 (RXR) 形成异二聚体 RAR RXR 异二聚体与 RA 反应元件 (RAREs) 结合来控制 RA 相关基因的表达卵巢中卵母细胞减数分裂触发的可能机制 : 1) 在发育的卵巢中, 最初的减数分裂自发地发生, 可能被分子时钟调节 2) 减数分裂由周围体细胞组织诱导发生生殖腺中的生殖细胞进入减数分裂的调节 Once Sry is expressed in the male gonad (at 11.5 dpc), Cyp26b1 expression is up regulated. CY26B1 selectively removes RA from the developing testis 13.5 dpc germ cells in the developing ovary enter meiosis in an anterior to posterior wave. Marker gene expression in 13.5 dpc mouse gonads RA 如何诱导减数分裂? RA 必须通过诱发胞质蛋白 STRA8 来触发减数分裂在 Stra8 缺失的胎鼠卵巢的生殖细胞中没有产生结合蛋白, 联会复合体没有形成, 出现了双链 DNA 损伤并且未被修复虽然现在已经有证据证明 STRA8 对于细胞进入减数分裂前期是必须的 (Baltus et al., 2006), 但该蛋白质在细胞内的功能却未知 Stra8: 生殖细胞进入减数分裂的 marker ou5f1(oct4): 未分化生殖细胞的 marker 为什么减数分裂仅限于生殖细胞? 是什么赋予了生殖细胞应答 RA 的能力? RA 信号如何用于参与减数分裂? 这些都还没有确切的结论 4

第二节 : 雄性生殖细胞发育精子发生精子发生的关键事件和时间点 : 精原干细胞的维持和增殖

人类的曲细精管总长度达到 200 300 米睾丸中的三种主要细胞类型 : 1: 雄性生殖细胞

构成曲细精管壁, 支持精子发生 3: 间质细胞 (Lydig cell): 位于曲细精管之间,

附睾 (epididymis): 精子进一步成熟和储存的场所, 由一条曲折细小的管子构成,

5 第二节 : 雄性生殖细胞发育精子发生精子发生的关键事件和时间点 : 精原干细胞的维持和增殖 (D3) 进入减数分裂 (D9) 进入减数分裂粗线期 (D21) 形成第一波精子 (D35) 列文虎克最早发现了精子 1670 年, 荷兰科学家列文虎克最早发现了精子, 他最初认为是精液中的寄生虫, 随后又认为它们是动物的种子, 里面存在一个胚胎的雏形而雌性只不过是供种子生长的土壤这就是早期胚胎学中所谓精源学说认为新生命源于父方该学说最早由古希腊哲学家亚里士多德于两千多年以前提出精子结构精子发生过程示意图 28 精子形成 (spermiogenesis) 睾丸和附睾简介睾丸 : 曲细精管 (seminiferous tubule) 是睾丸的基本结构和功能单位精子发生的场所人类的曲细精管总长度达到米睾丸中的三种主要细胞类型 : 1: 雄性生殖细胞 ( 精原细胞精母细胞精子细胞成熟精子 ) 2: 支持细胞 (Sertoli cell): 构成曲细精管壁, 支持精子发生 3: 间质细胞 (Lydig cell): 位于曲细精管之间, 分泌雄激素重点 : 1: 高尔基体形成顶体 2: 从中心体长出尾巴 3: 细胞核高度凝集附睾 (epididymis): 精子进一步成熟和储存的场所, 由一条曲折细小的管子构成, 上端连接着睾丸的曲细精管, 下端连接着输精管 (Ductus deferens) 人的附睾管长约 4 5 米附睾分成附睾头附睾体附睾尾 29 5

6 小鼠精子发生过程 Day3: 精原干细胞开始增殖 ; Day9: 开始进入减数分裂小鼠精子发生过程 ~3 week old: 第一波精母细胞减数分裂进入粗线期小鼠精子发生过程 Ddb1 conditional KO males do not make sperms Day35: 第一波精子形成 ; 7~8 week: 开始具有生殖能力 All germ cells are lost in the testis of Ddb1 f/f ;Ddx4 Cre mice 雄性不育的小鼠睾丸 Germ cell marker Sertoli cell marker 6

