中 国 畜 牧 兽 医 卷 -( 2: : 水牛是广西地区的优良畜种 可为人们提供丰富的乳 肉资源 但水牛繁殖力低 严重制约了水牛产业的发展 为解决这一问题 研究者们建立了一 套胚胎体外生产和胚胎移植技术 卵母细胞体外成熟技术是胚胎体外生产的基础

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1 中国畜牧兽医! " 型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析 周文婷 孙龙飞 尹 娜 杜姗姗 赵 鑫 代小丽 陆凤花 石德顺 广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 南宁 摘 要 为了探明 2 型利钠肽 2: 及其受体 在水牛卵泡中的表达模式 本研究首先采用实时荧光定量 +27 技术检测水牛卵巢中利钠肽家族主要成员 型 型 2 型利钠肽 ++2+ 及其 型 型受体 +7+7 的 &7 表达情况 然后利用免疫组化技术对水牛卵泡中 2+ 及 +7 蛋白进行定位 最后利用实时荧光定量 +27 技术检测颗粒细胞和卵丘细胞中 2+ 及 +7 的 &7 表达规律 结果显示 水牛卵巢主要表达 2+ 及 +7 且在各级卵泡中均有表达 其中 2+ 主要在壁层颗粒细胞中表达 +7 主要在卵丘细胞中表达 颗粒细胞上 2+&7 表达水平显著高于卵母细胞周围的卵丘细胞 而卵丘细胞上 +7&7 表达水平显著高于颗粒细胞 综上所述 在利钠肽主要家族成员和受体中 2+ 和 +7 在水牛卵巢中呈现强表达 2+ 主要在壁层颗粒细胞中表达 而 +7 主要在卵母细胞周围的卵丘细胞中表达 关键词 2 型利钠肽 利钠肽受体 表达分析 水牛卵泡中图分类号 文献标识码 文章编号 (*'((!'"'/("!'5"( 50%)'%04! -<)--( <!(-.'=0%- )!<0 /!! (&)!)*))-!)!!))*/!).))) +.-!. *+('"!00% : :0& :00--:0:70-.&0B--0+27)0.: :&&0&-.-% &0'-.:0& %-.00.-& :0:70-.&0B--0+27*00.0-% &-.:000-.-: %0..02+&-.:000&-.% &-.:000&. 0.0&700 %00%-.00.-%-.:%0-& &700%00&.0.-%-.: %0-%-.00.!.-&%0&-&0& %00-.-:2+&-.: 000&-.% &-.:000&.0.- %:0 收稿日期 基金项目 国家高技术研究发展计划 项目 国家自然科学基金项目 广西科学基金杰青项目 ()== 广西计生委科研项目 桂人口计生研 作者简介 周文婷 女 湖南邵阳人 硕士生 研究方向 动物胚胎工程 &-.00/0%BB& 通信作者 陆凤花 女 广西南宁人 博士 研究员 研究方向 动物胚胎工程与转基因动物 &-..%%%%& 石德顺 男 广西南宁人 博士 研究员 研究方向 动物胚胎工程与转基因动物 &-.-%0