7 处于第一次减数分裂前期的精母细胞铺片精子发生过程中的同源重组成熟精子在附睾中贮存 Ddb1 conditional KO males do not make sperms 附睾头附睾体附睾尾第三节 : 雌性生殖细胞发育卵子发生卵子发生的关键事件 : 有丝分裂卵原细胞进入减数分裂卵母细胞完成减数分裂 ( 经典的雌性生殖细胞发育过程, 如海胆 ) 卵细胞受精合子 (zygote) 卵子发生中的关键事件原始卵泡的维持和激活卵泡的生长和排卵卵母细胞减数分裂细胞周期的调控卵母细胞纺锤体组装染色体分离和极体排放 7

8 卵泡是哺乳动物卵巢的基本功能单位哺乳动物雌性生殖细胞的发育 rimary follicle oocyte cumulus cells LH Granulosa cells Theca cells Secondary follicle 44 有丝分裂哺乳动物雌性生殖细胞的发育雌雄生殖细胞发育的比较卵原细胞卵母细胞进入减数分裂 ( 发生在胚胎发育阶段 ) ( 小鼠 :D ; 人 :5 个月 ) (12 h) 完成减数分裂卵细胞 (MII) 受精三细胞四细胞 (Day 2 evening) 二细胞胚胎 ( 二细胞阻滞 ) (Day 2 morning) 有丝分裂 ( 卵裂 ) 合子 (zygote) (Day 1) 八细胞桑葚胚囊胚着床 ( 致密化 ) (Day 4) (Day 4 23:00) (Day 3) 哺乳动物卵母细胞 GV MII MII 卵泡形成卵泡激活和卵泡闭锁 Fertilizing COCs 8

9 促性腺激素促进有腔卵泡发育 FSH ecg 原始卵泡激活 LH hcg Apoptosis (Follicle Atresia) Corpus Luteum Ovulation Luteinization 转录因子与原始卵泡维持 I3K 信号通路与原始卵泡激活 51 小鼠卵泡发育 D3: 原始卵泡形成小鼠卵泡发育 D5: 初级卵泡开始形成 9

10 研究意义 : 女性生殖力保护由于环境污染和人工化合物滥用, 青少年癌症患者的人数在逐年增加正常卵巢抗癌药物处理后原始卵泡的维持 :DDB1 青少年女性癌症患者在放化疗之后往往造成不育这是因为抗癌药物在杀灭癌细胞的同时, 在生殖细胞中造成不可修复的 DNA 损伤和细胞凋亡 WT Ddb1 cko 56 原始卵泡的维持 :DDB1 WT Ddb1 fl/fl ;Gdf9 Cre 黄体生成素诱导排卵 FSH LH EGF-like factors Oocyte-derived factors Amphiregulin Epiregulin Betacellulin In situ hybridization of Lhcgr meiotic maturation I3K 信号通路与卵泡发育卵丘扩展是哺乳动物排卵的重要环节 EGFR FSH/LH I2 I3 I2 LH or hcg RAF1 Ras Gs AC cam I3K DK1 AKT ten (in vivo) Has2, Tnfaip6, tx3, tgs2 MEK1/2 KA FOXO1 FSH, GE2 EGF-like factors (AREG) ERK1/2 Cell proliferation Cell survival (in vitro)

11 促性腺激素诱导排卵的机理促性腺激素在颗粒细胞中激活 RAS/ERK pathway EGFR FSH/LH Ras Gs AC RAF1 cam MEK1/2 KA ERK1/2 Fan et al, Science, Fan et al, Science, 2009 卵母细胞减数分裂成熟过程卵母细胞减数分裂成熟过程 Maturation Activation LH fertilization Maturation Activation GV GVBD MI AI MII AII N 2 cell Zygote Embryo GV arrest MII arrest GV GVBD MI AI MII AII N 2 cell GV arrest MII arrest ( 出生排卵 ) ( 排卵受精 ) Zygote Embryo 维持 GV 期阻滞的分子机制卵母细胞成熟的机理 65 11