2 中 国 畜 牧 兽 医 卷 -( 2: : 水牛是广西地区的优良畜种 可为人们提供丰富的乳 肉资源 但水牛繁殖力低 严重制约了水牛产业的发展 为解决这一问题 研究者们建立了一 套胚胎体外生产和胚胎移植技术 卵母细胞体外成熟技术是胚胎体外生产的基础 但体外成熟的卵母细胞后续发育能力远不如体内成熟的卵母细胞 这是由卵母细胞核质发育不同步造成的 2 型利钠肽 2: 是近 年才被发现的钠肽家族成员之一 研究发现其在哺乳动物卵巢中高水平表达 通过与其受体 结合抑制减数分裂恢复 的提前启动 促使体外成熟的小鼠 猪 羊的卵母细胞的细胞核与细胞质同步发育 以提高卵母细胞后续发育能力 本研究拟对 2++7 在水牛卵泡中的表达特性进行分析 以期为今后研究 2+ 对水牛卵泡及卵母细胞发育提供生物学参考 材料与方法 8 样品采集 水牛卵巢由广西南宁定点屠宰场提供 将卵巢放入盛有 生理盐水的保温瓶里 于 之内送至实验室 先用 乙醇消毒卵巢 再用生理盐水洗净备用. 主要试剂及仪器 )4 7+0&' 购自 *-8-7- 公司 */.70-%0 购自!%0 公司 2+ :+7: 均购自 )- -2/ 公司 多聚甲醛 += 二甲基亚砜 <" ) 均购自 )%&- 公司 氨丙基 乙氧基甲硅烷 +) 辣根过氧化物酶 < 显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司 链蛋白酶亲和素标记 7+ 购自!)* 公司 苏木素染液购自北京索来宝公司 *2" 青霉素 链霉素均购自 公司 胎牛血清 = ) 购自 :2.0 公司 ". 超纯水机购自 ".0 公司 +27 仪 凝胶成像系统 水平电泳仪均购自 7- 公司 超净工作台购自苏州佳德净化科技公司 荧光定量 +27 仪购自.0 :0& 公司 电子分析天平购自 "00*.0 公司 高速冷冻离心机购自 *0& 公司 实体显微镜 荧光显微镜均购自 公司 2 培养箱购自 *0& 公司 '0-7" 手动轮转式切片机购自 '0- 公司 组织自动脱水机购自湖北孝感市亚光生物公司. 实时荧光定量 引物设计与合成 参照 0- 中已公布的原牛 型 型 2 型利钠肽 ++2+ 及其受体 基因 以及 )7 的 &7 序列 用 +&0+0&0 软件设计 对引物 引物序列信息见表 引物均由生工生物工程 上海 股份有限公司合成 表 引物序列信息 '+&("(!&' 基因 引物序列 AA 产物长度 退火温度 登录号 00 +&00B00 +.0% 0-.%0&0-0 0 =2*222*** " 72222*2*2**2* =22**2*2**2*22*2**2 " 722*22**222* =22*2*222 " 72222**22 =*2*222*2** " 7*2****22* =22222****2*2*** " 7**22****222**2*2*2 )7 =*22** 7 7*22*22222*2

3 期 周文婷等 2 型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析 7 提取及 < 合成 取新鲜水牛卵巢若干 一部分用消毒过的剪刀剪成小块后放在盛有液氮的研钵中研成粉末 一部分用生理盐水洗净 然后用带有 号针头的 &' 注射器将卵 泡液抽出 参照高亚可的方法分离出颗粒细胞 并将卵泡液中卵丘 卵母细胞复合体上的卵丘细胞吹打下来 采用 */. 法提取卵巢 颗粒细胞 卵丘细胞总 7 以提取的 7 为模板反转录 知 基因 &7 的表达量显著高于 和 基因 基因 &7 的表达显著高于 基因 获得相应的 < 反转录体系 '*-. 7%%< 70&0'0.% * +&0'7!/:&0 "'?*) 70-"' 补至 ' +27 反应程序 & & 保存 +27 扩增 以 < 为模板进行 +27 扩增反应 +27 反应体系 '< 模板 ' 上 下游引物 &.' 各 ') '7( ' '+27 反应程序 预变性 & 变性 退火 个循环 用内参基因 )7 作为标准对照组 每个试验设 个重复 定量结果用 2 公式计算 试验数据使用 )+)) 分析软件进行差异显著性检验. 免疫组织化学 选取表面均匀 卵泡直径 && 的水牛卵巢 置于 多聚甲醛中 固定 用手术刀切成两半 接着再次固定 且每隔 摇晃多聚甲醛使其固定充分 然后用自动脱水机脱水 脱水完成后用石蜡包埋 修片 切片 厚度 & 再经 水浴展片后捞于经防脱处理的玻片上 石蜡切片制作完成 石蜡切片脱蜡至水化 作用 & 微波修复 *( 作用 & 以上每步作用后都采用 + ) 洗 次各 & ) 室温封闭 & 然后分别孵育适当稀释的一抗 二抗 < 显色后分色和返蓝 脱水 透明 用中性树脂封片 烘片 后镜检 结果与分析.* 及其受体!"!" 基因 &* 在水牛卵巢中的表达 用实时荧光定量 +27 对水牛卵巢中 及其受体 基因的 &7 的表达水平进行检测 结果见图 由图 可 肩标不同字母表示差异显著 肩标相同字母表示差异不显著 下同 &0-% &0.000 &0- %-000 *0 -&0-0. 图!! 和! 基因 &* 在卵巢中的表达水平 5.(2!!!'!( &*2' 图!"!" 基因 &* 在卵巢中的表达 5. (2!!" '!" ( &*2'. 蛋白在水牛卵泡中表达分析 免疫组织化学染色结果显示 2+ 和 +7 蛋白在水牛各级发育卵泡中均有表达 2+ 蛋白在各级卵泡的膜间质细胞和壁层颗粒细胞上都检测到棕黄色阳性信号 且越靠近颗粒细胞阳性信号越强 图 +7 蛋白在原始卵泡和初级卵泡中的卵泡细胞上检测到棕黄色阳性信号 在有腔卵泡中的卵丘细胞也检测到阳性信号 图 结果表明 随着卵泡发育 2+ 主要在颗粒细胞中表达 +7 主要在卵丘细胞中表达

4 *&&& 中!国!畜!牧!兽!医 )* 卷! >!原始卵泡( 2!初级卵泡( P!有腔卵泡( `!阴性对照! (! ( > C 8 " E T H 2 C 8E H P! N E]H J JT `! LH7E W ]H W XT 图 &!LM: 蛋白在水牛卵泡中的表达" 0&&c S &!N0?<./. LM:<. * / /C+ =.. P 0&&c T -" >!原始卵泡( 2!初级卵泡( P!有腔卵泡( `!阴性对照 >! C 8 " E T 2! C 8E P! N E]H J JT `! LH7E W ]H W XT 图 %!M:5! 蛋白在水牛卵泡中的表达" 0&&c S %!N0?<./. M:5!<. * / /C+ =.. P 0&&c T -"! &!LM:" M:5!85MB 在水牛颗粒 细胞 和 卵 丘 细 胞的差异表达 通过实时荧光 定 量 CPU 对 水 牛 颗 粒 细 胞 和 卵 丘 细胞中的 PLC 和 LCU0 的 8UL> 表达水平进行 检测!结果见 图 ' (& 由 图 ' ( 可 知!!:? 基 因 在 颗粒 细 胞 中 的 表 达 量 显 著 高 于 卵 丘 细 胞 "? & :&! :?D0 基 因 在 卵 丘 细 胞 中 的 表 达 量 显 著 高 于颗粒细胞"?& :&&

5 期 周文婷等 2 型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析 2+ 广泛分布在动物各组织中 如大脑 心脏 肾脏及血管等 具有维持心血管功能稳定 调控细胞 增殖及促进骨骼生长等功能 此外 许多研究表明 2+ 在调控动物生殖机能方面也有十分重要的作用 值得关注的是 近年在小鼠上研究发现 2+ 能维持小鼠卵母细胞减数分裂阻滞 2+ 主要通过与受体 +7 结合 使受体的激酶同型区域 8< 构象发生变化 使鸟苷酸环化酶激活 从而将 *+ 转化为 "+ 后激活下游信号通路发挥作 肩标不同字母表示差异显著 肩标相同字母表示差异不显著 下同 &0-% &0.000 &0-%-000 *0 -&0-0. 图 颗粒细胞 卵丘细胞中! 基因 &* 的表达水平 5.&*(2!!' "'"&(" 图 颗粒细胞 卵丘细胞中!" 基因 &* 的表达水平 5.&*(2!!"' "'"&(" 讨 论 2 型利钠肽 2+ 是继 型 型利钠肽 + + 之后第 位被发现的利钠肽家族成员 年 日本科学家 -:"- 在猪脑中发现了一个由 个氨基酸残基组成的多肽 它与 ++ 的氨基酸序列相似 具有利钠肽与受体结合所必需的空间结构 即由二硫键联结 个半胱氨酸残基的 个氨基酸组成的环状结构 亦具有和 ++ 相似的生理学效应 这个多肽被命名为 2 型利钠肽 2+ 与 + + 不同的是 2+ 终止在第 个半胱氨酸残基 没有进一步的 2 端扩展 用 --0 等在猪体外培养液中添加 2+ 处理卵丘 卵母细胞复合体 发现卵母细胞减数分 裂被抑制 卵母细胞发育能力提高 8: 等研究报道 2+ 突变不影响小鼠的交配和排卵 但是卵丘细胞扩展不充分 卵母细胞中碎片增多 胞质严重发黑退化 受精后发育在 细胞阶段停滞不前 目前 有关 2+ 的研究主要是基于以大鼠 小鼠 猪等为材料展开的 鲜有对水牛中 2+ 的研究报道 本研究应用实时荧光定量 +27 技术检测了水牛卵巢中 及其受体 +7+7 的 &7 表达 结果显示 水牛卵巢主要表达 2+ 和 +7 可以推测 2+ 参与水牛雌性生殖调控过程 随着对 2+ 结构和功能研究的不断深入 2+ 在哺乳动物繁殖性能中的作用越来越受到关注 -% 等发现 2+ 在卵巢中的表达是随着卵巢 发育和卵泡生长而增加的 )- 等发现随着卵泡的发育 卵泡中 2+ 和 +7 的 &7 表达显著 增强 2+ 蛋白水平也逐渐增加 - 等运用原位杂交技术定位了大鼠卵巢中 2+ 和 +7 结果在卵泡间质细胞和膜细胞上发现 2+ 的阳性表达 在颗粒细胞上发现 +7 阳性表达 研究显示 2+ 能像 =) 一样促进腔前卵泡 向有腔卵泡转化 促进了卵泡的成熟 结合前人的研究 推测 2+ 在水牛卵泡发育中有重要作用 本研究采用免疫组织化学技术检测了 2+ 及其受体 +7 在水牛卵巢的定位及表达情况 结果表明在水牛卵巢中 2+ 蛋白从原始卵泡开始就存在于各级发育阶段的卵泡细胞中 随着卵泡发育表达逐渐增强 且在越靠近颗粒细胞的位置表达越强 而 +7 蛋白在卵巢原始 初级卵泡中主要表达于卵泡细胞 有腔卵泡中主要表达于卵丘细胞 进一步用实时荧光定量 +27 技术检测了水牛颗粒细胞和卵丘细胞 2+ 及 +7 的 &7 表达情况 结果显示 颗粒细胞上 2+ &7 的表达显著高于卵母细胞周围的卵丘细胞 而卵丘细胞上 +7