12 促性腺激素诱导 GVBD 的分子机制减数分裂细胞周期的调控 : 成熟促进因子 (maturation promoting factor, MF) 68 细胞静止因子 (cytostatic factor, CSF) 维持 Nature Review 2002 MII 期阻滞 Changes in activity of MF and CSF during oocyte maturation, fertilization and cleavage ( 增井贞夫 ) While animal eggs await fertilization, their cell cycle needs to be halted. The molecule responsible for this arrest the cytostatic factor was first described in But its identity was not revealed until 1989, and even now questions remain about this elusive factor. 69 卵母细胞减数分裂 GV GVBD re MI 卵母细胞减数分裂成熟过程 Metaphase I Anaphase I Telophase I 排卵受精 Metaphase II Anaphase II Telophase II 12

13 研究意义 : 生殖细胞减数分裂缺陷与人类生殖健康自发流产的非整倍体胚胎 : 75% 以上源于卵子发生过程中染色体分离异常小鼠卵母细胞减数分裂染色体 TO2/CREST/DAI 辅助生殖治疗患者接近一半 (46.8%) 卵母细胞染色体异常唐氏综合征 45 岁,1/25 35 岁,1/350 <24 岁,1/1300 MI (4n) MII (2n) MIII (1n) Shugoshin protects centromeric Rec8 during meiosis I Cohesin 控制染色体精确分离女性年龄增长导致染色体不能精确分离 77 13

世纪生物科学研究的杰出领导者生前曾担任过中国科学院副院长山东大学副校长动物研究所所长线虫 (C.

JoAnne Richards The godmother of ovarian biology

线虫的早期胚胎发育 81 82 卵母细胞减数分裂及卵子激活 : a retelling old legend in

14 致谢 : 先生之风, 山高水长! ( ) 童第周教授, 享誉海内外的卓越的生物学家教育家 ; 中国实验胚胎学的主要奠基人,20 世纪生物科学研究的杰出领导者生前曾担任过中国科学院副院长山东大学副校长动物研究所所长线虫 (C. elegans) 的性腺发育陈大元研究员中国科学院动物研究所中国体细胞克隆动物的先驱者 rof. JoAnne Richards The godmother of ovarian biology 秦鹏春教授我国著名动物组织胚胎学专家东北农业大学生命学院的创建者杨增明教授孙青原研究员范衡宇实验室同学 80 线虫的早期胚胎发育卵母细胞减数分裂及卵子激活 : a retelling old legend in animal kingdom 蠕虫昆虫脊椎动物海胆缺失精子时, 秀丽隐杆线虫 ( C. elegans ) 的卵母细胞阻滞在减数第一次分裂前期由精子分泌的 MS 短肽激活卵母细胞成熟排卵和第一次减数分裂受精触发第二次减数分裂的恢复和有丝分裂的发生 83 14

<4D6963726F736F667420506F776572506F696E74202D2032303135D0D4B1F0BEF6B6A8D3EBC9FAD6B3CFB8B0FBB7A2C9FA205BBCE6C8DDC4A3CABD5D>

<4D6963726F736F667420506F776572506F696E74202D2032303135D0D4B1F0BEF6B6A8D3EBC9FAD6B3CFB8B0FBB7A2C9FA205BBCE6C8DDC4A3CABD5D> 性别决定与生殖细胞发育历史观点公元前 335 年,Aristotle 指出性别决定于热 (heat) 1600s/1700s, 已认识到 female 可以产生能够传递亲本性状的卵子 19 世纪末之前, 人们认为温度营养年龄等环境因素决定了性别有利于能量和营