6 中 国 畜 牧 兽 医 卷 &7 的表达显著高于颗粒细胞 这与在小鼠上的研究结果相一致 推测在水牛体内 2+ 和 +7 参与调控卵泡生长和卵母细胞发育 这可能是通过配体 受体结合激活下游信号通路来实现的 结 论本研究分析了 2+ 及其受体 +7 在水牛卵泡中的表达模式 发现在利钠肽家族主要成员和受体中 2+ 和 +7 在水牛卵巢中呈现强表达 它们随卵泡发育时期的不同而变化 其中 2+ 主要在壁层颗粒细胞中表达 而 +7 主要在卵母细胞周围的卵丘细胞中表达 本试验为进一步研究 2+ 对水牛卵泡及卵母细胞发育的影响奠定了基础 参考文献 唐善生 广西奶水牛产业发展现状与思考 E 广西农学报 陈大元 受精生物学 受精机制与生殖工程 " 第 版 北京 科学出版社 50-%E4-"0-.02: & &0-. &000&&-0&0:0-!)E )!)!! -)! =-=2 ' : &00& - -%-&0-0&&- 0&.0.0:0E)).)* )!) -%E502-E0-.02:0-000 &---00.&0-.& 000%-:0 &-0-!)E&)/ 0 高亚可 陆凤花 马 帆 等 水牛卵巢颗粒细胞的分离培养及凋亡测定 E 中国畜牧兽医 )*"-&8-% : &0& &.:00 0 -E) ))!) * :0 ).0:7 22:0-000% 0 --%& E+)! )) %+ +0' 70:)<0:< " :.%-0 & -0000%-.%E) -.-!2+--:2 ")0/0-.< &0-% :2: &00:0.-%-E )- 5-7-E :.%:--.%:E%!!) - )* ") )). 5EE 5-%= &.: % E! *-0& :0-0000:0&00 &E4.)! 8:2**4-& % -.%00-.:0&0-0-&.&-%..-00.&0 0&0-:E )!) -% ")4 )% % &-- &0-0 &0:0E/ )-420%48--&-80-.2:0-0 00& &0E") )) -=-7-E0-.: :-0 &-.:0% E) )). '008 -%")%-80-.& : &0%-.-0.E)).)* )!) 责任编辑 晋大鹏 :.--E

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